胡國慶，梁永恒，張譽(yù)文，李萍，馬朝陽，譚冠暉*

（1.廣西工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧530001；2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等食源性致病菌是導(dǎo)致食品腐敗的主要因素，誤食后會(huì)導(dǎo)致多種健康問題，如口腔潰瘍和腸胃炎[1]。盡管大多數(shù)存在于腸道中的大腸桿菌菌株沒有害處，但依然存在誘發(fā)腸內(nèi)和腸外感染的風(fēng)險(xiǎn)[2]，傳統(tǒng)的抗生素處理易導(dǎo)致耐藥菌株的增加并造成腸道菌群失調(diào)[3]。因此，開發(fā)天然生物防腐劑避免食品中大腸桿菌污染，對(duì)食品生產(chǎn)和食品安全具有重要意義。

仙草（Hsian-tsao，HST）又名仙人草、仙人凍、薪草、涼粉草（MesonachinesisBenth）等，為唇形科仙草屬一年生草本植物，是一種重要的藥食兩用植物資源[4]，分布于我國的廣東、福建、廣西、江西、海南、浙江、臺(tái)灣和云南等地。研究表明，仙草提取液可抑制禽大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等多種食源性致病菌（如枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞、黑曲霉）的體外增殖[5-7]。仙草中迷迭香酸可以改變細(xì)菌細(xì)胞膜的滲透性[8-9]，使糖和蛋白質(zhì)漏出胞外，同時(shí)還影響蛋白質(zhì)代謝。當(dāng)迷迭香酸作用于金黃色葡萄球菌時(shí)，它可以影響細(xì)菌糖的代謝并抑制生物膜的生長和形成[10]，它也可以作為Taq DNA聚合酶抑制劑來抑制細(xì)菌DNA 復(fù)制[11]?？偨Y(jié)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，仙草中萜類成分（以齊墩果酸和熊果酸為代表）[12]具有抑菌作用，其含有的酚酸類成分（以迷迭香酸為代表）、黃酮類成分（以蘆丁為代表）等在其他提取物中被證明也具有抑菌作用[13-14]，同時(shí)測定三類代表成分在仙草提取物中的含量及其對(duì)應(yīng)最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）和最小殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，MBC） 的研究鮮見報(bào)道?；诖?，本研究旨在探究仙草提取物對(duì)大腸桿菌的體外抑制效果，挖掘并驗(yàn)證發(fā)揮關(guān)鍵抑制作用的功能成分，測定仙草提取物在MBC 和MIC 濃度下對(duì)細(xì)胞活力的影響，以期為開發(fā)與仙草相關(guān)產(chǎn)品提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

仙草：廣西玉林；大腸桿菌CMCC 44102：北京生物制品研究所；穆勒·亨頓（Mueller Hinton，MH）肉湯培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）測定試劑盒：南京建成生物工程研究所；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（≥98%）：中國廣州分析測試中心；迷迭香酸標(biāo)準(zhǔn)品、咖啡酸標(biāo)準(zhǔn)品、異槲皮苷標(biāo)準(zhǔn)品、紫云英苷標(biāo)準(zhǔn)品、齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品、熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度均≥98%）：北京北方偉業(yè)計(jì)量技術(shù)研究院有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1260 液相色譜儀：安捷倫科技有限公司；Laboratory-4011 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：海道爾夫儀器設(shè)備（上海）有限公司；Multiskan FC 酶標(biāo)儀：賽默飛世爾科技公司；ZY-300IV 多功能微生物自動(dòng)測量分析儀：北京先驅(qū)威鋒技術(shù)開發(fā)公司；TU-1901 分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；MEDIFRIGER BL-S 離心機(jī)：西班牙J.P.Selecta 公司；DDSJ-308A 電導(dǎo)率儀：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 提取物的制備

參考文獻(xiàn)[12，15]的方法，分別稱取干燥的仙草全草、葉和莖粉末各30 g，溶解于500 mL 70%乙醇，60 ℃水浴3 h 后4 500 r/min 離心5 min，然后60 ℃、≤0.08 MPa于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮至3.0 mL。

1.3.2 抑菌圈直徑的測定

參考文獻(xiàn)[16]的方法，取0.1 mL 濃度1.0×106CFU/mL的大腸桿菌CMCC 44102 涂布于平板，采用多功能微生物自動(dòng)測量分析儀在營養(yǎng)瓊脂平皿中等距離放入4 個(gè)已消毒的8 mm 不銹鋼牛津杯。每個(gè)牛津杯中加入200 μL 提取液或無菌水作對(duì)照，37 ℃過夜培養(yǎng)后觀察抑菌圈大小。

1.3.3 最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC）的測定

參考文獻(xiàn)[17]的方法，取96 孔微量板，采用微量肉湯稀釋法測定菌株對(duì)仙草提取物的MIC 和MBC。在96 孔板中，以肉眼觀察無絮狀物或沉淀生成的提取物最低濃度孔中的濃度為MIC。從上述MIC 測定中未見生長的各孔肉湯中取0.1 mL 接種于營養(yǎng)瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)16～18 h，仍無菌生長的孔內(nèi)最低濃度即為MBC。

1.3.4 抑菌物質(zhì)的測定

1.3.4.1 提取物中蘆丁含量的測定

參考文獻(xiàn)[18]的方法測定蘆丁含量。色譜條件：采用安捷倫Eclipse XDB-C1（84.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱；流動(dòng)相為A：甲醇-乙腈（1∶10，體積比），B：0.1%磷酸溶液；流速1.0 mL/min；檢測波長360 nm；柱溫25 ℃，進(jìn)樣量20 μL。

1.3.4.2 提取物中迷迭香酸、咖啡酸、異槲皮苷和紫云英苷含量的測定

參考文獻(xiàn)[19]的方法，流動(dòng)相采用乙腈∶0.1%甲酸不同梯度洗脫，梯度洗脫程序見表1。檢測波長：254 nm；柱溫：室溫；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL。分別進(jìn)樣混合標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液及仙草樣品溶液得高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）圖。

1.3.4.3 提取物中齊墩果酸和熊果酸含量的測定

參考文獻(xiàn)[20]的方法，流動(dòng)相為甲醇∶0.5%磷酸水溶液（95∶5，體積比）；流速：1.0 mL/min；柱溫：室溫；檢測波長：210 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

1.3.4.4 抑菌化合物的MIC 和MBC 測定

稱取一定量的迷迭香酸、異槲皮苷、咖啡酸、紫云英苷、熊果酸、齊墩果酸、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶解于甲醇，然后以1.3.3 方法測定各化合物的MIC 和MBC。

1.3.5 仙草提取物對(duì)細(xì)胞生長影響

1.3.5.1 仙草提取物對(duì)大腸桿菌細(xì)胞生長的影響

參考文獻(xiàn)[21]的方法，用仙草提取物配制成20 倍MIC 和MBC 濃度的提取物溶液，分別吸取1 mL 加入裝有9 mL MH 肉湯培養(yǎng)基的試管中，以等量MH 肉湯培養(yǎng)作為對(duì)照組。分別向錐形瓶中加入100 μL 大腸桿菌菌懸液（1×106CFU/mL），充分混勻后，在37 ℃條件下振蕩培養(yǎng)24 h。在培養(yǎng)時(shí)間為0、3、6、9、12、24 h 時(shí)分別取樣200 μL 加入到96 孔酶標(biāo)板中，試驗(yàn)設(shè)置3 組重復(fù)，測定620 nm 處的吸光度。以吸光度的平均值為縱坐標(biāo)，培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制大腸桿菌的生長曲線。

1.3.5.2 仙草提取物對(duì)大腸桿菌細(xì)胞壁通透性的影響

參考文獻(xiàn)[22]的方法，取20 倍MIC 和MBC 濃度的250 μL 提取物，加入5 mL MH 肉湯培養(yǎng)基，混勻后，每管加入50 μL 大腸桿菌菌懸液（1×106CFU/mL），充分混勻后，在37 ℃條件下，分別培養(yǎng)0、1、2、3、4 h 后，取4.0 mL 培養(yǎng)液于10 mL 離心管中，5 000 r/min 離心10 min。取0.1 mL 上清液，按照堿性磷酸酶（ALP）測定試劑盒說明書依次加入緩沖溶液、基質(zhì)溶液，37 ℃水浴加熱15 min，加入顯色劑，混勻。取樣100 μL 加入至96 孔微量滴定板，在520 nm 處測定吸光度。設(shè)置3 組平行試驗(yàn)，以平均吸光度為縱坐標(biāo)，培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制仙草提取物對(duì)細(xì)胞壁通透性的影響曲線。

1.3.5.3 仙草提取物對(duì)大腸桿菌細(xì)胞膜完整性和通透性的影響

參考文獻(xiàn)[22]的方法，分別取20 倍MIC 和MBC濃度的250 μL 提取物，加入5 mL MH 肉湯培養(yǎng)基，混勻，每管加入50 μL 大腸桿菌菌懸液（1×106CFU/mL），充分混勻后，在37 ℃條件下，分別培養(yǎng)0、1、2、3、4 h后，取4.0 mL 菌液，5 000 r/min 離心10 min。取上清液，測定260 nm 處的吸光度。試驗(yàn)設(shè)置3 次重復(fù)，以平均吸光度為縱坐標(biāo)，培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制曲線，以評(píng)價(jià)仙草提取物對(duì)大腸桿菌細(xì)胞膜完整性的影響。取上述1 mL 上清液加4 mL 蒸餾水于20 mL 燒杯中，然后使用電導(dǎo)率儀分別測定培養(yǎng)0、1、2、3、4 h 后的培養(yǎng)液電導(dǎo)率參數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用GraphPad Prism 9.0 和Origin 2019 進(jìn)行數(shù)據(jù)和圖形處理，數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 仙草提取物抑菌圈的測定結(jié)果

圖1 為仙草不同部位提取物抑菌圈大小。

圖1 仙草不同部位提取物抑菌圈直徑Fig.1 Diameter of inhibition zone extracted from different parts of HST

由圖1 可知，利用牛津杯法測得仙草全草、葉、莖提取物對(duì)應(yīng)的抑菌圈直徑分別為（21.69±2.15）、（21.23±1.32）、（20.35±1.88）mm，且三者差異不明顯。根據(jù)抑菌圈大小判斷，其抑菌效果極度敏感[12]。劉富來等[5]、曹媛媛等[6]研究表明，大腸桿菌對(duì)仙草葉提取液的敏感性較高，仙草不同部位的提取液對(duì)不同血清型的禽大腸桿菌敏感性差異較大。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌CMCC 44102 并不符合此描述，原因待研究。后續(xù)研究使用全草提取物作為試驗(yàn)材料。

2.2 仙草MIC 和MBC 的測定結(jié)果

采用微量二倍稀釋法測定仙草提取物的MIC 和MBC，結(jié)果見圖2。

圖2 仙草提取物MIC 和MBCFig.2 MIC and MBC of the extract from HST

由圖2 可知，在96 孔板中，第3、4 孔里無明顯沉淀和渾濁出現(xiàn)。用移液槍移取0.1 mL 培養(yǎng)液涂布于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h 后發(fā)現(xiàn)，第3 孔無菌落生長，第4 孔有少量菌落生長，將其換算成生藥濃度，得出仙草提取物對(duì)大腸桿菌CMCC 44102 的MIC 為0.17 g/mL（生藥濃度），MBC 為0.33 g/mL。

2.3 仙草提取物主要抑菌成分的測定結(jié)果

根據(jù)文獻(xiàn)中記錄的有關(guān)化合物[11-12]，選取了7 種代表化合物，利用標(biāo)準(zhǔn)樣品外標(biāo)法定量，通過液相色譜測定了提取物中其對(duì)應(yīng)的含量，結(jié)果如圖3所示。

圖3 仙草提取物主要抑菌成分色譜圖Fig.3 Chromatograms of main antibacterial components of the extract from HST

由圖3 可知，在提取液中，蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷、迷迭香酸和咖啡酸的含量分別為6.63、0.47、0.34、0.32、0.01 mg/g。無論使用70%乙醇、100%甲醇或使用超聲提取法[20]對(duì)仙草進(jìn)行提取，得到的提取液中，齊墩果酸和熊果酸均未檢出。究其原因可能是仙草提取物中固有的一些自身基質(zhì)成分復(fù)雜，而且齊墩果酸、熊果酸一般在其中的含量不高。據(jù)報(bào)道，采用固相萃取柱富集[23]，可以提高檢測靈敏度和準(zhǔn)確度，此次研究未進(jìn)一步實(shí)施。

2.4 仙草提取物抑菌成分的抑菌效果

根據(jù)液相色譜檢測的結(jié)果，用甲醇配制對(duì)應(yīng)濃度（熊果酸9.75 mg/mL，齊墩果酸10.15 mg/mL，其余濃度按2.3 檢測的結(jié)果配制）的化合物，以提取物和甲醇為對(duì)照，做牛津杯試驗(yàn)，結(jié)果見圖4。

圖4 化合物抑菌圈Fig.4 Inhibition zone of compounds

由圖4 可知，甲醇對(duì)照組沒有抑菌圈，提取物對(duì)照組抑菌圈明顯?；衔镏?，除了圖4b 咖啡酸有抑菌圈，其他化合物均沒有明顯的抑菌圈，可能與抑菌物質(zhì)的溶解性及其在培養(yǎng)基的擴(kuò)散受阻有關(guān)?；诖耍倮?6 孔板測得迷迭香酸、咖啡酸、蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷、齊墩果酸、熊果酸的MBC 分別為9.55、10.20、12.10、3.21、1.68、0.68、0.65 mg/mL，對(duì)應(yīng)的MIC分別為4.78、5.10、6.05、1.61、0.84、0.34、0.33 mg/mL。

2.5 仙草提取物對(duì)大腸桿菌生長的影響結(jié)果

按1%接種量將大腸桿菌接種于MH 肉湯培養(yǎng)基，并將未添加仙草提取物的一組作為對(duì)照組，觀察終濃度為MBC 和MIC 的仙草提取物對(duì)大腸桿菌生長的影響，結(jié)果如圖5所示。

圖5 仙草提取物對(duì)大腸桿菌生長的影響Fig.5 Effect of the extract from HST on the growth of E.coli

由圖5 可知，對(duì)照組菌株在3 h 左右，OD620nm明顯升高，并進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，隨后24 h 內(nèi)按照大腸桿菌正常生長周期開始生長。MIC 組的菌株培養(yǎng)液，約在6 h 后，OD620nm開始升高，但升高趨勢整體緩慢，在9 h，開始明顯生長，提取物的抑制作用在下降。MBC 組的菌株培養(yǎng)液，24 h 內(nèi)OD620nm均無明顯變化，菌株處于完全抑制狀態(tài)。

2.6 仙草提取物對(duì)大腸桿菌細(xì)胞壁通透性的影響結(jié)果

利用堿性磷酸酶（ALP）測定試劑盒，測得仙草提取物對(duì)大腸桿菌細(xì)胞壁通透性的影響，結(jié)果如圖6所示。

圖6 仙草提取物對(duì)大腸桿菌細(xì)胞壁通透性的影響Fig.6 Effect of the extract from HST on cell wall permeability of E.coli

由圖6 可知，MBC 組和MIC 組520 nm 處的吸光度在0～4 h 均高于未添加提取物組，且兩者差異明顯。據(jù)此可推測仙草提取物會(huì)破壞大腸桿菌的細(xì)胞壁，細(xì)胞壁的通透性增加，最終堿性磷酸酶（位于細(xì)胞壁與細(xì)胞膜之間）滲透出來。MBC 組520 nm 處的吸光度明顯高于MIC 組，這說明仙草提取物濃度增加會(huì)增強(qiáng)其對(duì)大腸桿菌細(xì)胞壁的破壞作用，提高了細(xì)胞壁的通透性。

2.7 仙草提取物對(duì)大腸桿菌細(xì)胞膜完整性和通透性的影響結(jié)果

仙草提取物對(duì)大腸桿菌細(xì)胞膜完整性和通透性的影響結(jié)果如圖7所示。

圖7 仙草提取物對(duì)大腸桿菌細(xì)胞膜完整性和通透性的影響Fig.7 The effect of extract from HST on the integrity and permeability of E.coli

由圖7a 可知，0～4 h 內(nèi)，未添加提取物組的OD260nm沒有明顯的變化，MBC 組和MIC 組的OD260nm明顯升高，且MBC 組增加明顯。這表明大腸桿菌細(xì)胞膜損失明顯，細(xì)胞內(nèi)容大分子物質(zhì)泄露進(jìn)入培養(yǎng)液。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，MBC 和MIC 組OD260nm逐漸增加，但前者在每個(gè)觀測時(shí)間點(diǎn)均高于后者，由此提示仙草提取物對(duì)大腸桿菌細(xì)胞膜完整性的影響效應(yīng)與濃度相關(guān)。由圖7b 可知，0～4 h，MBC 組和MIC 組的電導(dǎo)率均高于未添加提取物組，這表明仙草提取物的添加能夠提高大腸桿菌細(xì)胞膜的通透性。隨著時(shí)間的延長，電導(dǎo)率值不斷上升，這說明仙草提取物對(duì)細(xì)胞膜通透性的破壞作用也增強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)滲透量隨之增加。

3 結(jié)論

本研究旨在探究仙草提取物對(duì)大腸桿菌的抑制作用。通過測定抑菌圈的大小，明確了仙草提取物對(duì)大腸桿菌具有顯著的抑制效果，并測定了其最小殺菌濃度和最小抑菌濃度。此外，還對(duì)仙草提取物中可能具有抑菌作用的7 種化合物進(jìn)行了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)齊墩果酸和熊果酸未被檢測到。同時(shí)，對(duì)這7 種化合物進(jìn)行了抑菌圈、MBC 和MIC 的驗(yàn)證，結(jié)果顯示這7 種化合物單獨(dú)對(duì)大腸桿菌的抑制作用不一致。另外研究了仙草提取物對(duì)大腸桿菌細(xì)胞的影響，發(fā)現(xiàn)仙草提取物能夠破壞細(xì)胞膜的完整性和通透性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的生物大分子泄露和細(xì)胞壁破裂，表現(xiàn)出抗大腸桿菌的活性。本研究為仙草提取物在食品生產(chǎn)中的開發(fā)應(yīng)用提供了基礎(chǔ)依據(jù)。