羅冬蘭,王小崗,瞿光凡,巴良杰

(貴陽學院,貴陽,550005)

李(PrunussalicinaLindl),屬于薔薇科(Rosaceae)李屬(Prunus)多年生核果類樹種。近年來,貴州的李種植面積逐漸增加[1-2],其栽培品種較多,主要有蜂糖李、四月李、玫瑰李、姜黃李、脆紅李、青脆李、布朗李、空心李、地方李等[3]。其中,蜂糖李果大甘甜,核小肉多,果面包裹天然蠟粉,質地酥脆爽口,果肉致密且香味濃郁,品質極優(yōu),市場售價高,經濟價值高[4]。蜂糖李采收于高溫多雨季節(jié),且果實含糖量高,采后呼吸代謝強,果實貯藏過程易受機械損傷和病原微生物侵染,易造成嚴重的經濟損失[5-6]。目前,國內外研究報道的李病害主要為褐腐病、炭疽病、黑霉病、黑斑病[3,7-9,10]。其中,美澳型褐腐病菌(Moniliniafructicola)、藤倉鐮刀菌(Fusariumfujikuroi)、互隔交鏈孢霉(Alternariaalternata)[11]、膠孢炭疽復合群(Colletotrichumgloeosporioidesspecies complex)和暹羅炭疽復合群(C.siamensespecies complex)[12]是李果實采后主要致病菌。此外,瞿光凡等[13]發(fā)現,引起脆紅李采后腐爛的病原菌為灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)和鏈格孢菌(Alternariaalternata)。王友升等[14]對“安哥諾”“黑琥珀”兩個李品種果實采后貯藏期病果進行分離鑒定,獲得李果實在貯藏期內的主要病原菌為串珠狀赤霉(Gibberellamoniliformis)、鏈格孢菌(Alternariaalternata)、草酸青霉(Penicilliumoxalicum)和塔賓曲霉(Aspergillustubingensis)。但關于蜂糖李采后病原菌研究未見相關報道。

香芹酚(carvacrol,CV)是天然植物精油中具有活性成分的一種單萜酚,具有廣譜抑菌性、安全性高、無污染等特性,被廣泛應用于果蔬采后保鮮[15]。已有大量研究表明,香芹酚可通過破壞真菌細胞膜、細胞壁以及能量代謝平衡,影響膜脂代謝和能量代謝途徑,從而發(fā)揮抗菌作用[16-17];此外,香芹酚還可通過抑制真菌DNA、RNA、脂類和蛋白質等生物合成、相關基因表達及阻遏真菌產毒基因表達,使相關代謝調控紊亂,最終使真菌細胞因不能正常進行生理代謝而凋亡[18-19]。

本研究通過對貯藏期蜂糖李病果病原菌進行分離鑒定,并進一步探究不同濃度香芹酚對病原菌的體外抑制效果及進行室內毒力評價,以期為蜂糖李采后病害防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蜂糖李果實:2023年6月采摘于安順市鎮(zhèn)寧布依族苗族自治縣六馬鎮(zhèn),七八成成熟。采后常溫放置至果面品質劣變,果面逐漸有絲狀物質且其生長面積逐漸擴大,最終腐爛發(fā)病(見圖1),再進行果面似菌物質分離鑒定。香芹酚(純度99%,分子量150):江西海瑞天然植物有限公司。引物ITS1和ITS4、DNA Marker C、DNA提取試劑盒、雙蒸水(ddH2O):生工生物工程(上海)股份有限公司。馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato dextroseagar,PDA):上海博微生物科技有限公司。

圖1 蜂糖李采后常溫狀態(tài)下自然發(fā)病狀況

1.2 儀器與設備

ChemiDoc免染型蛋白印跡成像系統(tǒng):成都百樂科技有限公司。CX21 光學顯微鏡:日本奧林斯有限公司。LRH-250F生化培養(yǎng)箱:上海一恒科學儀器有限公司。YM-50立式壓力蒸汽滅菌器:上海三申醫(yī)療器械有限公司。SW-CJ-1D型超凈工作臺:蘇州凈化設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 病原菌分離與純化 采用組織分離法對采后自然發(fā)病蜂糖李果實進行病原菌分離純化。首先將所有在無菌超凈工作臺上用到的金屬工具統(tǒng)一120 ℃高溫滅菌20 min,再進行下一步試驗。將病果置于75%酒精中浸泡30 s后取出,立即用無菌水沖洗3次并置于超凈工作臺中,待其自然晾干。用手術刀切取病健交界處組織放于PDA培養(yǎng)基中,于(28±0.5) ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待平板上長出不同的菌落形態(tài)時,進行不同種菌落形態(tài)純化,通常分離頻率約3次,可根據菌落生長狀況進行多次分離,直至得到單一菌落。純化菌株部分凍存,其余用于試驗。

1.3.2 病原菌形態(tài)學鑒定 將純化菌株以菌餅方式重新接種至新培養(yǎng)基,置于(28±0.5)℃恒溫培養(yǎng),并觀察菌株生長狀況以及菌落特征,拍照記錄。結合菌株在光學顯微鏡下菌絲、孢子梗及分生孢子的形態(tài)結構進行種屬初步鑒定。

1.3.3 病原菌致病性檢測 選取光澤度好、硬度適中、成熟健康無病蟲害及無機械損傷的果實,分別進行有傷(利用美工刀小刀片輕劃果實表面,形成大小約4 mm長的十字小口,再用孔徑為5 mm的打孔器,去除果皮,最后形成大小約5 mm的圓形傷口)和無傷接種法接種分離菌株后,觀察果實發(fā)病情況,以檢測分離菌株是否致病;經過人工將分離菌株轉導(利用直徑為5 mm的打孔器取若干菌餅,最后將菌餅接種至果實表面)至果實果皮,引發(fā)果實快速發(fā)病并出現不同程度發(fā)病現象,以檢測分離菌株致病性強弱。對挑選好的蜂糖李果實,用蒸餾水快速清洗表面1次,再75%酒精擦拭消毒,用無菌水沖洗3次后,置于超凈工作臺中,自然晾干,用直徑為5 mm無菌打孔器取菌餅接種,每種分離菌株重復3個果。接種后果實置于(25±0.5) ℃、相對濕度85%～95%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每天定時記錄發(fā)病情況。待果實發(fā)病后,再次進行病原菌分離純化,若與接種病原菌一致,則進行后續(xù)試驗。

1.3.4 病原菌ITS標記鑒定 取適量菌絲體于無菌研缽中,用液氮研磨至粉末狀待用。利用北京索萊寶真菌基因組DNA提取試劑盒進行病原菌基因組總DNA提取。采用真菌通用引物 ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和 ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)進行病原菌rDNA-ITS序列擴增。制作成50 μL反應體系,該體系需包含2×Taq PCR Master Mix 25 μL,DNA模板1 μL,10 mmoL/L ITS1 2 μL,10 mmoL/L ITS4 2 μL,ddH2O 20 μL。聚合酶鏈式反應(poly-merase chain reaction,PCR)擴增程序:94 ℃預變性3 min;94 ℃變性1 min,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,35個循環(huán);72 ℃終延伸10 min。對PCR產物進行測序,將測序結果在NCBI數據庫進行BLAST比對分析,獲取同源性高的菌株序列,采用MEGA 7軟件以鄰接法構建系統(tǒng)發(fā)育樹,并結合病原菌形態(tài)特征對其進行最終鑒定。

1.3.5 香芹酚對病原菌室內毒力測定 采用菌絲生長速率法進行測定。分別稱取不同質量香芹酚加入到滅菌PDA培養(yǎng)基中,充分搖勻,使每個平板PDA培養(yǎng)基中香芹酚濃度分別為100、150、200、250和300 μg/mL,對照(CK)不加香芹酚,待培養(yǎng)基冷卻后備用。在無菌超凈工作臺上,用直徑5 mm滅菌打孔器打取菌餅,接種到PDA平板中央。每個濃度重復3次。于(28±0.5) ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。定期觀察,待對照(CK)平板菌落長滿平板時,采用十字交叉法測量菌落直徑并記錄數據。抑菌率的計算公式如下:抑菌率/%=(對照組菌落直徑-處理組菌落直徑)/(對照組菌落直徑-菌餅直徑)×100。采用Excel 2021軟件以香芹酚濃度對數值為橫坐標,抑菌率為縱坐標,計算毒力方程。在Graph Pad prism 8 軟件中,將抑菌率轉變?yōu)楦怕手岛笞鳛榭v坐標,將質量濃度作為橫坐標,計算出半最大有效濃度(half-maximal effective concentration,EC50)。

2 結果與分析

2.1 病原菌形態(tài)學鑒定

從蜂糖李采后自然發(fā)病果實上分離的菌株,根據其在PDA培養(yǎng)基上的生長形態(tài)和在顯微鏡下孢子梗以及分生孢子形態(tài)特征(見圖2),可分為5種。其中,PL-1菌株,其菌落整體為淺棕色、中心部分呈現淡黃色,隨著菌落直徑擴大,顏色逐漸變淡,菌落邊緣處紫灰色較為明顯且菌絲短而稀疏。PL-2菌株,菌絲生長茂盛,菌絲較長、似棉花狀;菌落呈米白色,隨著生長時間增長,菌落會分泌似水珠液體。PL-3菌株,菌落較為稀疏且無規(guī)律性間隔,菌絲短而絨,菌落中間灰白色、外圍呈現灰綠色。PL-4菌株,菌落分布較為規(guī)律且均勻,菌絲呈現灰米白色,隨著菌落直徑不斷擴大,菌絲顏色逐漸變淡,菌絲由米白色變成淺灰色。PL-5菌株,菌落分布較為均勻,主要以圓形態(tài)均勻分布在培養(yǎng)皿中,呈現灰白色菌絲,菌絲極短似“粉末”狀。

圖2 蜂糖李采后自然發(fā)病果實各分離菌株的形態(tài)特征(菌落形態(tài)、孢子梗以及孢子形態(tài))

2.2 病原菌致病性檢測

從圖3可以看出,與其他4株菌相比,PL-1和PL-3創(chuàng)傷接種,48 h(2 d)后蜂糖李發(fā)病明顯,其中PL-1果實表面出現灰白色絨毛狀菌絲,菌絲發(fā)達、質地干燥易挑;但是,該菌無傷接種后第6天蜂糖李果實局部病變。由此可推斷,PL-1在傷口處發(fā)病較快,但是對無損傷的健康果實致病力較弱。PL-2致病力較弱,有傷接種48 h(2 d)后逐漸發(fā)病,在第4天時果實發(fā)病癥狀明顯且蜂糖李果實表皮開始破裂;無傷接種,在第6天果實局部褐變發(fā)病。PL-3經過創(chuàng)傷接種后果實發(fā)病,且發(fā)病與正常果實發(fā)病癥狀一致,即果皮裂開并伴有水漬;無傷接種果實也發(fā)病,但發(fā)病較為遲緩。PL-4創(chuàng)傷接種后,菌絲顏色和菌落特征和培養(yǎng)皿上一致,且隨著果實發(fā)病果皮裂開,果實逐漸變軟;無傷接種致病一致,但發(fā)病遲緩。PL-5無傷接種與創(chuàng)傷接種發(fā)病癥狀一致,創(chuàng)傷接種發(fā)病更快,接種部位出現凹陷并產生褐斑,且病斑面積隨培養(yǎng)時間加長而增大。綜上,蜂糖李采后貯藏過程中,完整無損的果面對果實整體具有一定保護作用,若被病原菌侵染發(fā)病較為遲緩,一旦果皮有傷口或劃痕將導致果實被外源病原菌快速侵染且發(fā)病較快,不利于果實貯藏。

圖3 蜂糖李采后自然發(fā)病果實分離菌株在健康果實上創(chuàng)傷或無損接種后的致病性

2.3 病原菌ITS鑒定

分離菌株用ITS基因通用引物擴增后,對PCR產物測序得到菌株核酸序列,在NCBI數據庫上進行BLAST,選取同源性較高的菌株序列用MEGA 7的Neighbor-Joining(NJ)法構建系統(tǒng)發(fā)育樹。結果表明,菌株PL-1與Moniliniapolystroma(基因登錄號:NR_154198.1)同源性100%,菌株PL-2與Bjerkanderaecuadorensis(基因登錄號:NR_174062.1)同源性99%,菌株PL-3與Penicilliumexpansum(基因登錄號:NR_077154.1)同源性100%,菌株PL-4與Flavodonambrosius(基因登錄號:NR_154000.1)同源性100%(如圖4-A所示)。菌株PL-5與Penicilliumitalicum(基因登錄號:NR_163528.1)同源性100%(如圖4-B所示)。結合形態(tài)學特征,判定引起蜂糖李采后腐爛的主要病原菌分別為多子座鏈核盤菌M.polystroma(PL-1)、煙管屬真菌B.ecuadorensis(PL-2)、擴展青霉P.expansum(PL-3)、黃囊孔菌F.ambrosius(PL-4)以及意大利青霉P.italicum(PL-5)。

圖4 蜂糖李采后自然發(fā)病果實分離菌株基于ITS序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 香芹酚對蜂糖李采后病原菌室內毒力

從表1可以看出,當香芹酚濃度在100～300 μg/mL范圍內時,對蜂糖李采后各病原菌的抑菌率分別為6.73%～80.21%、22.70%～60.66%、20.11%～80.07%、70.09%～91.19%以及65.61%～85.74%。其中,擴展青霉P.expansum對香芹酚較為敏感,而黃囊孔菌F.ambrosius對香芹酚較為遲鈍;300 μg/mL香芹酚對多子座鏈核盤菌M.polystroma和煙管屬真菌B.ecuadorensis菌絲生長的抑菌率差異無顯著性(p>0.05),其余菌之間均存在顯著性差異(p<0.05)。從毒力回歸方程及EC50可知,擴展青霉P.expansum對香芹酚的敏感性最高,EC50為52.4 μg/mL,其他依次為意大利青霉P.italicum、煙管屬真菌B.ecuadorensis、多子座鏈核盤菌M.polystroma、黃囊孔菌F.ambrosius,EC50分別為55.8、169.9、212.1和227.5 μg/mL。

表1 香芹酚對蜂糖李采后病原菌菌絲生長的體外抑制效果及毒力回歸方程

3 討論

蜂糖李是李屬的一種呼吸躍變型果實,多在夏季高溫季節(jié)采收,果實含水量高、皮薄,易受微生物侵染而腐爛變質,從而造成巨大經濟損失[20]。本研究從蜂糖李采后自然貯藏發(fā)病果實中分離鑒定出5株病原菌。其中,多子座鏈核盤菌M.polystroma最早發(fā)現于歐洲,隨后在意大利的梨、葡萄和蘋果中相繼被發(fā)現報道[21-24],Spitaler等[25]研究發(fā)現該菌還引起木瓜發(fā)生褐腐病,李志偉等[26]研究發(fā)現在桃果實生長發(fā)育期至成熟期和采后貯運期該菌均可侵染而引發(fā)褐腐病。擴展青霉P.expansum和意大利青霉P.italicum能夠引起新鮮核桃和柑桔發(fā)霉軟爛,發(fā)生青(綠)霉病,是果蔬常見的病原菌,嚴重影響果蔬品質[27-29]。李樹成等[30]從采后翠冠梨果實中分離鑒定獲得擴展青霉P.expansum是引起采后翠冠梨果實腐爛的主要病原菌之一。肖媛[31]鑒定出沙糖桔酸腐病的致病菌是意大利青霉P.italicum。煙管屬真菌B.ecuadorensis和黃囊孔菌F.ambrosius首次在蜂糖李果實中被發(fā)現。

多子座鏈核盤菌M.polystroma引起蜂糖李發(fā)生褐腐病。Goncalves等[32]研究發(fā)現用4.5%Copernicia cerifera蠟(巴西棕櫚蠟)對李果實進行涂膜,顯著降低了貯藏期李褐腐病的發(fā)生,有效維持了果實品質。凡先芳等[33]研究發(fā)現,將1-甲基環(huán)丙烯(1-methylcyclopropene,1-MCP)結合戊唑醇在適宜濃度下處理青脆李,能夠顯著控制貯藏期褐腐病的發(fā)生。本研究發(fā)現,在體外,香芹酚能夠抑制M.polystroma菌絲生長,且隨濃度呈現依賴性效應,當香芹酚濃度為300 μg/mL時,抑菌率可達80.21%。

通過對擴展青霉P.expansum抑制研究發(fā)現,70 mg/mL銀杏黃酮能較好地抑制擴展青霉生長[34]。咪鮮胺能夠提高細胞膜通透性,抑制P.italicum生長發(fā)育[35]。在研究中,隨著香芹酚濃度增加,P.expansum和P.italicum菌落生長均呈藥劑依賴性效應,300 μg/mL香芹酚對2株菌的抑菌率達91.19%和85.74%,能夠較好地抑制病原菌菌絲生長。有研究表明,香芹酚能夠有效抑制炭疽菌生長發(fā)育,損傷沖繩炭疽菌(Colletotrichumokinawense)菌絲形態(tài)并對其可溶性蛋白和呼吸能量代謝等具有一定影響,有效抑制真菌病原菌的菌絲生長[36];香芹酚處理降低楊梅果實腐爛指數,抑制楊梅致病菌霉菌和酵母菌生長[37]。100 μl/L的反式-2-己烯醛能較好抑制青霉生長,顯著降低擴展青霉P.expansum對獼猴桃果實硬度、可滴定酸、維生素C的影響,極顯著降低了染菌果實腐爛率,較好地保持了果實品質[38]。反式肉桂醛通過損傷意大利青霉Pitalicum細胞膜,導致核酸、蛋白質、鉀離子等細胞內容物質泄漏,破壞線粒體正常功能,引發(fā)線粒體介導的細胞凋亡,從而達到良好的抑菌效果[39]。

煙管屬真菌B.ecuadorensis和黃囊孔菌.ambrosius侵染蜂糖李果實后,病斑不斷擴大,嚴重時果皮裂開并伴有水漬,導致采后蜂糖李果實軟化褐變并腐爛衰敗。體外試驗表明,香芹酚對這2株菌具有明顯抑菌能力,300 μg/mL香芹酚的抑菌率分別為80.07%和60.66%,EC50分別為169.9和227.5 μg/mL,B.ecuadorensis對香芹酚較為敏感。在其他果實病原菌研究中,未見有關B.ecuadorensis和F.ambrosius的報道。

4 結論

采用組織分離法、致病性檢測、形態(tài)學鑒定結合分子生物學鑒定,明確引起蜂糖李采后貯藏期腐爛的病原菌包括擴展青霉Penicilliumexpansum、意大利青霉P.italicum、多子座鏈核盤菌Moniliniapolystroma、黃囊孔菌Flavodonambrosius和煙管屬真菌Bjerkanderaecuadorensis。采用菌絲生長速率法測定發(fā)現,香芹酚對這5株病原菌具有較好的抑制效果,當香芹酚濃度為300 μg/mL時,對5株菌抑菌率的依次為91.19%、85.74%、80.21%、60.66%和80.07%,其EC50依次為52.4、55.8、212.1、227.5和169.9 μg/mL。因此,天然植物精油香芹酚可作為蜂糖李采后貯藏期病害防控的一種有效防治藥劑。