韋天立,陳慶師,劉淑林,吳金霞,鄒記興,謝少林**

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué),廣東廣州 510665;2.廈門大學(xué),福建廈門 361001)

近年來(lái),隨著養(yǎng)殖環(huán)境的日益惡化,水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物病害頻發(fā);同時(shí)由于傳統(tǒng)抗生素具有易殘留和產(chǎn)生耐藥性等缺點(diǎn),水生動(dòng)物食品安全備受人們的關(guān)注[1]。中草藥作為代替抗生素的一種選擇,具有一定的營(yíng)養(yǎng)、抗菌、抗病毒以及提高機(jī)體免疫力的作用[2]。牛大力是一味藥食兩用的中草藥,為豆科(Fabaceae Lindl.)蝶形花亞科(Papilionoideae)崖豆藤屬(MillettiaWight &Arn.)植物美麗崖豆藤(MillettiaspeciosaChamp.,MSP)的干燥根,別名九龍串珠、甜牛大力、山蓮藕、牛古大力等,主要分布于廣西、廣東、海南等地[3]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明MSP具有提高抗氧化能力[4-9]、抗應(yīng)激[10]、抗疲勞[11]、抗腫瘤[12]、保肝[13-15]以及降低血糖[16]的作用,由于其經(jīng)濟(jì)營(yíng)養(yǎng),人們更是將其做成膳食用來(lái)強(qiáng)身健體[17,18]。目前,牛大力中草藥研究主要集中在對(duì)小鼠免疫和疾病等方面的影響。斑馬魚(yú)(Daniorerio)作為一種常見(jiàn)的動(dòng)物模型,近年來(lái)被廣泛用于藥物研究[19]?；诖?本研究將MSP水提物通過(guò)浸浴的方式添加到斑馬魚(yú)的養(yǎng)殖水體中,探討MSP對(duì)斑馬魚(yú)抗氧化和免疫能力的影響,為MSP在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 MSP水提物提取

MSP購(gòu)買于廣州海王星辰藥店,MSP水提物的提取參考文獻(xiàn)[20],具體方法如下:準(zhǔn)確稱取MSP 10 g,切成小碎塊,以20倍體積量的雙純水100 ℃回流煎煮1 h,煎煮完將溶液倒出,重復(fù)提取1次,合并兩次所得濾液,濃縮為生藥量的1/10 (g/mL),于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)的基礎(chǔ)飼料為每日孵化的鮮活豐年蟲(chóng),試驗(yàn)所用斑馬魚(yú)為3月齡野生型斑馬魚(yú),養(yǎng)殖試驗(yàn)開(kāi)始前暫養(yǎng)10 d。將300尾健康斑馬魚(yú)[體長(zhǎng)(3.0±0.2)cm,體質(zhì)量(0.50±0.05) g]隨機(jī)分為5組,參考周楚瑩等[15]的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行濃度設(shè)置,設(shè)置0(空白對(duì)照組)、5、15、25和35 mg/L MSP水提物試驗(yàn)組,每組60尾并設(shè)置3個(gè)平行,每個(gè)平行20尾,分別放置于含3 L水的玻璃缸(20 cm×20 cm×15 cm)中進(jìn)行試驗(yàn)。斑馬魚(yú)飼養(yǎng)用水為養(yǎng)殖過(guò)濾水,水溫控制在26-28 ℃,溶氧6.5-7.0 mg/L,同時(shí)24 h增氧,每天換水量為2/3(水體積);試驗(yàn)過(guò)程中采用自然光照。所有組均投喂豐年蟲(chóng),每天投喂量為魚(yú)體總質(zhì)量的5%,早上9:00和下午5:00投喂,每天下午飼喂完試驗(yàn)組后加入相應(yīng)濃度的MSP水提物,試驗(yàn)共進(jìn)行14 d。

1.3 樣品采集與攻毒試驗(yàn)

養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后,禁食24 h,每個(gè)平行處理組隨機(jī)選取9尾魚(yú),冰上麻醉之后,用無(wú)菌無(wú)酶的采樣工具采集肝臟、腸道和腦組織,分別放入無(wú)菌無(wú)酶的1.5 mL離心管中,其中肝臟和腸道1尾1個(gè)樣,腦組織3尾混為1個(gè)樣,置于液氮速凍2 h后,于-80 ℃保存用于之后的分子實(shí)驗(yàn);另取魚(yú)的肝臟和腸道,均為3尾混為1個(gè)樣,分別置于無(wú)菌無(wú)酶的1.5 mL離心管中,存于-20 ℃冰箱中,用于測(cè)定組織的抗氧化酶活力。

采樣結(jié)束后,從每個(gè)平行處理隨機(jī)選取10尾斑馬魚(yú),每組合計(jì)為30尾魚(yú),進(jìn)行嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)攻毒試驗(yàn)。致病性嗜水氣單胞菌由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋學(xué)院水產(chǎn)養(yǎng)殖系提供。菌種用LB培養(yǎng)基在28 ℃搖床培養(yǎng)24 h,復(fù)壯2次后將菌體以4 000 r/min離心10 min,用生理鹽水清洗收集到的沉淀菌體,再進(jìn)行梯度稀釋,稀釋后的濃度為預(yù)試驗(yàn)確定的半致死濃度4.2×108CFU/mL。攻毒試驗(yàn)采用斑馬魚(yú)尾部創(chuàng)傷感染的方法,將創(chuàng)傷后的斑馬魚(yú)放進(jìn)半致死濃度的嗜水氣單胞菌菌液中,感染3 min后轉(zhuǎn)入飼養(yǎng)缸中,感染期間不間斷充氣、每天換1/2體積的水。每6 h觀察一次,及時(shí)撈出死魚(yú),記錄和統(tǒng)計(jì)各組死魚(yú)的數(shù)量,攻毒試驗(yàn)共進(jìn)行7 d。

1.4 組織生理生化指標(biāo)測(cè)定

采用相應(yīng)的試劑盒(南京建成生物工程研究所有限公司)檢測(cè)腸道和肝臟組織總抗氧化能力(Total Antioxidant Capacity,T-AOC)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)的含量,以及超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)、溶菌酶(Lysozyme,LZM)的活性,試驗(yàn)步驟按試劑盒的操作說(shuō)明進(jìn)行。

1.5 組織免疫基因表達(dá)測(cè)定

利用Trizol試劑(杭州艾科瑞生物科技有限公司)提取斑馬魚(yú)的肝臟、腸道和腦組織總RNA,用EvoM-MLV反轉(zhuǎn)錄預(yù)混型試劑盒(杭州艾科瑞生物科技有限公司)將提取的RNA轉(zhuǎn)錄成cDNA,接著用SYBR GreenProTaqHS預(yù)混型q-PCR試劑盒(杭州艾科瑞生物科技有限公司)以β-actin為參照基因檢測(cè)白細(xì)胞介素-1 (Interleukin-1)、腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factor α)、溶菌酶、防御素(Defensins)、核轉(zhuǎn)錄因子κB(Nuclear factor κB)、補(bǔ)體(Complement)、干擾素(Interferon)等基因(分別簡(jiǎn)寫為il-1β、tnf-α、lyz、defbl1、nfκb、c3a、ifnγ)的相對(duì)表達(dá)量,引物序列如表1。

表1 熒光定量PCR引物序列

續(xù)表

1.6 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用SPSS Statistics 19.0軟件通過(guò)單因素方差分析(Duncan多重比較法)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,P<0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

存活率(%)=(存活尾數(shù)/總尾數(shù))×100%,免疫保護(hù)率(%)=[(空白對(duì)照組死亡數(shù)-藥物實(shí)驗(yàn)組死亡數(shù))/空白對(duì)照組死亡數(shù)]×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 MSP水提物對(duì)斑馬魚(yú)生理生化指標(biāo)的影響

不同濃度MSP水提物對(duì)斑馬魚(yú)腸道和肝臟生理生化指標(biāo)的影響見(jiàn)表2。腸道SOD的活性在5 mg/L和15 mg/L組均顯著高于空白對(duì)照組(P<0.05),分別比對(duì)照組提高60%和192%,35 mg/L組顯著低于空白對(duì)照組(P<0.05);腸道MDA的含量在5 mg/L組和空白對(duì)照組間有顯著性差異(P<0.05),其余各組影響較小;腸道LZM的活性隨著MSP水提物濃度的增大整體上先降低后增高,在5、15、25 mg/L組均顯著低于空白對(duì)照組,35 mg/L組顯著高于空白對(duì)照組(P<0.05)。肝臟SOD的活性在25 mg/L組顯著高于空白對(duì)照組(P<0.05),比空白對(duì)照組提高581%;肝臟LZM的活性在25 mg/L組最低,和空白對(duì)照組間有顯著性差異(P<0.05);各濃度MSP水提物試驗(yàn)組中肝臟T-AOC均高于空白對(duì)照組,在25 mg/L組有顯著性差異(P<0.05),高出空白對(duì)照組16倍。

表2 斑馬魚(yú)的組織生理生化指標(biāo)

2.2 MSP水提物對(duì)斑馬魚(yú)免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響

2.2.1 MSP水提物對(duì)斑馬魚(yú)腸道部分免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響

斑馬魚(yú)腸道部分免疫相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量如圖1所示。從圖1可知,tnf-α的相對(duì)表達(dá)量在5 mg/L和25 mg/L組中均顯著高于空白對(duì)照組(P<0.05);nfκb的相對(duì)表達(dá)量在25 mg/L組顯著高于空白對(duì)照組(P<0.05),35 mg/L組顯著低于空白對(duì)照組(P<0.05),其余各組影響不大;defbl1的相對(duì)表達(dá)量隨著MSP水提物濃度的增加整體上先升高后降低,其中5、15、25 mg/L組均與空白對(duì)照組有顯著性差異(P<0.05);各濃度MSP水提物試驗(yàn)組斑馬魚(yú)腸道lyz的相對(duì)表達(dá)量均高于空白對(duì)照組,其中5、25、35 mg/L組均顯著高于對(duì)照組(P<0.05);il-1β的相對(duì)表達(dá)量在5 mg/L和35 mg/L組均顯著高于空白對(duì)照組(P<0.05);c3a的相對(duì)表達(dá)量除了15 mg/L組其余均顯著低于空白對(duì)照組(P<0.05),同時(shí)整體上呈現(xiàn)出隨著MSP水提物濃度的增高而不斷降低的趨勢(shì)。

Different letters superscripted on different groups of the same gene indicate significant differences (P<0.05).

2.2.2 MSP水提物對(duì)斑馬魚(yú)肝臟部分免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響

斑馬魚(yú)肝臟部分的免疫相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量如圖2所示。從圖2可知,各濃度MSP水提物試驗(yàn)組斑馬魚(yú)肝臟tnf-α的相對(duì)表達(dá)量均高于空白對(duì)照組,在5 mg/L組和空白對(duì)照組間有顯著性差異(P<0.05);nfκb的相對(duì)表達(dá)量和空白對(duì)照組差異不大;defbl1的相對(duì)表達(dá)量在5 mg/L和35 mg/L組均顯著高于空白對(duì)照組(P<0.05);lyz的相對(duì)表達(dá)量在25 mg/L組顯著高于空白對(duì)照組(P<0.05),其余各組均低于空白對(duì)照組;il-1β的相對(duì)表達(dá)量在25 mg/L和35 mg/L組均顯著高于空白對(duì)照組(P<0.05);c3a的相對(duì)表達(dá)量整體上呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì),在5 mg/L組顯著高于空白對(duì)照組(P<0.05)。

Different letters superscripted on different groups of the same gene indicate significant differences (P<0.05).

2.2.3 MSP水提物對(duì)斑馬魚(yú)大腦部分免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響

斑馬魚(yú)大腦部分免疫相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量如圖3所示。tnf-α的相對(duì)表達(dá)量隨MSP濃度的增加而上調(diào),同時(shí)在15 mg/L和35 mg/L組相對(duì)表達(dá)量均顯著上調(diào)(P<0.05);nfκb的相對(duì)表達(dá)量在35 mg/L組顯著高于空白對(duì)照組(P<0.05);和空白對(duì)照組相比,defbl1在25 mg/L組相對(duì)表達(dá)量最低,35 mg/L組相對(duì)表達(dá)量最高(P<0.05);ifny的相對(duì)表達(dá)量均高于空白對(duì)照組,在5、25、35 mg/L組均顯著高于空白對(duì)照組(P<0.05);il-1β的相對(duì)表達(dá)量在5 mg/L和15 mg/L組均高于空白對(duì)照組;c3a的相對(duì)表達(dá)量呈現(xiàn)平緩上調(diào)的趨勢(shì),在35 mg/L組顯著高于空白對(duì)照組(P<0.05)。

Different letters superscripted on different groups of the same gene indicate significant differences (P<0.05).

2.3 MSP水提物對(duì)斑馬魚(yú)感染嗜水氣單胞菌的保護(hù)率

由表3可知,所有試驗(yàn)組斑馬魚(yú)的存活率隨MSP水提物濃度的增加而提高,35 mg/L組的存活率(67%)最高。斑馬魚(yú)攻毒免疫保護(hù)率隨MSP水提物濃度的增加而不斷提高,35 mg/L組的免疫保護(hù)率最高,為28.6%。

表3 試驗(yàn)組和空白對(duì)照組斑馬魚(yú)攻毒后的存活率

3 討論

3.1 MSP水提物可以提高斑馬魚(yú)組織的抗氧化能力

氧化應(yīng)激反應(yīng)是指體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡,傾向于氧化,機(jī)體所做出的反應(yīng)。T-AOC是指各種抗氧化物質(zhì)和抗氧化酶等構(gòu)成的總抗氧化水平。SOD是動(dòng)物機(jī)體一種較為重要的抗氧化酶,可通過(guò)清除生物體內(nèi)的自由基來(lái)增強(qiáng)機(jī)體免疫力[21]。MDA是氧化應(yīng)激過(guò)程產(chǎn)生的代表性毒性中間產(chǎn)物,其含量過(guò)高會(huì)損傷細(xì)胞[22]。LZM屬于非特異性免疫因子,是一種能水解病原微生物細(xì)胞壁中黏多糖的堿性酶,對(duì)動(dòng)物腸道有免疫屏障的作用[23]。研究表明,在飼料中添加中草藥可以提高牙鲆(Paralichthysolivaceus)[24]、虹鱒(Oncorhynchusmykiss)[25]以及草魚(yú)(Ctenopharyngodonidella)[26]組織的SOD、LZM活性和T-AOC,使魚(yú)機(jī)體的抗氧化能力得到提高。研究表明牛大力具有抗氧化能力,主要是通過(guò)其所含的多糖、總黃酮、多酚等化學(xué)成分清除自由基來(lái)實(shí)現(xiàn)[27,28]。本研究中,MSP水提物試驗(yàn)組斑馬魚(yú)腸道和肝臟中的SOD活性顯著高于空白對(duì)照組,同時(shí)35 mg/L組斑馬魚(yú)腸道中的MDA含量低于空白對(duì)照組,LZM活性在高濃度MSP水提物組顯著提高,肝臟的T-AOC高于空白對(duì)照組,表明MSP水提物能提高斑馬魚(yú)的抗氧化能力,增強(qiáng)斑馬魚(yú)應(yīng)對(duì)外界應(yīng)激的能力。

3.2 MSP水提物通過(guò)調(diào)控斑馬魚(yú)的相關(guān)免疫基因增強(qiáng)其免疫力

tnf-α在炎癥反應(yīng)、細(xì)胞免疫、腫瘤免疫、低氧及血脂異常等多種生理和病理過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[29]。il-1β是多功能細(xì)胞因子之一,參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)、細(xì)胞生長(zhǎng)和組織修復(fù)等多項(xiàng)生理過(guò)程[30]。nfκb在細(xì)胞的炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答等過(guò)程中起到關(guān)鍵性作用[31,32]。defbl1是一組在宿主先天性免疫防御中發(fā)揮重要作用的小抗菌肽,是許多物種先天免疫系統(tǒng)的一部分;過(guò)表達(dá)的defbl1能抑制病毒感染和上調(diào)宿主免疫相關(guān)基因的表達(dá)[33]。補(bǔ)體C3為補(bǔ)體系統(tǒng)中含量最高的成分,在C3轉(zhuǎn)化酶的作用下,其裂解成c3a和c3b兩個(gè)片段,在先天性免疫中有重要的作用[34,35]。ifnγ作為驅(qū)動(dòng)細(xì)胞免疫的關(guān)鍵參與者,主要通過(guò)增強(qiáng)抗原加工和呈遞、增加白細(xì)胞運(yùn)輸,誘導(dǎo)抗病毒狀態(tài),增強(qiáng)抗微生物功能以及影響細(xì)胞增殖和凋亡來(lái)發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)作用[36]。藥理學(xué)研究表明MSP具有調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的能力,主要是通過(guò)調(diào)節(jié)腸道微生物群落的多樣性,進(jìn)而增強(qiáng)腸道健康來(lái)實(shí)現(xiàn)[37,38]。本研究中,高濃度MSP水提物干預(yù)可上調(diào)斑馬魚(yú)組織中的tnf-α、il-1β、nfκb、defbl1、ifnγ、lyz、c3a的相對(duì)表達(dá)量,特別是,在腸道中25 mg/mL組的大部分免疫相關(guān)基因顯著性高于空白對(duì)照組;在肝臟中25 mg/mL MSP水提物試驗(yàn)組也有類似的趨勢(shì),表明MSP水提物主要是通過(guò)腸-肝軸調(diào)節(jié)斑馬魚(yú)的免疫應(yīng)答能力。而在腦組織中,35 mg/mL MSP水提物試驗(yàn)組對(duì)tnf-α、nfκb、il-1β、c3a、ifnγ、defbl1的調(diào)節(jié)較其他濃度MSP水提物組更顯著,表明高濃度的MSP水提物可能通過(guò)血腦屏障產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)作用。此外,MSP水提物對(duì)斑馬魚(yú)感染嗜水氣單胞菌的保護(hù)試驗(yàn)也表明MSP水提物對(duì)斑馬魚(yú)具有一定的保護(hù)效果,這可能是MSP水提物干預(yù)后顯著上調(diào)相關(guān)免疫調(diào)節(jié)因子,有效提高了斑馬魚(yú)的免疫力,從而抵抗外界病菌的侵入。

4 結(jié)論

本研究中,MSP水提物對(duì)斑馬魚(yú)的組織生化指標(biāo)、免疫基因的表達(dá)量和抗嗜水氣單胞菌感染的能力具有明顯的改善作用,能夠增強(qiáng)斑馬魚(yú)的抗氧化和免疫能力。