廖明麗,李爭△,高晗,李亞楠,田方,李軍山,2(.神威藥業(yè)集團有限公司,河北 石家莊 05430;2.云南神威施普瑞藥業(yè)有限公司,云南 楚雄 675099)
蒺藜藥材來源于蒺藜科植物蒺藜Tribulus terrestris L.的干燥成熟果實,味辛、苦,性微溫,有小毒,歸肝經(jīng),能平肝解郁,活血祛風(fēng),明目,止癢[1]。蒺藜含有甾體皂苷、黃酮、多糖、生物堿、氨基酸等成分,以甾體皂苷為主,也是主要的藥效成分[2-4]。有研究證實蒺藜皂苷治療心血管疾病具有明確療效[5],此外,還具有降血糖[6]、抗菌、抗腫瘤、性強壯等作用[7],研究多以蒺藜皂苷元為指標(biāo)進行考察[8-9]。蒺藜皂苷D屬于蒺藜皂苷,有報道稱蒺藜皂苷D能抑制腫瘤細胞生長并促進其凋亡[10],還可改善銀屑病皮損處的炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)[11],關(guān)于蒺藜中蒺藜皂苷D的含量測定方法報道較少,有文獻報道過該成分的含量測定方法,但供試品制備方法極為復(fù)雜,需先回流提取、再經(jīng)過大孔樹脂柱進行洗脫[12-13]。本次研究圍繞簡化藥材中蒺藜皂苷D含量測定中供試品的制備方法,建立高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法(HPLC-ELSD)測定蒺藜中蒺藜皂苷D含量的方法,旨在為更好、更方便地控制蒺藜質(zhì)量提供可靠的依據(jù)。具體報道如下。
1.1 儀器 Agilent 1260高效液相色譜儀(美國安捷倫科技公司),Alltech ELSD-6000型蒸發(fā)光散射檢測器(美國奧泰科技公司),Sartorius CPA225D型分析天平(德國賽多利斯公司),KH7200DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)。
1.2 試藥 蒺藜皂苷D對照品(批號:112022-201601),購自中國食品藥品檢定研究院,含量以95.3%計。
蒺藜藥材:采購于內(nèi)蒙、遼寧、吉林等不同的產(chǎn)地,藥材經(jīng)原河北省藥品醫(yī)療器械檢驗研究院孫寶惠老師鑒定為蒺藜科植物蒺藜Tribulus terrestris L.的干燥成熟果實。
2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性 采用的色譜柱為InertSustain C18(250×4.6mm,5μm),以乙腈-水(45∶55)為流動相,柱溫為30℃,流速1.0mL/min,使用ELSD-6000型蒸發(fā)光散射檢測器,進樣量為20μL。理論板數(shù)按蒺藜皂苷D峰計算應(yīng)不低于3000。
2.2 對照品溶液制備 取蒺藜皂苷D對照品適量,精密稱定,加60%甲醇制成每1mL含51.5μg的溶液,搖勻,即得。
2.3 供試品溶液制備 取本品粉末(過三號篩)約1g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密量取60%甲醇10mL加入,稱定重量,超聲處理(功率250W,頻率40kHz)30分鐘,放冷,再稱定重量,用60%甲醇補足減失的重量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。
按照以上色譜條件,蒺藜皂苷D與相鄰峰分離度符合要求,見圖1。
圖1 HPLC圖譜。注:A.蒺藜皂苷D對照品;B.供試品
2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取配制好的濃度為51.5μg/mL的蒺藜皂苷D對照品溶液,分別取4μL、6μL、10μL、15μL、20μL注入液相色譜儀,按“2.1”項下色譜條件進行測定,以峰面積(A)的對數(shù)為縱坐標(biāo)y,進樣質(zhì)量(m)的對數(shù)為橫坐標(biāo)x,作線性回歸分析,得回歸方程為Ln(A)=0.5395Ln(M)-6.212,r=0.9996,見表1。實驗結(jié)果證明,蒺藜皂苷D進樣質(zhì)量在0.206-1.030μg范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。
2.5 精密度試驗 精密吸取“2.2”項下的對照品溶液10μL,按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6針,記錄峰面積,見表2。
表2 精密度試驗
2.6 重復(fù)性試驗 取同一藥材樣品粉末6份,按“2.3”項下的方法進行供試品溶液制備,按“2.1”項下色譜條件進行測定,見表3,結(jié)果證明,本方法的重復(fù)性良好。
表3 重復(fù)性試驗
2.7 回收率試驗 稱取已知含量的藥材樣品粉末(0.0209%)約0.5g,分別精密稱定6份,置10mL容量瓶中,精密量取濃度為0.103mg/mL蒺藜皂苷D對照品溶液各1mL加入,加60%甲醇適量,超聲處理(功率250W,頻率40kHz)30分鐘,放冷,用60%甲醇定容至刻度,濾過,取續(xù)濾液,即得。計算加樣回收率,見表4,結(jié)果證明本方法回收率良好。
表4 回收率試驗
2.8 穩(wěn)定性試驗 精密吸取供試品的溶液20μL,每五個小時進樣一次,共五次,記錄峰面積,見表5,由結(jié)果可知,供試品溶液中蒺藜皂苷D在20小時內(nèi)穩(wěn)定。
表5 穩(wěn)定性試驗
2.9 藥材含量測定 精密稱取6批藥材樣品,各平行2份,按“2.3供試品溶液制備”項下的方法進行供試品溶液制備,進樣量為20μL,按“2.1”項下色譜條件進行測定,計算含量測定結(jié)果,見表6。
表6 各產(chǎn)地藥材含量測定結(jié)果
文獻已報道的蒺藜藥材中的蒺藜皂苷D含量測定供試品的制備方法,操作較繁瑣,難重現(xiàn)。本實驗藥材供試品的制備方法為使用60%甲醇溶液,進行超聲處理30分鐘,提取效果最佳,處理過程簡單,使準(zhǔn)確度增加,大大節(jié)省了供試品的制備時間,節(jié)約了成本,降低了能耗。
從6份不同樣品的蒺藜藥材中蒺藜皂苷的含量測定結(jié)果看,各產(chǎn)地差異較大,遼寧產(chǎn)地優(yōu)于其他兩個產(chǎn)地,推測與產(chǎn)地相關(guān),還有可能與藥材性狀、采收、產(chǎn)地加工等相關(guān)[14],藥材樣品中有顏色深淺的區(qū)別,遼寧產(chǎn)地藥材性狀明顯優(yōu)于其他產(chǎn)地。
有報道測定蒺藜皂苷的含量多采用蒸發(fā)光散射檢測器[15],蒺藜皂苷D無紫外吸收,故本研究采用了蒸發(fā)光散射檢測器,對蒺藜皂苷D有通用響應(yīng),建立了蒺藜皂苷D的含量測定方法。HPLCELSD法準(zhǔn)確、簡便、靈敏,精密度、重復(fù)性、回收率及線性關(guān)系良好,可適用于蒺藜藥材中蒺藜皂苷D的含量測定。