陳俊超，附俊杰，劉軍，王風(fēng)青，帖余，李麗，*

（1.四川輕化工大學(xué)生物工程學(xué)院，四川 宜賓 644000；2.固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 宜賓 644000）

丁酸梭菌（Clostridiumbutyricum）又名丁酸梭狀芽孢桿菌、酪酸梭菌，由日本千葉醫(yī)科大學(xué)的宮入近治博士于1933年首次發(fā)現(xiàn)并報告，因此，又名宮入菌[1]。丁酸梭菌是一種嚴(yán)格厭氧的革蘭氏陽性梭狀芽孢桿菌，在厭氧培養(yǎng)過程中會產(chǎn)酸產(chǎn)氣，主要存在于人和動物腸道及其糞便、污泥、天然酸奶和干酪中，具有調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、增強(qiáng)機(jī)體免疫、產(chǎn)生益生物質(zhì)等多種生理功能。丁酸梭菌具有促進(jìn)腸道有益菌生長及抑制致病菌的整腸作用，可有效提高動物血清中免疫球蛋白含量，對宿主腸道菌群歸正和改善腸道健康有重要作用[2]，其在代替抗生素防治腹瀉、腸炎等疾病方面極具潛力，對保障動物性食品質(zhì)量與安全具有重要意義。謝麗靜等[3]篩選出的一株丁酸梭菌對模擬胃腸道環(huán)境和膽鹽的耐受性較好，對志賀氏菌、大腸桿菌、沙門氏菌等9 種常見致病菌均有一定抑菌作用。丁酸梭菌不僅具有良好的益生作用和抑菌性能，其代謝產(chǎn)物的作用也逐漸受到人們的認(rèn)可，在作為食品的風(fēng)味強(qiáng)化劑、防腐劑、維生素補(bǔ)充劑等方面具有極大的應(yīng)用潛力[4]。

菌株的益生特性與菌體特性及其代謝產(chǎn)物的生理活性息息相關(guān)。目前，對丁酸梭菌的研究主要集中于菌株的篩選以及對動物生長性能和腸道疾病防治方面，利用代謝組學(xué)對其代謝產(chǎn)物的研究較少。已有研究表明，代謝組學(xué)為篩選微生物代謝產(chǎn)物提供了一種可行的方法。Liang 等[5]利用代謝組學(xué)方法對斷奶仔豬糞便進(jìn)行研究后發(fā)現(xiàn)，丁酸梭菌可影響其腸道內(nèi)微生物菌群的氨基酸類物質(zhì)的代謝。Fu 等[6]通過代謝組學(xué)成功篩選出了布拉迪酵母與釀酒酵母的胞外差異代謝物。

本研究通過一系列體外試驗(yàn)評價丁酸梭菌的益生特性，并采用非靶向代謝組學(xué)的方法對其胞外代謝物進(jìn)行分析，旨在探究其作為益生菌的應(yīng)用潛力及其代謝產(chǎn)物的生理功能與潛在應(yīng)用價值，為丁酸梭菌的進(jìn)一步研究與應(yīng)用提供一定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株

丁酸梭菌（ClostridiumbutyricumGDMCC1.676）：廣東省微生物菌種保藏中心；大腸埃希氏菌（Escherichia coliATCC25922）、鼠傷寒沙門氏菌（SalmonellatyphimuriumATCC14028）、福氏志賀氏菌（ShigellafexneriCMCC（B）51572）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureusATCC6538）、單核細(xì)胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenesATCC19115）：上海魯微科技有限公司。

1.2 試劑

蛋白胨、葡萄糖、酵母浸粉、牛肉浸粉：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；乙酸鈉、L-半胱氨酸鹽酸鹽、氯仿：成都市科隆化學(xué)品有限公司；豬膽鹽：北京索萊寶科技有限公司；甲醇、乙腈、氨水（色譜級）：上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、胰胨-亞硫酸鹽-環(huán)絲氨酸瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基：青島高科園海博生物技術(shù)有限公司。除特殊說明外所有試劑均為分析純。

1.3 培養(yǎng)基

強(qiáng)化梭菌培養(yǎng)基（reinforced clostridial medium，RCM）[7]：牛肉浸粉10.0 g/L、蛋白胨10.0 g/L、酵母浸粉3.0 g/L、可溶性淀粉1.0 g/L、葡萄糖5.0 g/L、乙酸鈉3.0 g/L、氯化鈉5.0 g/L、L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g/L，pH6.8，121 ℃滅菌15 min；梭菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)基：按照胰胨-亞硫酸鹽-環(huán)絲氨酸瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基產(chǎn)品使用說明配制，并添加過濾除菌的0.5%D-環(huán)絲氨酸溶液，混勻；指示菌培養(yǎng)基：按照營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基產(chǎn)品使用說明進(jìn)行配制。

1.4 儀器與設(shè)備

立式壓力滅菌器（YXQ-75SII）、厭氧培養(yǎng)箱（BYQX-I）：上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（RE-52AA）：上海亞榮生化儀器廠；紫外可見分光光度計(jì)（T6 新世紀(jì)）：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；高速冷凍離心機(jī)（TGL-23）：四川蜀科儀器有限公司；自動電位滴定儀（AT-710）：日本KEM 公司；超高效液相色譜儀（1290UHPLC）：美國Agilent 公司；高分辨質(zhì)譜儀（Q Exactive Focus）：美國Thermo Fisher Scientific 公司。

1.5 方法

1.5.1 生長曲線

以2%（體積分?jǐn)?shù)）的接種量將活化后的菌株接種于RCM 液體培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，每間隔2 h取樣測其OD600值，以時間為橫坐標(biāo)，OD600值為縱坐標(biāo)繪制生長曲線。

1.5.2 體外益生特性研究

1.5.2.1 人工胃液與人工腸液耐受性

參考亓秀曄等[8]的方法并稍作修改。菌株活化后按2%（體積分?jǐn)?shù)）的接種量接種到RCM 培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，按所參考方法進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，采用梯度稀釋平板法進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)并計(jì)算存活率（X，%），其計(jì)算公式如下。

式中：A為處理后活菌數(shù)；B為處理前活菌數(shù)。

1.5.2.2 膽鹽耐受性

將活化后的菌液按2%（體積分?jǐn)?shù)）的接種量接入膽鹽濃度分別為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%和0.6%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的RCM 液體培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，測定各菌液的OD600值[3]，以空白培養(yǎng)基調(diào)零。

1.5.2.3 疏水性與自聚集性

菌株經(jīng)活化后接種于RCM 液體培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)至OD600=0.8，3 000 r/min 離心10 min，磷酸鹽緩沖液洗滌2 次后重懸，調(diào)整菌懸液OD600=0.8 備用，以磷酸鹽緩沖液調(diào)零。

1）疏水性：參考Diana 等[9]的方法并稍作修改。將3 mL 菌懸液與0.75 mL 氯仿輕輕渦旋混合2 min，37 ℃水浴靜置1 h 后，用紫外可見分光光度計(jì)測量水相在600 nm 處的吸光度。疏水率（Y，%）計(jì)算公式如下。

式中：Ai為初始時細(xì)胞懸浮液的吸光度；Af為試驗(yàn)結(jié)束時水相的吸光度。

2）自聚集性：將菌懸液于37 ℃水浴12 h，每隔2 h取一次樣，在600 nm 下用紫外可見分光光度計(jì)測定不搖動細(xì)胞懸液的吸光度[10]。自聚集率（Z，%）計(jì)算公式如下。

式中：AT為不同時間的吸光度；A0為0 h 時的吸光度。

1.5.2.4 發(fā)酵上清液抑菌活性測定

指示菌菌液的制備：將5 株指示菌從斜面接種到指示菌液體培養(yǎng)基中，于37 ℃，180 r/min 培養(yǎng)1 d，將指示菌液稀釋至106CFU/mL 備用。

發(fā)酵上清液的制備：菌株活化后以2%（體積分?jǐn)?shù)）的接種量接種于RCM 培養(yǎng)基，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，將發(fā)酵液離心（8 000 r/min，10 min）棄去菌體，經(jīng)0.22 μm 醋酸纖維素微孔濾膜進(jìn)一步除菌后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至原體積的1/3 得到發(fā)酵上清液，4 ℃保藏備用。

抑菌試驗(yàn)：采用雙層瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行抑菌試驗(yàn)[11]。抑菌圈直徑越大說明抑菌活性越強(qiáng)。

1）對不同致病菌的抑菌活性

將發(fā)酵上清液用于對5 株致病菌的抑菌試驗(yàn)，未接種的發(fā)酵液經(jīng)上述方法濃縮至原體積的1/3 后作對照，將受到抑制作用最強(qiáng)的致病菌作為后續(xù)抑菌試驗(yàn)的指示菌。

2）酸堿穩(wěn)定性

用1 mol/L 的HCl 和NaOH 溶液將上清液的pH值分別調(diào)至2、3、4、5、6、7、8、9、10，于4 ℃冰箱放置12 h后調(diào)回pH4.6。通過抑菌試驗(yàn)測定經(jīng)酸堿處理后上清液的抑菌活性，以未經(jīng)酸堿處理的發(fā)酵上清液作為對照。

1.5.2.5 抑菌動力學(xué)曲線

按1.5.1 進(jìn)行接種培養(yǎng)，每間隔2 h 取樣做抑菌試驗(yàn)，測定發(fā)酵上清液對福氏志賀氏菌的抑制作用，未接種的發(fā)酵液作對照，確定提取代謝物的最佳時間。

1.5.3 胞外代謝物研究

1.5.3.1 代謝物提取

以2%（體積分?jǐn)?shù)）的接種量將活化后菌液接入RCM 培養(yǎng)基，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h 后離心（8 000 r/min，10 min），上清液經(jīng)0.22 μm 醋酸纖維素微孔濾膜除菌作為試驗(yàn)組樣品，以空白培養(yǎng)基作為對照組樣品。樣品代謝物的提取參照Cai 等[12]提出的方法，移取100 μL 樣品至離心管中，加入400 μL 提取液[甲醇∶乙腈=1∶1（體積比），含同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)混合物]，渦旋混勻30 s；超聲10 min（冰水?。?；-40 ℃靜置1 h；將樣品4 ℃，12 000 r/min 離心15 min；取上清于進(jìn)樣瓶中上機(jī)進(jìn)行超高效液相色譜-四極桿靜電場軌道阱質(zhì)譜（ultra-high performance liquid chromatography and fourstage pole electrostatic field orbital trap mass spectrometry，UHPLC-QE-MS）檢測；另取等量所有樣品上清液混合成質(zhì)控（quality control，QC）樣本上機(jī)檢測。

1.5.3.2 UHPLC-QE-MS 檢測

樣品檢測方法參考Wang 等[13]提出的方法，使用超高效液相色譜儀，通過Waters ACQUITY UPLC BEH Amide（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）液相色譜柱對目標(biāo)化合物進(jìn)行色譜分離。液相色譜A 相為水相，含25 mmol/L乙酸銨和25 mmol/L 氨水，B 相為乙腈。流動相流速：0.5 mL/min，柱溫：25 ℃，樣品盤溫度：4 ℃，進(jìn)樣體積：3 μL。

1.6 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 26.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和顯著性分析；利用Origin Pro 2018C 軟件進(jìn)行繪圖；采用SIMCA-P V16.0.2 軟件進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析。以上試驗(yàn)都進(jìn)行3 次重復(fù)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

采用正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）的變量投影重要度（variable importance in the projection，VIP），結(jié)合Studentt檢驗(yàn)的P值以及差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）進(jìn)行差異代謝物的篩選。

2 結(jié)果與分析

2.1 生長曲線

丁酸梭菌的生長曲線見圖1。

圖1 丁酸梭菌的生長曲線Fig.1 Growth curve of Clostridium butyricum

從圖1 中可以看出，丁酸梭菌在培養(yǎng)2 h 后開始呈對數(shù)生長，8 h 后進(jìn)入穩(wěn)定期，說明丁酸梭菌的生長繁殖速度較快，菌體內(nèi)代謝反應(yīng)較為活躍，并且在穩(wěn)定期內(nèi)OD600保持相對穩(wěn)定，所以可以將發(fā)酵時間設(shè)置為24 h。

2.2 體外益生特性

2.2.1 人工胃液與人工腸液的耐受性

丁酸梭菌經(jīng)人工胃腸液處理后的存活率見表1。

表1 丁酸梭菌經(jīng)人工胃腸液處理后的存活率Table 1 Survival rate of Clostridium butyricum treated with artificial gastrointestinal fluid%

由表1 可知，丁酸梭菌經(jīng)人工胃液處理1.5 h 后存活率顯著降低（P＜0.05），經(jīng)人工腸液處理1.5 h 后存活率顯著降低（P＜0.05），但經(jīng)兩者處理后，2.5 h 內(nèi)的存活率都在90%以上。這與謝麗靜等[3]、亓秀曄等[8]、王騰浩等[14]的研究結(jié)果基本一致。胃腸道環(huán)境是益生菌發(fā)揮益生作用的基礎(chǔ)，試驗(yàn)結(jié)果說明丁酸梭菌對模擬胃腸道環(huán)境具有很好的耐受性，有作為益生菌制劑的潛力。

2.2.2 膽鹽耐受性

膽鹽對丁酸梭菌生長的影響見圖2。

圖2 膽鹽對丁酸梭菌生長的影響Fig.2 Effect of bile salts on Clostridium butyricum growth

從圖2 中可以看出，丁酸梭菌濃度在0.3%以內(nèi)其生長幾乎不受膽鹽影響，膽鹽濃度過高便會顯著抑制其生長（P＜0.05），但對0.4%的膽鹽濃度仍有較好的耐受性，這與劉磊等[15]研究結(jié)果一致。膽鹽對益生菌的脅迫作用不利于其在腸道的定植，而人體和動物小腸內(nèi)膽鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)一般在0.03%～0.30%[16]。說明丁酸梭菌具有良好的膽鹽耐受性并有利于在腸道的定植。

2.2.3 疏水性與自聚集性

丁酸梭菌的自聚集率見圖3。

圖3 丁酸梭菌的自聚集率Fig.3 Auto-aggregation rate of Clostridium butyricum

疏水性和自聚集性影響益生菌在腸道的定植，逐漸成為評估益生菌體外益生特性的參考指標(biāo)，疏水率和自聚集率較高的菌株通常能較好地定植于腸道[17]。本研究中丁酸梭菌的疏水率為（33.33±0.23）%，這與Sch?nherr-Hellec 等[18]對26 株丁酸梭菌的疏水性測試的平均值（34.6%）相近。從圖3 中可以看出，丁酸梭菌的自聚集率隨時間的延長不斷增加且差異顯著（P＜0.05），在12 h 時可達(dá)（37.70±0.75）%。以上結(jié)果表明，丁酸梭菌具有較好的疏水性和自聚集性，具備一定的黏附性和自聚集能力。有研究顯示，菌株疏水性和自聚集能力可能與表面胞外多糖、S 層蛋白、脂磷壁酸等物質(zhì)有關(guān)[19]。

2.2.4 抑菌活性測定

2.2.4.1 對常見致病菌的抑制作用

發(fā)酵上清液對常見致病菌的抑制作用見圖4、圖5。

圖4 發(fā)酵上清液的抑菌活性比較Fig.4 Comparison of antibacterial activity of fermentation supernatant

圖5 發(fā)酵上清液的抑菌活性Fig.5 Antibacterial activity of fermentation supernatant

從圖4、圖5 中可以看出，發(fā)酵上清液對5 種指示菌的抑制作用各不相同，其對福氏志賀氏菌的抑制作用最強(qiáng)（抑菌圈直徑為12.60 mm）且差異顯著（P＜0.05），對大腸埃希氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌各具有一定的抑制作用，這與謝麗靜等[3]、陳秋紅等[20]的研究結(jié)果一致。對金黃色葡萄球菌無抑制作用，這與賈麗楠等[21]的研究結(jié)果不同。推測是由于不同菌株的代謝特性不同，產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)有所差異，從而導(dǎo)致各自的抑菌能力不盡相同。根據(jù)結(jié)果選擇福氏志賀氏菌作為后續(xù)抑菌試驗(yàn)的指示菌。

2.2.4.2 發(fā)酵上清液的酸堿穩(wěn)定性

發(fā)酵上清液的酸堿穩(wěn)定性見圖6。

圖6 發(fā)酵上清液的酸堿穩(wěn)定性Fig.6 Acid-base stability of fermentation supernatant

為探究環(huán)境pH 值變化對胞外產(chǎn)物抑菌活性的影響，改變發(fā)酵上清液pH 值并保持12 h 后再調(diào)回pH值為4.6，比較其對福氏志賀氏菌的抑制作用。從圖6中可以看出，上清液經(jīng)調(diào)整pH 值為5～7 處理后抑菌圈直徑較對照組無顯著變化（P＞0.05），過酸或過堿處理對抑菌活性有顯著影響（P＜0.05），但pH2、pH10 處理后仍保留有較好的抑菌活性，說明胞外產(chǎn)物的酸堿穩(wěn)定性較強(qiáng)，在使用過程中能適應(yīng)一定外界環(huán)境pH值的變化，得以保持良好的抑菌活性。

2.2.4.3 抑菌動力學(xué)曲線

抑菌動力學(xué)曲線見圖7。

圖7 抑菌動力學(xué)曲線Fig.7 Bacteriostasis kinetic curve

從圖7 中可以看出，上清液的抑菌動力學(xué)曲線與生長曲線趨勢大致一樣，說明丁酸梭菌在生長繁殖過程中產(chǎn)生了大量胞外抑菌活性物質(zhì)，16 h 后抑菌圈直徑并無顯著變化（P＞0.05），說明穩(wěn)定期內(nèi)抑菌產(chǎn)物濃度趨于穩(wěn)定，為使獲得的胞外代謝物濃度基本穩(wěn)定，確定代謝物提取的時間為24 h。

2.3 丁酸梭菌胞外代謝物研究

2.3.1 OPLS-DA 分析結(jié)果

OPLS-DA 得分圖見圖8。

圖8 OPLS-DA 得分圖Fig.8 OPLS-DA score plot

從圖8 中可以看出，上清液（D1～D5）與空白培養(yǎng)基（DK1～DK5）在正離子和負(fù)離子模式下均能明顯分開，均處在95%置信區(qū)間內(nèi)，說明樣品間的物質(zhì)存在明顯差異。正離子模式下的RY2=0.999，Q2=0.997；負(fù)離子模式下的RY2=1，Q2=0.999，RY2代表模型對Y 變量的解釋性，Q2代表模型的可預(yù)測性，RY2非常接近1，說明建立的模型符合樣本數(shù)據(jù)的真實(shí)情況。

2.3.2 活性代謝產(chǎn)物的鑒定與篩選

丁酸梭菌胞外差異代謝物結(jié)果見表2。

表2 丁酸梭菌胞外差異代謝物Table 2 Differential extracellular metabolites of Clostridium butyricum

如表2所示，本研究根據(jù)VIP＞1、P＜0.05 和FC＞2的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，共得到31 種胞外差異代謝物，主要為有機(jī)酸類12 種、氨基酸類7 種、核苷類5 種，其他化合物7 種。

2.3.3 生物活性代謝物分析

丁酸梭菌的胞外代謝物中含有許多活性物質(zhì)，已有文獻(xiàn)表明它們在防治病、抗菌、食品添加劑等方面均有一定的應(yīng)用價值[22-23]。

由表2 可知，丁酸梭菌產(chǎn)生了較多的有機(jī)酸類、氨基酸類和核苷類物質(zhì)。從代謝物差異倍數(shù)（FC）值可知，發(fā)酵上清液中丁酸和（R）-3-羥基丁酸的相對含量分別是空白培養(yǎng)基的175.88 倍和30.61 倍，丁酸具有獨(dú)特氣味，可作為食品風(fēng)味強(qiáng)化劑[22]，也可作為供能物質(zhì)促進(jìn)腸道修復(fù)[4]，（R）-3-羥基丁酸可能也具有這樣的供能修復(fù)作用[23]。其余酸類物質(zhì)的相對含量為空白培養(yǎng)基的2～122 倍，其中差異倍數(shù)較高的幾種物質(zhì)，如2-羥基-4-甲基戊酸（122 倍）、苯乳酸（47 倍）、辛酰甘氨酸（45 倍）、檸檬酸（11 倍）等均具有一定的抑制食源性致病菌的作用[24-27]。由此可見，丁酸梭菌的抑菌能力可能是這些代謝物的綜合作用的結(jié)果。此外，差異倍數(shù)較低的一些代謝物也具有一定的作用，如L-天冬氨酸可作為營養(yǎng)增補(bǔ)劑[28]，D-丙氨酸用于食品風(fēng)味調(diào)節(jié)劑[29]，2'-O-甲基腺苷具有獨(dú)特的降血壓活性[30]等。

3 結(jié)論

通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，丁酸梭菌的生長繁殖速度較快，可耐受人工胃液、人工腸液至少2.5 h 和0.4%以內(nèi)的膽鹽，疏水性和自聚集性較好；發(fā)酵上清液具有良好的酸堿穩(wěn)定性，并且對福氏志賀氏菌有較好的抑制作用，代謝物的積累在16 h 后趨于穩(wěn)定；經(jīng)代謝組學(xué)分析得到其胞外差異性代謝物主要為有機(jī)酸類、氨基酸類、核苷類和其他物質(zhì)，部分活性代謝產(chǎn)物可在腸道疾病治療、食品防腐、食品風(fēng)味強(qiáng)化、促進(jìn)機(jī)體健康等方面發(fā)揮重要作用。丁酸梭菌具有作為微生態(tài)制劑的潛力，利用代謝組學(xué)可初步探究其活性代謝產(chǎn)物，有助于分析代謝物與其生物學(xué)功能之間的潛在關(guān)系。