宋偉,朱晉升,彭絮,代蕾穎（北京市醫(yī)療器械檢驗研究院（北京市醫(yī)用生物防護裝備檢驗研究中心）,北京 101111）

堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）是廣泛分布于人體肝臟、骨骼、腸、腎和胎盤等組織經(jīng)肝臟向膽外排出的一種酶。臨床上測定堿性磷酸酶主要用于骨骼、肝膽系統(tǒng)疾病的診斷和鑒別診斷，尤其是黃疸的鑒別診斷。為了加強對堿性磷酸酶測定試劑盒（以下簡稱ALP試劑盒）的監(jiān)督管理，規(guī)范市場秩序，保障產(chǎn)品使用的安全性及有效性，我單位根據(jù)《北京市2021年藥品、醫(yī)療器械、化妝品質(zhì)量抽查檢驗工作實施方案》，對ALP試劑盒進行抽查檢驗，并通過對不符合項目探索性研究，以期發(fā)現(xiàn)質(zhì)量安全風險點，為質(zhì)量安全保障提供建議。

1 質(zhì)量抽查檢驗情況

1.1 儀器與試劑 儀器：全自動生化分析儀（型號7180，日立公司）。

試劑：本次抽驗，我單位共收到來自10家受檢單位的11批次試劑（雙試劑，NPP底物-AMP緩沖液法），試劑說明書聲稱均可適用于7180生化分析儀平臺。

樣品：受檢單位提供此次抽驗活動所需的配套校準品、質(zhì)控品、重復性樣品及比對試劑系統(tǒng)、標準物質(zhì)、回收試驗樣品、臨床樣品。

1.2 檢驗依據(jù)與方法 按照受檢單位提供的技術要求、上機參數(shù)，對ALP試劑盒進行檢驗，檢驗項目包括準確度及重復性。試驗中操作步驟嚴格按照試劑說明書進行。

1.3 檢驗結果

1.3.1 重復性 評價試劑在測量條件相同的情況下，短時間內(nèi)重復測量同一樣本所得結果一致性的水平。結果用變異系數(shù)CV表示，CV越小，表示一致性水平越好。此次抽驗，11批次試劑CV結果在0.3%-1.5%范圍內(nèi)，滿足“CV小于5%”的技術要求，符合要求率100%。

1.3.2 準確度 評價試劑測量樣本所得結果與真值間的一致程度。受檢單位提供的技術要求中準確度評價方法有以下3種：①相對偏差法：測試有證標準物質(zhì)，計算所得結果與標準物質(zhì)認定值之間的相對偏差。要求相對偏差不超過±10%。11批次抽驗試劑中，有3批次試劑采用相對偏差法進行試驗，其中2批次滿足要求，1批次相對偏差20%，判定不符合要求。

②比對試驗法：抽驗試劑與比對試劑同時測試40份臨床樣本，用線性回歸方法計算兩組結果的相關系數(shù)及每個濃度點的偏差。有3批次試劑采用比對試驗法進行試驗，其中2批次符合要求，1批次最大相對偏差19%，超過±10%的要求，判定為不符合要求。

③回收法：將已知高濃度樣本加入臨床低濃度樣本（基礎樣本）中，計算混合后樣本濃度減去基礎樣本濃度的差值與高濃度樣本濃度的百分比。有1批次采用回收試驗的方法，符合技術要求的規(guī)定。

此次抽驗準確度評價中，抽樣11批次試劑，檢驗7批次，另4批次因未提供準確度試驗樣品而未進行檢驗。檢驗7批次中，2批次不符合要求，首次檢驗符合要求率71.4%。不符合要求項目均進行復驗，結果仍判定為不符合要求。

1.4 準確度不符合要求原因探索 此次抽驗，不合格項目集中在準確度評價上。采用相對偏差法試驗1批次及比對試驗法試驗1批次。

1.4.1 相對偏差法 本次試驗采用國家二級標準物質(zhì)進行測試，計算相對偏差。所抽驗不符合要求試劑，配套采用朗道校準品進行校準。結果不符合要求的原因分析，一般考慮存在以下幾點的可能性大：①校準問題：量值傳遞過程中出現(xiàn)偏差，校準品定值不準確。②樣品問題：所選擇的標準物質(zhì)量值超出測試系統(tǒng)線性范圍；標準物質(zhì)在此平臺上與參考方法之間的互換性較差；標準物質(zhì)在運輸和儲存中環(huán)境溫度未達到標準物質(zhì)說明書中規(guī)定的要求，導致標準物質(zhì)本身量值發(fā)生變化。

1.4.2 比對試驗法 本次試驗采用受檢單位提供的已上市堿性磷酸酶試劑系統(tǒng)與抽驗試劑系統(tǒng)，分別測試40例人血清樣本，計算兩個試劑系統(tǒng)測試結果的相關系數(shù)及偏差。結果不符合要求的原因分析：主要為兩個試劑系統(tǒng)存在偏差，為進一步尋找原因，本文選擇符合要求的抽驗試劑A及比對試劑Ac和不符合要求的抽驗試劑B及比對試劑Bc測試同一批臨床血清40份，比較四個試劑系統(tǒng)的偏差情況。

2 抽驗試劑A及Ac和抽驗試劑B及Bc比對試驗結果

抽驗試劑A、B及比對試劑（試劑Ac和試劑Bc）所用校準品均為朗道校準品，校準后測試朗道質(zhì)控品，均在其質(zhì)控范圍內(nèi)，且呈現(xiàn)出較好的一致性，質(zhì)控結果見圖1。而測試40例臨床樣本，抽驗試劑A與比對試劑Ac相關系數(shù)（r）0.9998，絕對偏差（-1.8-1.2）U/L，相對偏差（-1.1-0.8）%，結果符合要求。抽驗試劑B與比對試劑Bc相關系數(shù)（r）0.9974，絕對偏差（4.3-15.3）U/L，相對偏差（8.2-19.1）%，見圖2、圖3，偏差結果仍不符合要求。按照抽驗試劑A所測數(shù)據(jù)進行降序排列后做折線圖，見圖4，試劑A、Ac及B一致性較好，而試劑Bc偏差較大。A、Ac、B及Bc試劑校準品均使用朗道校準品及其說明書提供的靶值進行校準，測試朗道質(zhì)控品在靶值范圍內(nèi)，但是測試臨床樣本結果偏差較大，本文考慮與校準品是否在多系統(tǒng)間具有互換性有關。本文針對朗道校準品是否具有互換性進行了進一步的探索試驗。

圖1 抽驗試劑A、B及比對試劑測試朗道質(zhì)控品平均值

圖2 試劑B及比對試劑Bc絕對偏差圖

圖3 試劑B及比對試劑Bc相對偏差圖

圖4 試劑A/Ac/B/Bc比對結果圖

3 朗道校準品互換性評價試驗

3.1 試驗方案 采用美國臨床和實驗室標準化協(xié)會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）發(fā)布的EP30-A[1]及EP14-A3[2]文件中介紹的標準物質(zhì)互換性評價方案，對標準物質(zhì)及朗道血清校準品進行互換性評價。

3.2 參考方法及常規(guī)方法主要儀器與試劑 儀器：全自動生化分析儀（型號7180，日立公司）；Carry 100紫外可見風光光度計（美國Agilent 公司）。

試劑：選擇WAKO、利德曼、中生、九強、安圖、美康、邁瑞、世紀沃德及泰康9家品牌試劑及其配套校準品，其中，世紀沃德及泰康試劑使用朗道校準品，其余均為同生產(chǎn)廠商校準品。

3.3 試驗樣本來源 待評價樣品：日本標準物質(zhì)（JCCLS CRM-001d），標準值：（153±6）U/L；國家二級標準物質(zhì)（GBW(E)090920），標準值：（222.6±5.6）U/L；血清校準水平2：CAL2350（批號：1528UN，朗道）；水平3：CAL2351（批號：1225UE，朗道），靶值分別是184U/L和362U/L（IFCC推薦AMP方法37℃）。

血清樣本：人源血清樣本21例，無溶血、乳糜，每份血清分為2份，避光-80℃保存，用于參考測量程序和常規(guī)方法測量。

3.4 測量方法

3.4.1 參考測量程序測量ALP 采用IFCC推薦的37℃堿性磷酸酶參考測量程序，測試前測試2020 RELA樣本，結果在控，測試21份新鮮單人份血清樣本和各待測標準物質(zhì)、校準品，每個樣本重復測量2次。

3.4.2 常規(guī)方法測量ALP 在日立全自動生化分析儀（型號：7180）上，按照廠家說明書要求校準測量系統(tǒng)后，測試配套質(zhì)控品，結果在控后，分別測量21份新鮮單人份血清樣本和各待測標準物質(zhì)、校準品，每個樣本重復測量3次。

3.5 數(shù)據(jù)收集與處理 收集全部測量結果，進行離群值判定，未發(fā)現(xiàn)有離群值。計算參考方法、常規(guī)方法測量結果的均值，見表1。

表1 標準物質(zhì)、校準品和21份人血清ALP測量結果平均值

3.5.1 按照EP30-A方法評價標準物質(zhì)及校準品互換性，以參考方法測量結果為X軸、常規(guī)方法測量結果為Y軸，采用Deming回歸法，計算臨床樣本對于相應的X值，其Y值的預測值及雙側95%的預測區(qū)間，判斷標準物質(zhì)及校準品在ALP參考方法和常規(guī)測量系統(tǒng)間是否具有互換性。

3.5.2 按照EP14-A3的方法，判斷標準物質(zhì)及校準品在兩個常規(guī)測量系統(tǒng)間是否具有互換性。以一個測量系統(tǒng)測量結果為X軸，另一個測量系統(tǒng)為Y軸，采用Deming回歸法，計算臨床樣本對于相應的X值，其Y值的預測值及雙側95%的預測區(qū)間，判斷標準物質(zhì)及校準品在ALP常規(guī)測量系統(tǒng)間是否具有互換性。

3.6 試驗結果 4個待測物在兩個不同方法間的互換性結果，參考測量程序與常規(guī)測量程序（共9組）見表2，具有互換性方法組合數(shù)：JCCLS CRM-001d占88.9%，GBW（E）090920占77.8%，而血清校準品（朗道）都不具有互換性；兩個常規(guī)測量系統(tǒng)間（共36組）互換性結果見表3，具有互換性的常規(guī)系統(tǒng)組合數(shù)：CCLS CRM-001d占77.8%，GBW（E）090920占80.6%，血清校準水平2（朗道）占5.6%，血清校準水平3（朗道）占8.3%。

表2 標準物質(zhì)、校準品在參考測量程序與常規(guī)測量程序間的互換性結果

表3 標準物質(zhì)、校準品在兩個常規(guī)測量系統(tǒng)間的互換性結果

4 討論

本次監(jiān)督抽驗，評價ALP試劑盒的兩項重要性能指標——重復性和準確度。檢驗結果顯示，ALP試劑盒的重復性都能達到廠家提供的技術要求的規(guī)定，也符合行業(yè)標準YY/T 1234-2014《堿性磷酸酶測定試劑（盒）（NPP底物-AMP緩沖液法）》[3]中重復性的要求，符合要求率100%。而準確度首次檢驗符合要求率71.4%。測量結果不準確的原因中，保證樣本結果的計量溯源性是保證檢測結果準確的首要因素，為指導臨床實驗室和診斷試劑廠家進行計量溯源，2003年國際標準化組織（ISO）發(fā)布了第1版ISO 17511:2003，旨在為臨床實驗室校準品的賦值提供計量溯源性策略，2020年，ISO發(fā)布了第2版ISO 17511:2020[4]，與第1版相比，新版標準將賦值的溯源性要求擴展到患者樣本，明確了患者檢測結果應能追溯到目前可獲得的最高級別標準，進一步確?；颊邩颖緶y量準確性；針對酶學測量項目，新版標準規(guī)定了酶催化活性濃度可溯源到SI單位，提供了催化活性和催化活性濃度的計量溯源路徑[5]；同時，新版標準強調(diào)了校準等級中的二級校準品、體外診斷醫(yī)療器械工作校準品、產(chǎn)品校準品互通性的重要性，標準中規(guī)定，如果使用不具有互換性的物質(zhì)作為產(chǎn)品校準品，則在量值傳遞過程中應使用具有互換性的物質(zhì)（比如人血清盤）對產(chǎn)品校準品賦值結果進行校正。在本文試驗中，朗道血清校準品在參考測量程序與常規(guī)測量程序之間以及兩個常規(guī)測量系統(tǒng)之間大部分情況不具有互換性，而朗道血清校準品說明書所提供的靶值為所有儀器的均值，并不是針對某個系統(tǒng)的靶值，因此，本文認為直接使用第三方校準品說明書提供的靶值進行校準，測量臨床樣本可能存在偏倚，有一定風險性。即便是國際或國內(nèi)標準物質(zhì)，在兩個測量程序或系統(tǒng)之間也不都具有互換性，因此，對于校準品溯源至堿性磷酸酶參考測量程序的廠家進行準確度評價時，也應對所選標準物質(zhì)在參考測量程序與廠家常規(guī)測量程序之間進行互換性評價，從而選擇適合的標準物質(zhì)進行準確度評價。