李潮俊，張玉，陳凱，康明，梁曉峰*

（1．西南科技大學(xué)材料與化學(xué)學(xué)院，四川 綿陽(yáng) 621010；2．四川中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校川西北中藥材資源研究與開發(fā)利用實(shí)驗(yàn)室，綿陽(yáng)市中藥資源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 綿陽(yáng) 621010）

竹葉花椒（ZanthoxylumarmatumDC.）與花椒同為蕓香科，是花椒亞屬植物，其葉狹長(zhǎng)，枝葉垂散形似藤蔓，又得名藤椒[1-2]，其麻香獨(dú)特，同時(shí)具有溫中止痛、殺蟲止癢的功效，可用于食品和醫(yī)藥行業(yè)[3-5]。竹葉花椒中含有酰胺、生物堿、木質(zhì)素、揮發(fā)油、黃酮等多種活性物質(zhì)[6-7]，其中竹葉花椒揮發(fā)油不僅為竹葉花椒提供了獨(dú)特風(fēng)味，還具有抗炎鎮(zhèn)痛、抑菌殺蟲、抗氧化、抗腫瘤等多種生物活性[8-12]。開展竹葉花椒果皮中揮發(fā)油提取方法的研究以提高揮發(fā)油提取率，對(duì)開發(fā)竹葉花椒食用價(jià)值、提升竹葉花椒經(jīng)濟(jì)效益具有實(shí)際意義。

揮發(fā)油的提取方法有水蒸氣蒸餾法、溶劑提取法、微波輔助提取法等[13-14]，其中水蒸氣蒸餾法加熱溫度高，易分解揮發(fā)油中的熱不穩(wěn)定性成分且提取效率低[15]；溶劑提取法會(huì)導(dǎo)致?lián)]發(fā)油中有溶劑殘留，且造成環(huán)境污染[16]；微波輔助提取法可能導(dǎo)致?lián)]發(fā)油成分發(fā)生變化[17]。超臨界CO2萃取作為一種綠色、無(wú)毒害、效率較高的提取方法，能有效解決傳統(tǒng)方法的不足，獲得較高質(zhì)量的揮發(fā)油[18-19]。

目前關(guān)于超臨界CO2萃取竹葉花椒揮發(fā)油的報(bào)道較少，本文采用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)研究萃取時(shí)間、壓力、溫度等因素對(duì)揮發(fā)油提取率的影響，以確定超臨界CO2萃取竹葉花椒揮發(fā)油最佳提取工藝條件，以期為后續(xù)研究開發(fā)竹葉花椒揮發(fā)油提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

干燥的竹葉花椒果皮（產(chǎn)自四川省眉山市洪雅縣）：幺麻子食品股份有限公司；CO2氣體（純度99.99%，食品級(jí)）：綿陽(yáng)市昌俊氣體有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HA120-50-05 型超臨界萃取裝置：南通市華安超臨界萃取有限公司；皇代200T 型粉碎機(jī)：永康市鉑歐五金制品有限公司；BSA124S 電子分析天平：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 材料預(yù)處理

選取成熟開裂無(wú)籽的竹葉花椒干燥果皮，用粉碎機(jī)將其粉碎，過(guò)20 目篩，將竹葉花椒果皮粉末裝入密封袋中，放入4～6 ℃冰箱保鮮室備用。

1.3.2 工藝流程

稱取50 g 竹葉花椒果皮粉末裝入料筒后放入萃取釜，安裝密封圈，上緊堵頭，保證氣密性；開制冷機(jī)組電源，開加熱系統(tǒng)，設(shè)置溫度，對(duì)萃取釜、分離釜Ⅰ、分離釜Ⅱ進(jìn)行預(yù)熱；溫度穩(wěn)定后，打開CO2氣瓶送氣，通過(guò)高壓泵對(duì)萃取釜進(jìn)行加壓；調(diào)節(jié)閥門使壓力達(dá)到預(yù)定萃取壓力后，調(diào)節(jié)流量20 L/h，開始循環(huán)萃?。贿_(dá)到預(yù)定萃取時(shí)間，從分離釜Ⅰ下方閥門接取揮發(fā)油，進(jìn)行稱量，計(jì)算提取率。揮發(fā)油提取率按下式計(jì)算。

式中：Y為揮發(fā)油提取率，%；M1為揮發(fā)油質(zhì)量，g；M2為竹葉花椒果皮質(zhì)量，g。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

分別探究萃取時(shí)間（20、40、60、80、100 min）、萃取壓力（10、15、20、25、30 MPa）、萃取溫度（35、40、45、50、55 ℃）、分離釜Ⅰ壓力（4、6、8、10 MPa）、分離釜Ⅰ溫度（30、35、40、45、50 ℃）對(duì)竹葉花椒揮發(fā)油提取率的影響。

1.3.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

以萃取時(shí)間A、萃取溫度B、萃取壓力C為自變量，以竹葉花椒揮發(fā)油提取率Y為響應(yīng)指標(biāo)，采用Design-Expert 8.0.6 中的Box-Behnken 響應(yīng)面法設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。各因素水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素和水平編碼Table 1 Response surface test factors and level coding

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Design-Expert 8.0.6 軟件，通過(guò)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析并得到最佳提取工藝參數(shù)，圖表采用Origin 2018 繪制。每組試驗(yàn)重復(fù)3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 萃取時(shí)間對(duì)提取率的影響

設(shè)定萃取壓力25 MPa、萃取溫度50 ℃、分離釜Ⅰ壓力6 MPa、分離釜Ⅰ溫度45 ℃，研究萃取時(shí)間對(duì)竹葉花椒揮發(fā)油提取率的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 萃取時(shí)間對(duì)提取率的影響Fig.1 Effect of extraction time on extraction rate

理論上，在超臨界CO2萃取過(guò)程中，萃取時(shí)間越長(zhǎng)，提取率越大，直到達(dá)到最大值，而在實(shí)際生產(chǎn)操作中，需要平衡提取率與能源消耗，以得到最大的收益。由圖1 可知，提取率隨著萃取時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，60 min后提取率較高，且隨時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)變化不大，并且由于萃取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，能源消耗高，收益低，從試驗(yàn)結(jié)果以及經(jīng)濟(jì)角度出發(fā)，選擇萃取時(shí)間40、60、80 min 進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

2.1.2 萃取溫度對(duì)提取率的影響

設(shè)定萃取壓力25 MPa、萃取時(shí)間60 min、分離釜Ⅰ壓力6 MPa、分離釜Ⅰ溫度45 ℃，研究萃取溫度對(duì)竹葉花椒揮發(fā)油提取率的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 萃取溫度對(duì)提取率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on extraction rate

溫度升高會(huì)使分子運(yùn)動(dòng)加快，一方面，會(huì)降低超臨界CO2流體的密度，使其溶解能力下降；另一方面，會(huì)使溶質(zhì)的揮發(fā)性增強(qiáng)，同時(shí)加快傳質(zhì)過(guò)程，有利于萃取。由圖2 可知，萃取溫度在35～50 ℃時(shí)，竹葉花椒揮發(fā)油的提取率隨溫度的升高呈上升趨勢(shì)。說(shuō)明在當(dāng)前壓力下，35～50 ℃溫度條件下進(jìn)行萃取時(shí)，萃取溫度對(duì)溶解度的影響較低，而對(duì)傳質(zhì)能力的影響在萃取過(guò)程中占主導(dǎo)地位，揮發(fā)油提取率上升。50～55 ℃時(shí)，萃取溫度對(duì)溶解度的影響較大，增加的傳質(zhì)能力不能抵消掉這部分影響，從而導(dǎo)致?lián)]發(fā)油提取率降低。因此，選擇萃取溫度45、50、55 ℃進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

2.1.3 萃取壓力對(duì)提取率的影響

設(shè)定萃取溫度50 ℃、萃取時(shí)間60 min、分離釜Ⅰ壓力6 MPa、分離釜Ⅰ溫度45 ℃，研究萃取壓力對(duì)竹葉花椒揮發(fā)油提取率的影響，結(jié)果如圖3所示。

由圖3 可知，萃取壓力小于25 MPa 時(shí)，由于CO2流體密度隨壓力增加而增大，揮發(fā)油在其中的溶解度增加，有利于萃取。萃取壓力超過(guò)25 MPa 后，溶解性增加減緩，設(shè)備的穩(wěn)定性下降，導(dǎo)致提取率略有下降。考慮到壓力過(guò)大對(duì)設(shè)備造成的負(fù)擔(dān)，結(jié)合安全性和經(jīng)濟(jì)性原則，因此選擇萃取壓力20、25、30 MPa 進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

2.1.4 分離釜Ⅰ壓力對(duì)提取率的影響

設(shè)定萃取壓力25 MPa、萃取溫度50 ℃、萃取時(shí)間60 min、分離釜Ⅰ溫度45 ℃，研究分離釜Ⅰ壓力對(duì)竹葉花椒揮發(fā)油提取率的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 分離釜Ⅰ壓力對(duì)提取率的影響Fig.4 Effect of pressure of separation tank I on extraction rate

臨界壓力附近微小的壓力變化會(huì)使得超臨界流體的密度發(fā)生較大改變，直接影響到超臨界CO2的溶解能力[20]。由圖4 可知，當(dāng)分離釜Ⅰ壓力為4 MPa 時(shí)，提取率最高，但此時(shí)得到的揮發(fā)油中含有少量水分；6 MPa 時(shí)，提取率略微下降，但揮發(fā)油中的水分被除去；分離釜Ⅰ壓力在8～10 MPa 時(shí)，揮發(fā)油提取率大幅度降低。綜合分析，分離釜Ⅰ壓力為6 MPa 時(shí)，分離效果最好，提取率較高，為最適分離釜Ⅰ壓力。

2.1.5 分離釜Ⅰ溫度對(duì)提取率的影響

設(shè)定萃取壓力25 MPa、萃取溫度50 ℃、萃取時(shí)間60 min、分離釜Ⅰ壓力6 MPa，研究分離釜Ⅰ溫度對(duì)竹葉花椒揮發(fā)油提取率的影響，結(jié)果如圖5所示。

圖5 分離釜Ⅰ溫度對(duì)提取率的影響Fig.5 Effect of temperature of separation tank I on extraction rate

由圖5 可知，隨著溫度升高，CO2流體密度降低，溶解度下降，有利于揮發(fā)油和CO2流體的分離，揮發(fā)油的提取率隨之上升。當(dāng)溫度達(dá)到40 ℃時(shí)，提取率達(dá)到最大值，但此條件下得到的揮發(fā)油中含有少量水分，油水分離不徹底。溫度高于40 ℃后，水分被分離出去，且隨著溫度升高，易揮發(fā)性組分丟失，提取率隨之降低。綜合考慮，選擇45 ℃作為最適分離釜Ⅰ溫度。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

按表1 進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2，對(duì)表2 中的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸方程的方差分析，結(jié)果見表3。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Response surface experimental design and results

回歸方程為Y=13.90+1.37A+0.17B+0.33C-0.03AB-0.21AC+0.03BC-0.38A2-0.85B2-0.62C2。由表3 可知，模型的p＜0.000 1，表示模型極顯著，擬合程度高；失擬項(xiàng)p=0.227 6＞0.05，不顯著，說(shuō)明干擾項(xiàng)對(duì)試驗(yàn)的影響可以忽略；信噪比為30.826，遠(yuǎn)大于4，表明信號(hào)充足；預(yù)決定系數(shù)RPred2（0.931 3）與校準(zhǔn)決定系數(shù)RAdj2（0.985 2）合理一致，差異較小，說(shuō)明該模型可用于模擬預(yù)測(cè)。F值越大說(shuō)明因素對(duì)提取率的影響越大，由表3 中F值可知，影響竹葉花椒揮發(fā)油提取率的因素依次為萃取時(shí)間（A）＞萃取壓力（C）＞萃取溫度（B）。通過(guò)p值大小可知，因素A、B、C、AC、A2、B2、C2對(duì)揮發(fā)油提取率均有顯著影響（p＜0.05），AB、BC兩項(xiàng)影響不顯著。

用Design-Expert 8.0.6 軟件根據(jù)回歸方程繪制AB、AC、BC的響應(yīng)曲面分析圖，結(jié)果見圖6～圖8。

圖6 萃取時(shí)間與萃取溫度的交互作用Fig.6 Effect of the interaction between extraction time and extraction temperature on extraction rate

由圖6 可知，等高線趨于圓形，說(shuō)明萃取時(shí)間與萃取溫度的交互作用不顯著，與方差分析結(jié)果一致。等高線隨時(shí)間變化顏色加深，說(shuō)明萃取時(shí)間對(duì)提取率的影響更大，響應(yīng)曲面表現(xiàn)為坡度更陡。

由圖7 可知，萃取時(shí)間與萃取壓力的交互作用顯著，表現(xiàn)為提取率在較高壓和較低壓時(shí)隨時(shí)間變化的曲線有較大區(qū)別，響應(yīng)曲面曲折，等高線變化趨于橢圓形。圖中萃取時(shí)間對(duì)應(yīng)的響應(yīng)面曲線坡度更陡，等高線更密集，顏色逐漸加深，說(shuō)明萃取時(shí)間對(duì)提取率影響更大。

由圖8 可知，響應(yīng)曲面平緩，等高線趨于圓形，萃取壓力與萃取溫度交互作用不顯著。

通過(guò)軟件Design-Expert 8.0.6 求解回歸方程，得到最佳工藝條件：萃取時(shí)間80 min，萃取溫度50.405 ℃，萃取壓力25.486 MPa，此時(shí)超臨界CO2萃取竹葉花椒揮發(fā)油的理論提取率可達(dá)14.889%。根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行調(diào)整，確定萃取時(shí)間80 min，萃取溫度50.5 ℃，萃取壓力25.5 MPa。在此條件下進(jìn)行3 次驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果見表4。

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of repeated experiments for validation

由表4 可知，3 組重復(fù)試驗(yàn)得到揮發(fā)油提取率與預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差均在5%的合理范圍內(nèi)，說(shuō)明響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)的設(shè)計(jì)結(jié)果是合理的。

3 結(jié)論

超臨界CO2萃取時(shí)間短，萃取效率高，較低的萃取溫度不會(huì)破壞生物活性成分，CO2還能保護(hù)活性成分，避免其在萃取過(guò)程中被氧化。同時(shí)，該技術(shù)集萃取與分離于一體，操作簡(jiǎn)單，無(wú)溶劑污染，能很好地應(yīng)用于竹葉花椒揮發(fā)油的萃取。本研究通過(guò)單因素試驗(yàn)結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化超臨界CO2萃取竹葉花椒揮發(fā)油工藝。結(jié)果顯示，模型差異極顯著，可用于模擬預(yù)測(cè)，3 個(gè)因素對(duì)揮發(fā)油的影響次序?yàn)檩腿r(shí)間>萃取壓力>萃取溫度，且都對(duì)提取率有顯著影響。求解回歸方程并根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整得到最佳工藝條件為萃取時(shí)間80 min、萃取溫度50.5 ℃、萃取壓力25.5 MPa、分離釜Ⅰ壓力6 MPa、分離釜Ⅰ溫度45 ℃，在此條件下竹葉花椒揮發(fā)油平均提取率為14.25%，結(jié)果符合模型預(yù)測(cè)。