顧佩佩,王 瑩,黃愛軍

(贛南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,江西贛州,341000)

夜來香花葉病毒(Telosmamosaicvirus,TeMV)是一種正義單鏈RNA病毒,為馬鈴薯Y病毒屬成員[1-2]。該病毒最早發(fā)現(xiàn)于夜來香Telosmacordata,可在寄主葉片上引起典型的花葉癥狀[3]。隨后發(fā)現(xiàn)TeMV也可侵染廣藿香Pogostemoncablin[4]、翅莢決明Sennaalata[5]、西番蓮(Passiflora)[6]等寄主并引起癥狀。特別是在西番蓮上,可引起嚴(yán)重的花葉、褶皺、畸形等癥狀,且該病毒可通過扦插、嫁接以及機(jī)械接種等途徑傳播,在田間具有較高發(fā)病率[7-8]。研究發(fā)現(xiàn),TeMV在我國廣西、福建、海南、廣東和貴州等5個西番蓮產(chǎn)區(qū)的田間檢出率均較高,福建和廣西的檢出率達(dá)到80%以上,在貴州不同縣(區(qū))甚至高達(dá)100%,該病毒已嚴(yán)重影響我國西番蓮產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展[9-10]。近年來,西番蓮在江西贛南地區(qū)的種植面積不斷擴(kuò)大,種植過程中也不斷遭受病毒病為害,TeMV在該地區(qū)田間檢出率也較高。本研究對前期采集的3個贛南地區(qū)TeMV分離物基因組全長進(jìn)行克隆測序及序列特征分析,以便為后續(xù)開展TeMV種群遺傳特征分析、病毒變異與進(jìn)化等研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

西番蓮病樣于2020年采自江西省贛州市尋烏縣、瑞金市及于都縣西番蓮種植園,病樣均表現(xiàn)出花葉、皺縮、畸形等典型病毒病癥狀。通過Potyvirus通用型抗體進(jìn)行ELISA檢測確定樣品感染馬鈴薯Y病毒,再以TeMV特異性檢測引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增[11]、克隆測序,確定病樣感染TeMV。感病植物樣品經(jīng)扦插成活后保存于實(shí)驗(yàn)室備用。摩擦接種試驗(yàn)所用豌豆、菜豆、黃瓜、番茄、辣椒、紅莧菜種子購自河北省泊頭市永紅種業(yè)有限公司,本生煙、莧色藜和紫果西番蓮種子為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑

Reagent Set for Potyvirus Group (Poty),96 testwells SRA 27200/0096,購自美國Agdia公司;RNA-easy Isolation Reagent、HiScript II One Step RT-PCR Kit、HiScript-TS 5′/3′ RACE Kit,購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司;TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit、pMDTM19-T Vector Cloning Kit、DH5α感受態(tài),購自寶生物工程(大連)有限公司;0.1 mol/L PBS為實(shí)驗(yàn)室自行配制。

1.3 方法

1.3.1 摩擦接種試驗(yàn)和RNA提取 將單獨(dú)感染TeMV的西番蓮葉片和0.1 mol/L PBS按1∶10質(zhì)量體積比(g/mL)研磨后,使用研磨物體分別摩擦接種豌豆、菜豆、黃瓜、番茄、辣椒、紅莧菜、本生煙、莧色藜和西番蓮實(shí)生苗,將摩擦接種0.1 mol/L PBS作為陰性對照,染病西番蓮葉片作為陽性對照;接種9 d后觀察葉片癥狀并采集新葉進(jìn)行病毒的ELISA和RT-PCR檢測。

總RNA提取:參照試劑RNA-easy Isolation Reagent說明書進(jìn)行總RNA提取,RNA于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 引物設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank中已報道的TeMV分離物(GenBank登錄號:MK340754、MK340755和MT557572)全基因組序列,利用軟件Oligo7分段設(shè)計擴(kuò)增TeMV江西分離物全長基因組的引物5對。根據(jù)測序拼接結(jié)果及GenBank中下載的參考序列設(shè)計5′、3′端RACE擴(kuò)增引物,引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。所用引物相關(guān)信息見表1。

表1 TeMV全基因組擴(kuò)增所用引物信息

1.3.3 基因組克隆與序列分析 RT-PCR反應(yīng)參照HiScript II One Step RT-PCR Kit說明書進(jìn)行。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后,依照TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit說明書純化目的條帶,純化產(chǎn)物與pMD19-T載體進(jìn)行連接后,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。挑選經(jīng)菌液PCR驗(yàn)證的陽性克隆送至蘇州金唯智生物科技有限公司測序,5′和3′端依照HiScript-TS 5′/3′RACE Kit說明書進(jìn)行擴(kuò)增。

測序結(jié)果利用DNAMAN軟件拼接后獲得分離物全長。TeMV其他分離物序列均下載于NCBI,運(yùn)用在線工具Pairwise Sequence Alignment(https://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/)進(jìn)行序列一致度分析,利用MEGA 7.0軟件進(jìn)行序列比對分析,以鄰接法(NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,Bootstrap值設(shè)置為1 000。

2 結(jié)果與分析

2.1 摩擦接種

實(shí)驗(yàn)室條件下,TeMV江西分離物可通過摩擦接種侵染本生煙、莧色藜、豌豆、菜豆和西番蓮,其中豌豆寄主為本研究首次發(fā)現(xiàn)。感染TeMV本生煙新葉表現(xiàn)出輕微黃化、卷葉癥狀;莧色藜和菜豆接種葉片出現(xiàn)過敏性壞死反應(yīng),莧色藜葉片出現(xiàn)由黃點(diǎn)到黃斑的壞死癥狀,菜豆葉片出現(xiàn)淺褐色小米粒大小的局部壞死斑;西番蓮新生葉片表現(xiàn)為花葉、皺縮和畸形;感染TeMV豌豆不表現(xiàn)任何癥狀(見圖1)。3個分離物在接種植物上產(chǎn)生的癥狀無明顯差異。

注:RT-PCR檢測中M為2 000 bp DNA marker,+為接種TeMV分離物,-為接種0.1 mol/L PBS,P為TeMV病樣,N為接種0.1 mol/L PBS,B為對照(空白)。圖1 TeMV江西分離物侵染寄主植物引起的葉片癥狀及病毒ELISA與RT-PCR檢測

2.2 TeMV江西分離物基因組結(jié)構(gòu)特征

所獲3個TeMV分離物分別命名為TeMV-XW、TeMV-RJ和TeMV-YD,除poly(A)尾外,序列長度均為10 069 nt,NCBI登錄號分別為ON932194、ON932195和ON932196。序列僅含1個編碼框,位于基因組190-9815 nt處,編碼1個3209 aa的多聚蛋白;經(jīng)水解酶切后形成成熟蛋白11個,即Pl、HC-Pro、P3、PIPO、6K1、CI、6K2、Vpg、NIa、NIb和CP。通過與其他TeMV分離物的氨基酸序列進(jìn)行比對,確定多聚蛋白的9個切割位點(diǎn),即EVHHY/S、HYRVG/G、DVQTQ/G、DVRLQ/S、TVRMQ/S、SVSTQ/G、FVKVE/S、AVKTQ/S和SVSLQ/S(見圖2)。

圖2 TeMV江西分離物基因組結(jié)構(gòu)及與其他分離物蛋白酶切位點(diǎn)的比較

2.3 TeMV江西分離物序列相似性與系統(tǒng)進(jìn)化分析

對TeMV分離物進(jìn)行序列一致性分析發(fā)現(xiàn),TeMV-XW、TeMV-RJ和TeMV-YD間的核苷酸及氨基酸序列一致性范圍分別為98.1%～98.6%和98.8%～99.3%;以上與GenBank中已報道的寄主植物為西番蓮的TeMV分離物間的核苷酸及氨基酸序列一致性范圍分別為87.3%～98.9%和91.2%～99.5%。3個分離物均與武夷山分離物(MK340755)序列一致性最高,與海南分離物(MG944249)序列一致性最低。

以西番蓮嚴(yán)重斑駁病毒(Passion fruit severe mottle virus,PFV)為外組,以不同寄主來源的TeMV分離物CP基因組序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn),所有分離物共聚為2個大組。3個江西分離物與7個寄主為西番蓮的分離物在一組(GroupⅠ),并與武夷山(MK340755)及越南分離物(MT557572)聚為一簇;寄主植物非西番蓮的分離物聚成一組(GroupⅡ),其中相同寄主來源的分離物各自聚集,表現(xiàn)出一定的寄主特異性(見圖3)。

圖3 基于病毒CP基因組序列構(gòu)建TeMV江西分離物與其他分離物的系統(tǒng)進(jìn)化樹

3 結(jié)論與討論

TeMV是近年來我國西番蓮上報道較多的病毒,侵染西番蓮后將影響其植株與果實(shí)的發(fā)育,從而降低其產(chǎn)量與品質(zhì)[12]。本研究首次獲得3條TeMV江西分離物全基因組序列,通過與其他地區(qū)不同寄主植物分離物的CP基因進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析,結(jié)果顯示TeMV各分離物在遺傳多樣性上與寄主來源有一定聯(lián)系,推測該病毒在侵染不同寄主過程中發(fā)生了遺傳變異,以適應(yīng)不同寄主環(huán)境。在西番蓮內(nèi)分離物變異較小,推測病毒可能是通過無性繁殖方式傳播,應(yīng)加強(qiáng)種苗監(jiān)測工作,防止病毒的進(jìn)一步蔓延。

本研究首次發(fā)現(xiàn)TeMV能夠侵染豆科作物豌豆,推測其在田間可能存在更多寄主。豆類作物在我國常與其他作物混種,這也為TeMV的傳播提供了便利,病毒一旦通過豆類傳播至其他作物,可能造成嚴(yán)重的產(chǎn)量損失。因此,后續(xù)應(yīng)加強(qiáng)TeMV在各類田間作物中的發(fā)生調(diào)查,確定其是否存在更廣的寄主范圍,從而為該病毒的防治提供科學(xué)依據(jù)。