應(yīng)支萍,李 彪,張 澳,王瑞麗,熊 智,施 蕊

(1 西南山地森林資源保育與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/昆明生態(tài)林業(yè)產(chǎn)業(yè)國(guó)際科技研發(fā)中心/西南林業(yè)大學(xué)園林與園藝學(xué)院,昆明,650224;2 玉溪三農(nóng)高原特色現(xiàn)代農(nóng)業(yè)有限責(zé)任公司,云南玉溪,652500)

澳洲堅(jiān)果(Macadamiaispp.)原產(chǎn)于澳大利亞,屬山龍眼科(Proteaceae)澳洲堅(jiān)果屬常綠喬木果樹[1]。20世紀(jì)70年代末我國(guó)開始進(jìn)行澳洲堅(jiān)果環(huán)境適應(yīng)性試驗(yàn),至今我國(guó)已成為世界上種植澳洲堅(jiān)果面積最大的國(guó)家[2],在我國(guó)廣東、廣西、云南、福建、四川、重慶及貴州等地均有種植[2]。澳洲堅(jiān)果果實(shí)主要由果皮、種殼和種仁組成[3],果仁為可食部分,占鮮果質(zhì)量1/2的青皮和占?xì)す|(zhì)量2/3的果殼為澳洲堅(jiān)果加工的副產(chǎn)物[4]。澳洲堅(jiān)果青皮少部分用作飼料,大部分作為廢棄物丟棄,青皮中蘊(yùn)藏的大量活性化合物基本未得到合理開發(fā)利用,導(dǎo)致資源浪費(fèi)。

澳洲堅(jiān)果果仁化學(xué)成分[5-7]、果殼利用[8-9]是目前國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn)。在果皮研究方面,張漢周等[3]測(cè)定果皮中P、K、Ca、Mg等礦質(zhì)元素含量發(fā)現(xiàn),變異幅度最大為P元素,最小為Ca元素;張明楷等[5]測(cè)定6個(gè)品種澳洲堅(jiān)果果皮中的主要功能成分含量發(fā)現(xiàn),自選品種“南亞2號(hào)”果皮中的粗蛋白、可溶性總糖和單寧含量最高;張明等[4]優(yōu)化了超聲輔助提取澳洲堅(jiān)果青皮總酚工藝條件等。有研究表明,澳洲堅(jiān)果青皮中含有豐富的酚酸類物質(zhì)。酚酸類化合物是一種以碳為基礎(chǔ)經(jīng)苯丙烷類代謝途徑合成的僅含1個(gè)苯環(huán)的次生代謝物[11],主要分為羥基苯甲酸類和羥基肉桂酸類兩類[12],廣泛存在于植物中。隨著對(duì)酚酸類化合物的研究深入,發(fā)現(xiàn)其中的阿魏酸具有抗氧化、抗腫瘤、消炎殺菌等多種藥理學(xué)作用[13],豆腐果苷具有抗抑郁、安神、鎮(zhèn)痛等作用[14];熊果苷可通過抑制人體內(nèi)絡(luò)氨酸酶形成來阻止黑色素生成,是當(dāng)今流行的較安全的美白原料,也是理想的皮膚美白祛斑活性劑,主要用于高級(jí)化妝品制備[15]等。酚酸類化合物不能由人和動(dòng)物體自身合成,只能從植物中提取,對(duì)澳洲堅(jiān)果果皮中酚酸類物質(zhì)組分及含量的研究鮮見報(bào)道。本研究以O(shè).C.澳洲堅(jiān)果為試材,探究不同發(fā)育時(shí)期其果皮酚酸類物質(zhì)組分及含量的變化情況,以期對(duì)澳洲堅(jiān)果果皮活性物質(zhì)開發(fā)和利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

在云南省永德縣大雪山鄉(xiāng)澳洲堅(jiān)果種植基地,北緯24°02′,東經(jīng)99°44′,O.C.澳洲堅(jiān)果選長(zhǎng)勢(shì)良好,葉片無病蟲害植株,分別采集花后30、60及90 d果實(shí),每個(gè)時(shí)期采集3株,即重復(fù)3次,用0 ℃冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室,洗凈并剝?nèi)」?青皮),分別標(biāo)記為S1、S2和S3樣品,液氮速凍后保存于-80 ℃超低溫冰箱備用。試劑包括甲醇Merck、乙腈Merck、標(biāo)準(zhǔn)品BioBioPha等,均為色譜純。儀器包括凍干機(jī),Scientz-100F;孔徑0.22 μm微孔濾膜;研磨儀,MM400,Retsch;色譜柱,Waters ACQUITY UPLC HSST3 C18( 1.8 μm,2.1 mm×100 mm);超高效液相色譜,Shim-pack UFLC SHIMADZU CBM30A;串聯(lián)質(zhì)譜,pplied Biosystems 4500 QTRAP等。

1.2 方法

S1、S2和S3樣品分別凍干機(jī)處理后,在研磨儀(30 Hz)中研磨1.5 min成粉末狀后稱取樣品(100±0.1) mg,在70%甲醇1.2 mL提取液中溶解,每間隔30 min渦旋1次,每次30 s,共6次后,放置于4 ℃冰箱中過夜;設(shè)置離心機(jī)轉(zhuǎn)速為12 000 rpm,離心過夜樣品10 min,提取上清液使用微孔濾膜過濾后,保存于樣瓶中備用。

利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)方法分析備用樣品代謝產(chǎn)物。液相條件:色譜柱,Agilent SB-C18 1.8 μm,2.1 mm×100 mm;A相,超純水+0.1%甲酸;B相,乙腈+0.1%甲酸;洗脫梯度,A相在0.00 min時(shí)比例為95%;0.00～9.00 min時(shí)比例從95%降至5%;在10.00～11.10 min時(shí),A相比例從5%升至95%;在11.10～14.00 min以95%平衡;流速0.35 mL/min;柱溫40 ℃;進(jìn)樣量4 μL。質(zhì)譜條件:電噴霧離子源(ESI),溫度550 ℃,電壓(IS)4 500～5 500 V,離子源氣體I(GSI)50,氣體II(GSII)60,簾氣(CUR)25.0 psi,碰撞誘導(dǎo)電離參數(shù)高。

1.3 數(shù)據(jù)分析

基于自建數(shù)據(jù)庫(kù)MWDB(metware database)和公共數(shù)據(jù)庫(kù)鑒別代謝物,在得到不同樣本的代謝物質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)后,用主成分分析(PCA)、聚類熱圖以及火山圖初步探析3個(gè)發(fā)育時(shí)期果皮的代謝特征,運(yùn)用多元分析處理軟件對(duì)差異代謝物進(jìn)行篩選和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 果皮差異代謝物的PCA圖及聚類熱圖

由圖1看出,樣本S1-3分布于第一象限,S3-2、S2-1、S2-2、S1-1分布于第二象限,S2-3、S3-3分布于第三象限,S3-1、S1-2分布于第四象限。其中S3樣本組內(nèi)分離較大,且S3樣本與前兩個(gè)時(shí)期樣本均出現(xiàn)聚攏現(xiàn)象,說明不同時(shí)期產(chǎn)生的代謝物有關(guān)聯(lián)性也有差異性。利用圖2聚類熱圖進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),S3-1與S1-2、S3-3與S2-3、S3-2與S2-1樣本中的代謝物質(zhì)關(guān)聯(lián)性較大,因此在S1與S3及S2與S3兩組處理中篩選差異代謝物。

注:S1、S2、S3分別表示花后30、60及90 d果實(shí)果皮(青皮)樣品。圖2至圖4同。圖1 不同發(fā)育時(shí)期澳洲堅(jiān)果果實(shí)果皮樣本代謝物主成分分析

注:深色表示含量高,淺色表示含量低。圖2 不同發(fā)育時(shí)期澳洲堅(jiān)果果實(shí)果皮樣本代謝物聚類

2.2 差異代謝物質(zhì)篩選

從3個(gè)不同發(fā)育時(shí)期果皮中共檢測(cè)到酚酸類差異代謝物114種,有56種物質(zhì)差異表達(dá)顯著。由圖3看出,將3個(gè)不同發(fā)育時(shí)期果皮樣品進(jìn)行兩兩分組試驗(yàn),樣品S1和S2對(duì)比,顯著差異代謝物有32種;相對(duì)S1而言,S2有25種成分呈下調(diào)表達(dá),7種成分呈上調(diào)表達(dá)。樣品S2和S3對(duì)比,顯著差異代謝物有32種,相對(duì)S2而言,S3有2種成分呈下調(diào)表達(dá),30種成分呈上調(diào)表達(dá)。樣品S1和S3對(duì)比,顯著差異代謝物有23種,相對(duì)S1而言,S3中有5種成分呈下調(diào)表達(dá),18種成分呈上調(diào)表達(dá)。說明花后30～60 d,呈下調(diào)表達(dá)的代謝物質(zhì)種類多,上調(diào)表達(dá)的代謝物質(zhì)種類較少;而花后60～90 d,上調(diào)表達(dá)的代謝物質(zhì)種類增多。

注:a為S1與S2對(duì)比,b為S2與S3對(duì)比,c為S1與S3對(duì)比。圖3 不同發(fā)育時(shí)期澳洲堅(jiān)果果實(shí)果皮差異代謝物火山圖

2.3 差異代謝物質(zhì)分析

2.3.1 共有顯著差異代謝物 由圖4看出,3個(gè)時(shí)期果皮樣品中共有顯著差異代謝物質(zhì)1種,根據(jù)韋恩圖各處理中差異代謝物分布發(fā)現(xiàn)該物質(zhì)為綠原酸(3-O-咖啡?？鼘幩?。該物質(zhì)S1中含量最高,達(dá)到188 328.50 μg/g,S2中含量最低。說明花后30～90 d,共同差異物--綠原酸 (3-O-咖啡?？鼘幩?含量呈先下降后上升。

注:3個(gè)圈重疊部分表示各處理間共有顯著差異代謝物數(shù)量,無重疊部分表示各處理特征差異代謝物數(shù)量。圖4 不同發(fā)育時(shí)期澳洲堅(jiān)果果實(shí)果皮代謝物差異韋恩圖(左)及綠原酸 (3-O-咖啡酰奎寧酸)含量比較(右)

2.3.2 特征代謝物分析 由表1看出,基于OPLS-DA模型所得VIP值≥1.0和FC值≥2.0 (上調(diào))或≤0.5 (下調(diào)),篩選不同處理間差異代謝物,得到主要功能物質(zhì)18種,它們?cè)诓煌瑫r(shí)期果實(shí)果皮中的相對(duì)含量不同。S1處理中1-O-對(duì)香豆酰-β-D-葡萄糖、綠原酸(3-O-咖啡?？鼘幩?、3,4,5-三甲氧基苯基-1-O-葡萄糖苷等含量最高。S3處理中熊果苷、水楊酸、龍膽酸、豆腐果苷、紅景天苷、3,4-二沒食子酰莽草酸、6′-咖啡酰熊果苷、原兒茶酸等含量最高;其中6′-咖啡酰熊果苷和3,4-二甲氧基肉桂酸為S3中標(biāo)志性物質(zhì)。熊果苷、熊果苷衍生物、水楊酸等物質(zhì)具有祛除黑色素,美白的作用,可作為美妝產(chǎn)品的加工原料;肉桂酸衍生物、龍膽酸、綠原酸、莽草酸及其衍生物等可用于抗菌、抗炎藥物開發(fā);豆腐果苷及其衍生物可作為抗抑郁的新型藥物原料;阿魏酸及其衍生物可用于開發(fā)制作保護(hù)大腦神經(jīng)元類藥物。

表1 不同發(fā)育時(shí)期澳洲堅(jiān)果果實(shí)果皮特征代謝物比較

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)通過代謝組學(xué)對(duì)花后3個(gè)時(shí)期的澳洲堅(jiān)果果實(shí)果皮酚酸類物質(zhì)進(jìn)行分析比較,共檢測(cè)到酚酸類代謝物114種,篩選出主要功能物質(zhì)18種。共有差異代謝物中,綠原酸 (3-O-咖啡?？鼘幩?、1-O-對(duì)香豆酰-β-D-葡萄糖、3,4,5-三甲氧基苯基-1-O-葡萄糖苷等含量在整個(gè)發(fā)育時(shí)期均較高,在不同樣品中含量從高到低依次為S1>S3>S2。熊果苷、豆腐果苷、6′-咖啡酰熊果苷、6′-對(duì)香豆酰熊果苷、沒食子苯乙酮、3,4-二甲氧基肉桂酸等在S3中含量較高;其中6′-對(duì)香豆酰熊果苷和3,4-二甲氧基肉桂酸為S3的標(biāo)志性化合物。

酚酸類物質(zhì)透過細(xì)胞膜進(jìn)入植物機(jī)體,從而改變某些酶活性和功能。綠原酸、咖啡酸、兒茶酚等能抑制植物磷酸化酶活性[37]。隨著果實(shí)發(fā)育,綠原酸等物質(zhì)含量降低,有利于其各種生理活動(dòng),如呼吸作用和光合作用等。1-O-對(duì)香豆酰-β-D-葡萄糖、3,4,5-三甲氧基苯基-1-O-葡萄糖苷在整個(gè)發(fā)育時(shí)期均為高含量,為生長(zhǎng)發(fā)育提供代謝原料。

本試驗(yàn)結(jié)果表明,不同發(fā)育時(shí)期澳洲堅(jiān)果果實(shí)果皮所產(chǎn)生的酚酸類代謝種類及含量不同,檢測(cè)到多種具有藥理作用的物質(zhì),而且含量較高,如熊果苷及熊果苷衍生物、豆腐果苷、豆腐果醇苷等。劉曉婷[19]等綜述了熊果苷的藥理作用及其機(jī)制,發(fā)現(xiàn)熊果苷有抑制黑色素、鎮(zhèn)痛抗炎抑菌、抗癌等藥理作用。劉萍等[51]研究表明,豆腐果苷及其衍生物具有止痛、鎮(zhèn)靜、抗炎、安眠、抗抑郁等藥理活性作用。有望從澳洲堅(jiān)果果實(shí)果皮中提取這些物質(zhì)并加以應(yīng)用,這為澳洲堅(jiān)果果皮的開發(fā)利用提供了新思路。