左碩靜，李逍燕，劉曉涵，張晴，懷向前，桑亞新

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北 保定 071000）

牡蠣（Crassostreagigas）是一類營養(yǎng)價值很高的海水產(chǎn)品，富含人體所必需的蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)和微量元素等，可以抗腫瘤、抗氧化、抗疲勞以及降血壓，具有很高的藥用和營養(yǎng)價值[1]。肌漿蛋白（sarcoplasmic protein，SP）是牡蠣所含的重要蛋白，位于肌肉細胞中，主要存在于肌纖維鞘和肌原纖維蛋白之間，占肌肉蛋白質(zhì)量的30%～35%，因其易溶于水，也被稱為水溶性蛋白[2]。肌漿蛋白雖然易于制備提取，但是產(chǎn)量較低，且對加工條件較為苛刻，環(huán)境因素、生產(chǎn)過程中的處理方法等都會導(dǎo)致肌漿蛋白功能特性的降低，最終造成肌漿蛋白的流失，進而影響產(chǎn)品風(fēng)味和功能[3]，通過現(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)改性不僅能改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，還能改善蛋白質(zhì)的功能特性，使蛋白資源得到更廣泛的應(yīng)用。

超聲波是一種綠色的食品物理加工技術(shù)，它通過空化效應(yīng)產(chǎn)生機械剪切和湍流效應(yīng)，并通過形成局部瞬時高壓來影響蛋白質(zhì)分子的空間結(jié)構(gòu)和功能特性[4]，已廣泛應(yīng)用到蛋清蛋白[5]、大豆蛋白[6]、豌豆蛋白[7]等食品的加工研究當(dāng)中。Chen 等[8]發(fā)現(xiàn)超聲處理可通過空化作用誘導(dǎo)肌球蛋白產(chǎn)生“應(yīng)激反應(yīng)”和群體效應(yīng)，使蛋白形成更穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)以抵抗空化力的負面影響。Thalía 等[9]研究發(fā)現(xiàn)，高壓超聲處理可以有效改變牛蹄豆分離蛋白的體外消化率和溶解度。超聲技術(shù)可以有效改善蛋白質(zhì)理化性質(zhì)，但在貝類蛋白加工中應(yīng)用相對較少。本文主要探究在200 W 超聲功率下，不同超聲處理時間對牡蠣肌漿蛋白結(jié)構(gòu)的影響和蛋白聚集行為的變化，進一步了解超聲處理對蛋白溶解性的影響，以期為牡蠣蛋白的研究及貝類加工提供依據(jù)及參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮牡蠣：市售；甲醇、乙酸、尿素、氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、5，5'-二硫雙-（2-硝基苯甲酸）[5，5'-dithiobis（2-nitrrobenzoic acid），DTNB]、8-苯胺-1-萘磺酸鹽（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS），牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）：美國Sigma 公司；考馬斯亮藍G250、蛋白Marker（10～250 kDa）、5 倍上樣緩沖液：賽文創(chuàng)新（北京）科技有限公司。以上化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TGL-16M 高速臺式冷凍離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；JP96L 均質(zhì)機：中國蘇泊爾公司；JY92-IIDN 超聲粉碎機：寧波新芝生物科技股份有限公司；Tanon 4600 凝膠成像儀：上海天能科技有限公司；F-320 熒光分光光度計：天津港東儀器有限公司；N5000 紫外可見分光光度計：上海佑科儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料預(yù)處理

新鮮牡蠣用冰塊運送到實驗室，清洗牡蠣外殼，去殼取肉，用蒸餾水沖洗兩次，將牡蠣肉切成小塊，4 ℃儲藏并盡快使用。

1.3.2 肌漿蛋白的提取

參考Liu 等[10]的方法提取肌漿蛋白并稍作修改。將牡蠣肉與20 mmol/L 磷酸鹽緩沖液（含100 mmol/L氯化鈉，1 mmol/L EDTA，pH7）以體積比1∶4 混合并在冰水浴中均質(zhì)90 s，在4 ℃下6 790×g條件下離心20 min，收集上清液，即得肌漿蛋白。以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用雙縮脲法測定SP 的濃度。

1.3.3 超聲處理肌漿蛋白

調(diào)整SP 濃度為5 mg/mL，在200 W 的超聲功率下分別處理0、10、20、30、40、50 min，處理后的樣品在4 ℃保存并在48 h 內(nèi)使用。

1.3.4 肌漿蛋白一級結(jié)構(gòu)測定

參考Laemmli[11]的方法進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）并稍作修改，將稀釋后的SP 溶液（2 mg/mL）與5 μL 的SDS-PAGE 緩沖液混合，在沸水中煮沸10 min，使用10%分離膠和5%濃縮膠，上樣量為20 μL，使用100 V 的恒定電流直到指示劑高于凝膠邊緣約5 mm 停止電泳。電泳結(jié)束后，考馬斯亮藍G250 染色10 min，隨后用5%甲醇溶液和7.5%乙酸溶液脫色。脫色后，在凝膠成像儀上成像。

1.3.5 肌漿蛋白內(nèi)源性熒光的測定

參考Jia 等[12]的方法并稍作修改。用磷酸鹽緩沖液稀釋SP 溶液至濃度0.5 mg/mL，設(shè)置激發(fā)波長為295 nm，發(fā)射光譜為300～420 nm，設(shè)定激發(fā)波長與發(fā)射波長之間的狹縫寬度為10.0 nm，用熒光分光光度計測定內(nèi)源性熒光。

1.3.6 肌漿蛋白表面疏水性的測定

參考Jiang 等[13]的方法，用磷酸鹽緩沖液將SP 溶液稀釋至濃度0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL，分別取5 mL各濃度的SP 溶液與25 mL 的ANS 溶液（含8 mmol/L ANS，20 mmol/L 磷酸鹽緩沖液，pH7.5）混合，25 ℃黑暗處反應(yīng)25 min，用熒光分光光度計記錄激發(fā)波長為374 nm 和發(fā)射波長為485 nm 處的熒光強度。以熒光強度對蛋白質(zhì)濃度作曲線，曲線的初始斜率為SP 的表面疏水性。

1.3.7 肌漿蛋白巰基與二硫鍵含量的測定

總巰基含量：參考Zhang 等[14]的方法測定，并稍作修改。將0.5 mL 的SP 溶液（1 mg/mL）溶解于4.5 mL 含8 mol/L 尿素和10 mmol/L EDTA（pH6）的溶液，并加入100 μL 的Ellman 溶液（含10 mmol/L DTNB，0.1 mol 磷酸二氫鈉），混合均勻后，25 ℃黑暗處靜置反應(yīng)25 min，用紫外可見分光光度計在412 nm 處測定吸光度，以不含DTNB 的SP 溶液為空白對照?？値€基含量（X，μmol/g）計算公式如下。

式中：A412為412 nm 處樣品吸光度；A412r為412 nm處空白試劑吸光度；k 為消光系數(shù)13 600 mol/（L·cm）；c為樣品中蛋白濃度，mg/mL。

游離巰基含量：參考Guo 等[15]的方法測定，將5 mL的SP 溶液（1 mg/mL）與20 μL DTNB 溶液混合，25 ℃反應(yīng)25 min，紫外可見分光光度計在412 nm 處測定吸光度，以不含DTNB 的SP 溶液為空白對照。游離巰基含量（Y，μmol/g）計算公式如下。

式中：A412為412 nm 處樣品吸光度；A412r為412 nm處空白試劑吸光度；k 為消光系數(shù)13 600 mol/（L·cm）；c為樣品中蛋白濃度，mg/mL。

二硫鍵含量（Z，μmol/g）計算公式如下。

式中：X為總巰基含量，μmol/g；Y為游離巰基含量，μmol/g。

1.3.8 肌漿蛋白濁度的測定

參考Liu 等[16]的方法測定濁度。稀釋SP 溶液至1 mg/mL，在室溫下反應(yīng)30 min，用紫外可見分光光度計在340 nm 下測定其吸光度，同時做試劑空白。

1.3.9 肌漿蛋白溶解性的測定

參考Liu 等[17]的方法測定溶解性，并稍作修改。稀釋SP 溶液濃度至5 mg/mL，在4 ℃下以6 790×g條件下離心20 min，用雙縮脲法測定離心前后上清液中的蛋白含量，用上清液蛋白濃度與未作處理的蛋白濃度之比來計算蛋白溶解性（W，%），公式如下。

式中：M1為上清液中蛋白含量，mg；M2為溶液中總蛋白含量，mg。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有試驗均至少重復(fù)進行3 次。所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 22.0 軟件進行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同超聲處理時間對肌漿蛋白一級結(jié)構(gòu)的影響

應(yīng)用SDS-PAGE 觀察超聲處理時間對SP 的影響，探究不同超聲處理時間對SP 一級結(jié)構(gòu)的影響。不同超聲處理時間下牡蠣肌漿蛋白SDS-PAGE 圖譜如圖1所示。

圖1 不同超聲處理時間下肌漿蛋白SDS-PAGE 圖譜Fig.1 SDS-PAGE of sarcoplasmic proteins at different time points of ultrasonic treatment

由圖1 可知，所有樣品均表現(xiàn)出明顯的SP 蛋白特征條帶，包括C 蛋白（150 kDa）、輔肌動蛋白（110 kDa）、肌酸激酶（44 kDa）、T 肌鈣蛋白（38 kDa）[18-19]。與對照組相比，可以觀察到超聲處理時間并沒有改變蛋白分子質(zhì)量的大小，這一現(xiàn)象表明，在200 W 下超聲處理0～50 min，不會對SP 一級結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。

2.2 不同超聲處理時間對肌漿蛋白內(nèi)源性熒光強度的影響

內(nèi)源性熒光光譜主要反映SP 的三級結(jié)構(gòu)，內(nèi)源性熒光是由于蛋白芳香族氨基酸殘基的激發(fā)和釋放，特別是色氨酸[20]。當(dāng)色氨酸周圍構(gòu)象發(fā)生變化時，內(nèi)源性熒光強度會隨之發(fā)生波動，因此，SP 的三級結(jié)構(gòu)的變化可由熒光強度的變化來確定。不同超聲處理時間對牡蠣SP 熒光強度影響如圖2所示。

圖2 超聲處理時間對肌漿蛋白熒光強度的影響Fig.2 Effect of ultrasonic treatment time on fluorescence intensity of sarcoplasmic proteins

由圖2 可知，熒光強度隨超聲處理時間的延長呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢，在40 min 達到最低，說明超聲處理使SP 部分或完全展開，包埋在內(nèi)部的色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸暴露在極性環(huán)境中，極性溶劑會使發(fā)色基團發(fā)生熒光猝滅作用，使熒光強度降低。到50 min時，熒光強度又升高，可能是由于表面疏水性增加，暴露的疏水氨基酸殘基之間的疏水相互作用而形成可溶性蛋白質(zhì)聚集體[21]，暴露的芳香族氨基酸重新遷移到蛋白分子內(nèi)部。熒光強度的變化表明，超聲波處理可以改變SP 的三級結(jié)構(gòu)。

2.3 不同超聲處理時間對肌漿蛋白表面疏水性的影響

表面疏水性是維持蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的主要作用力，可以反映蛋白質(zhì)疏水性基團的含量，是表征蛋白質(zhì)構(gòu)象和聚集行為的重要指標(biāo)[22]。不同超聲處理時間對牡蠣SP 表面疏水性影響如圖3所示。

圖3 超聲處理時間對肌漿蛋白表面疏水性的影響Fig.3 Effect of ultrasonic treatment time on surface hydrophobicity of sarcoplasmic proteins

由圖3 可知，表面疏水性隨超聲處理時間的延長，呈現(xiàn)先減小后增大的趨勢，在40 min 處達到最小值（861.96），與對照組相比降低了24.30%，超聲波處理過程中產(chǎn)生的空化效應(yīng)可以破壞蛋白質(zhì)分子疏水區(qū)周圍水分子的“包合物”結(jié)構(gòu)，非共價相互作用被破壞，蛋白質(zhì)分子暴露于水-空氣界面，表面疏水性下降。表面疏水性降低會增強蛋白質(zhì)與水之間的相互作用，從而進一步影響聚集體的產(chǎn)生和溶解度的變化[23]。當(dāng)超聲處理時間為50 min 時，表面疏水性又顯著增加（P＜0.05），但低于對照組，可能是由于長時間的超聲處理產(chǎn)生的空化和剪切作用促進了SP 大分子聚集體分解成小分子蛋白，從而暴露了部分內(nèi)部的疏水基團，而且超聲波使氣泡破裂，其過程中釋放的能量提供了疏水相互作用的能量[24]，使表面疏水性增加。

2.4 不同超聲處理時間對肌漿蛋白總巰基和游離巰基含量的影響

巰基是SP 的關(guān)鍵官能團，主要反映蛋白高級結(jié)構(gòu)的變化[25]。總巰基是指暴露在蛋白表面和包埋在蛋白內(nèi)部區(qū)域的巰基總和，而游離巰基是指暴露于蛋白表面的巰基[26]。不同超聲處理時間對牡蠣SP 總巰基與游離巰基含量的影響如圖4 和圖5所示。

圖4 超聲處理時間對肌漿蛋白總巰基含量的影響Fig.4 Effect of ultrasonic treatment time on total sulfhydryl content of sarcoplasmic proteins

圖5 超聲處理時間對肌漿蛋白游離巰基含量的影響Fig.5 Effect of ultrasonic treatment time on free sulfhydryl content of sarcoplasmic proteins

由圖4 可知，總巰基含量隨超聲處理時間的延長，呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，在0～20 min 無顯著變化，在30 min 時顯著下降，并在40 min 時達最低，為40.42 μmol/g。由于超聲波處理破壞了蛋白分子間的非共價相互作用，蛋白質(zhì)分子展開，內(nèi)部巰基基團暴露[27]，使游離巰基含量增加。同時游離巰基基團易被過氧化氫大量氧化，游離巰基氧化速率高于其暴露速率，最終導(dǎo)致總巰基含量降低。另外，超聲處理過程中產(chǎn)生的高剪切力易打斷分子之間的化學(xué)鍵，蛋白發(fā)生聚集變性，覆蓋一些巰基，使可檢測到的游離巰基含量減少，總巰基含量下降。當(dāng)超聲處理時間達50 min 時，總巰基含量明顯增加，但低于對照組。主要由于游離巰基氧化速率低于其暴露速率，導(dǎo)致總巰基含量上升。

由圖5 可知，游離巰基含量隨超聲處理時間的延長呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，在20 min 處開始顯著下降（P＜0.05），并在40 min 處達最小值，為9.46 μmol/g，由于超聲波處理使水分子中產(chǎn)生瞬態(tài)自由基，交叉反應(yīng)形成過氧化氫，過氧化氫將暴露的游離巰基不可逆地氧化為更穩(wěn)定的亞磺酸或磺酸，使游離巰基含量下降，同時干擾了分子間巰基-二硫鍵的交換[28]。當(dāng)超聲處理時間為50 min 時，游離巰基含量上升但低于對照組，可能由于長時間的超聲處理造成蛋白結(jié)構(gòu)進一步展開，內(nèi)部巰基暴露，使游離巰基增加。

2.5 不同超聲處理時間對肌漿蛋白二硫鍵含量的影響

二硫鍵對維持蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定具有重要作用[29]，同時也與蛋白的聚集和解離有關(guān)。不同超聲處理時間對牡蠣SP 二硫鍵含量的影響如圖6所示。

圖6 超聲處理時間對肌漿蛋白二硫鍵含量的影響Fig.6 Effect of ultrasonic treatment time on disulfide bond content of sarcoplasmic proteins

由圖6 可知，在0～30 min 內(nèi)隨著超聲處理時間的延長，二硫鍵含量無顯著變化；超聲處理40～50 min 時二硫鍵含量較前30 min 顯著降低（P＜0.05）。二硫鍵含量下降可能是由于在超聲過程中超聲波的空化現(xiàn)象產(chǎn)生的湍流、高剪切力使肌漿蛋白部分展開[30]，二硫鍵斷裂氧化形成巰基。由于超聲處理破壞了維持蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的二硫鍵，使得蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性降低。

2.6 不同超聲處理時間對肌漿蛋白濁度的影響

濁度可以反映蛋白的聚集程度、溶解性[31]，與粒徑大小密切相關(guān)。不同超聲處理時間對牡蠣SP 濁度影響如圖7所示。

圖7 超聲處理時間對肌漿蛋白濁度的影響Fig.7 Effect of ultrasound treatment time on turbidity of sarcoplasmic proteins

由圖7 可知，隨超聲處理時間的延長，濁度呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，在40 min 處達到最小值（2.353），與對照組相比降低了19.26%，可能是超聲處理過程中由于空化現(xiàn)象產(chǎn)生的高剪切力造成分子鍵的破壞，導(dǎo)致蛋白聚集體破裂并向小分子蛋白轉(zhuǎn)化，使蛋白質(zhì)顆粒變小，濁度降低，使顆粒的均勻性增加[32]。濁度在50 min處顯著上升（P＜0.05），可能是因為長時間的超聲處理，蛋白之間由于非共價相互作用發(fā)生一定程度的蛋白聚集，使?jié)岫壬摺?/p>

2.7 超聲處理時間對牡蠣SP 溶解性的影響

溶解性可以反映蛋白的變性和聚集程度，影響蛋白的功能特性[33]。不同超聲處理時間對牡蠣SP 溶解性的影響如圖8所示。

圖8 超聲處理時間對肌漿蛋白溶解性的影響Fig.8 Effect of ultrasonic treatment time on solubility of sarcoplasmic proteins

由圖8 可知，0～40 min 內(nèi)溶解性隨超聲處理時間的延長顯著上升（P＜0.05），并在40 min 處達到最大值（79.92%），比對照組升高了11.59%，當(dāng)超聲處理時間超過40 min 時，溶解性顯著下降（P＜0.05），但高于對照組。超聲產(chǎn)生的空化效應(yīng)與機械效應(yīng)使SP 的蛋白聚集體被解離為小分子片段，小分子片段具有更大的表面積和含量更高的極性基團，從而增加了蛋白與水分子的相互作用。一定時間的超聲處理也會使蛋白分子發(fā)生變性解聚，顆粒減小，濁度降低，導(dǎo)致蛋白質(zhì)與水之間形成氫鍵的機會增加，且水和蛋白質(zhì)之間的接觸面積增加[34]，使溶解性升高。另外，也有研究表明是由于疏水基團的含量降低，促進蛋白與水之間的親水基團交聯(lián)，促使溶解性增加[35]。但長時間的超聲處理，SP 的濁度增加，溶解性下降?？赡苁浅暡〞r間過長所產(chǎn)生的湍流力使蛋白分子之間的碰撞和聚集速度加快，使蛋白發(fā)生一定程度的聚集。此外，還可以推斷，SP 的溶解性與濁度和表面疏水性均呈負相關(guān)。

3 結(jié)論

通過對肌漿蛋白結(jié)構(gòu)和溶解性變化的分析，可以發(fā)現(xiàn)適當(dāng)?shù)某曁幚砜筛淖僑P 結(jié)構(gòu)并提高其溶解性。與對照組相比，一定時間的超聲處理可以穩(wěn)定內(nèi)源性熒光，降低表面疏水性、總巰基、游離巰基和二硫鍵含量，使?jié)岫冉档停芙庑栽黾?。結(jié)果表明，超聲處理使蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，二硫鍵的斷裂促進蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的伸展，使肌漿蛋白具有更好的溶解性，且試驗結(jié)果表明，溶解性與濁度和表面疏水性均成負相關(guān)。該論文為肌漿蛋白超聲處理的研究提供參考，并且為貝類蛋白的加工利用提供理論支持。