王瑞肖，潘小麗，張寧妹，陳曉珍，江海峰，黃凌燕

（寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院病理科，寧夏醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，銀川 750004）

食管癌是常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，2020 年我國(guó)新發(fā)食管癌病例32.4 萬(wàn)，死亡病例30.1 萬(wàn)[1]。食管鱗狀細(xì)胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC） 是食管癌最常見(jiàn)的組織學(xué)類型，由于其發(fā)病隱匿，發(fā)現(xiàn)時(shí)多為進(jìn)展期，5 年生存率不到25%[2]。ESCC 的侵襲性與癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、去分化、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等多個(gè)生物學(xué)功能密切相關(guān)。另外，腫瘤微環(huán)境，尤其是腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（tumor-infiltrating lymphocytes，TILs）對(duì)癌癥作用已引起學(xué)者們的廣泛關(guān)注，TILs 對(duì)癌癥存在雙向作用，一方面免疫細(xì)胞具有殺傷癌細(xì)胞的功能，另一方面腫瘤細(xì)胞對(duì)免疫細(xì)胞具有免疫逃逸的能力[3]，可能增強(qiáng)ESCC 的侵襲能力。在癌細(xì)胞和TILs 中共同表達(dá)的作用因子分別通過(guò)哪些生物學(xué)功能影響ESCC 的侵襲能力有待研究，NF-κB/P65 是NF-κB 家族的經(jīng)典成員之一，在癌細(xì)胞和TILs 中均有表達(dá)，但其分別在ESCC 和TILs 中的表達(dá)對(duì)于ESCC 發(fā)病機(jī)制和預(yù)后方面的研究還不清楚，因此，本研究探討NF-κB/P65 分別在ESCC 癌細(xì)胞和TILs 中的表達(dá)對(duì)患者預(yù)后的意義。

1 資料與方法

1.1 資料收集

回顧性分析寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院2007—2012 年的ESCC 患者基本臨床病理資料80 例，包括性別、年齡、癌癥大小、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等。1）納入標(biāo)準(zhǔn)：所有患者術(shù)前均未接受放化療，病理診斷類型為ESCC，病理分期1～3期，均行R0 根治性切除。2）排除標(biāo)準(zhǔn)：臨床病理及隨訪資料不完整，術(shù)后生存時(shí)間小于3 個(gè)月，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。病理診斷標(biāo)準(zhǔn)參照世界衛(wèi)生組織（WHO）第五版，腫瘤臨床分期參照美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì)（AJCC）第八版[4]。

1.2 免疫組化法檢測(cè)ESCC 中NF-κB/P65 表達(dá)

收集ESCC 組織及周圍正常食管組織，10%中性緩沖甲醛固定24 h，石蠟包埋切片，HE 染色。免疫組化切片用EDTA（pH=8.0）煮沸5 min，過(guò)氧化氫封閉10 min，加入NF-κB/P65 一抗（1∶100，D14E12，美國(guó)CST 公司）4 ℃孵育過(guò)夜，二抗室溫孵育30 min，DAB 顯色。NF-κB/P65 陽(yáng)性染色在細(xì)胞核和（或）細(xì)胞質(zhì)中。陽(yáng)性對(duì)照為抗體公司贈(zèng)送的陽(yáng)性切片，陰性對(duì)照為PBS 代替一抗。免疫組化染色結(jié)果由兩位高年資病理醫(yī)師進(jìn)行顯微鏡下判讀。1）有絲分裂象計(jì)數(shù)：在高倍顯微鏡下，觀察NF-κB/P65 在癌細(xì)胞、正常上皮細(xì)胞、TILs 中的陽(yáng)性表達(dá)率。計(jì)算10 個(gè)高倍鏡的陽(yáng)性表達(dá)率并取平均值。在高倍鏡下計(jì)數(shù)癌細(xì)胞有絲分裂象，隨機(jī)選取10 個(gè)高倍鏡下計(jì)數(shù)并計(jì)算總和。2）TILs 判讀：在ESCC 癌內(nèi)和癌周均可見(jiàn)TILs，癌內(nèi)TILs 是計(jì)算間質(zhì)中淋巴細(xì)胞占間質(zhì)的百分比；對(duì)于癌周TILs 則計(jì)算癌周1 mm 內(nèi)間質(zhì)中的淋巴細(xì)胞所占百分比，隨機(jī)選取10 個(gè)高倍鏡計(jì)算后，取平均值。

1.3 生物信息分析

癌癥基因組圖譜（the cancer genome atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)涵蓋ESCC（n=82）和正常者（n=145）。利用TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)分析NF-κB/P65 在人ESCC 中的表達(dá)水平。利用TCGA 數(shù)據(jù)集分析NF-κB/P65 的RNA 測(cè)序表達(dá)作用。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean±SEM）表示。兩組比較采用Mann-Whitney U 檢驗(yàn)，3 組及以上組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），相關(guān)性采用pearson 相關(guān)分析，患者預(yù)后采用Kaplan Meier 生存分析。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料

回顧性收集80 例食管鱗癌病例，男性65例，女性15 例；年齡41～72 歲，中位年齡57 歲。年齡＜60 歲者ESCC 癌細(xì)胞中NF-κB/P65 表達(dá)的陽(yáng)性率比年齡≥60 歲者高（P＜0.05）；不同年齡組間在性別、血型、飲酒史、吸煙史、基礎(chǔ)疾病、腫瘤位置方面差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 均＞0.05），見(jiàn)表1。

表1 ESCC 癌細(xì)胞中NF-κB/P65 陽(yáng)性表達(dá)率臨床特征的關(guān)系

2.2 ESCC 中NF-κB/P65 的陽(yáng)性率表達(dá)情況

免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示，NF-κB/P65 在周圍正常鱗狀上皮中少量弱表達(dá)，在原位鱗癌和浸潤(rùn)性鱗癌中彌漫強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，在正常鱗狀上皮中NF-κB/P65 陽(yáng)性表達(dá)率［（11.59±2.56）%］均低于原位鱗癌［（81.79±2.57）%］和浸潤(rùn)性鱗癌［（84.14±1.77）%］（P＜0.05），見(jiàn)圖1。

圖1 NF-κB/P65 在ESCC 細(xì)胞中的表達(dá)情況

2.3 癌細(xì)胞中NF-κB/P65 高表達(dá)可能促進(jìn)ESCC 進(jìn)展

ESCC 進(jìn)展與癌組織分化程度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、細(xì)胞分裂等因素相關(guān)。鱗狀細(xì)胞癌從分化程度而言，非角化型鱗癌比角化型鱗癌分化更差，NF-κB/P65 在非角化型鱗癌中的陽(yáng)性表達(dá)率為（86.68±1.78）%，而角化型鱗癌為（75.63±14.28）%，非角化型鱗癌高于非角化型鱗癌（P＜0.05），見(jiàn)圖2A～圖2C，NF-κB/P65 陽(yáng)性表達(dá)率升高與ESCC 分化更差有關(guān)。NF-κB/P65 在ESCC中的表達(dá)與核分裂象呈正相關(guān)（r=0.26，P=0.022），見(jiàn)圖2D。NF-κB/P65 陽(yáng)性表達(dá)率在臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），與癌灶大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目均無(wú)相關(guān)性（P 均＞0.05）。

2.4 癌細(xì)胞中NF-κB/P65 高表達(dá)患者預(yù)后差

隨訪80 例ESCC 患者，總生存期為4～162個(gè)月，按照癌細(xì)胞內(nèi)NF -κB/P65 陽(yáng)性表達(dá)率＜80%和≥80%分為NF-κB/P65 高表達(dá)組和低表達(dá)組，NF-κB/P65 高表達(dá)組生存期為4～162 個(gè)月，中位生存期為（65.00±17.40）個(gè)月，平均生存期為（68.39±6.44）個(gè)月；NF-κB/P65 低表達(dá)組生存期為8～156 月，中位生存期為（106.00±8.39）個(gè)月，平均生存期為（102.451±10.23）個(gè)月，癌細(xì)胞NF-κB/P65 高表達(dá)組生存期短于NF-κB/P65 低表達(dá)組（P＜0.05），見(jiàn)圖3。

圖3 ESCC 癌細(xì)胞中NF-κB/P65 的表達(dá)情況

2.5 腫瘤內(nèi)TILs 在ESCC 中的作用

ESCC 癌內(nèi)間質(zhì)中TILs 的表達(dá)量，最低為5%，最高為80%，平均為32.96%。癌內(nèi)間質(zhì)中TILs 的表達(dá)量在臨床1 期（42.78±4.41）時(shí)最高，高于臨床2 期（30±2.74）、3 期（31.3±3.15），（P均＜0.05）。另外，ESCC 間質(zhì)中TILs的量與癌灶大小呈負(fù)相關(guān)（r=0.24，P=0.036），說(shuō)明隨著癌灶體積的增大，癌組織內(nèi)間質(zhì)中TILs 的量變少。ESCC 中，TILs 在正常鱗狀上皮和ESCC、角化型和非角化型鱗癌、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 均＞0.05），與有絲分裂數(shù)無(wú)相關(guān)性（P＞0.05），與患者生存期的長(zhǎng)短差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖4。

圖4 腫瘤內(nèi)TILs 在ESCC 中的作用

2.6 ESCC 中NF-κB/P65 在TILs 中表達(dá)的作用

分析P65 在癌內(nèi)和癌周TILs 中的表達(dá)對(duì)ESCC 侵襲能力的影響和患者預(yù)后的意義。免疫組化結(jié)果顯示，癌內(nèi)TILs 中NF-κB/P65 的陽(yáng)性表達(dá)率與癌內(nèi)TILs 的量呈正相關(guān)（r=0.55，P＜0.001），癌內(nèi)TILs 的量越多，癌內(nèi)TILs 中NF-κB/P65 的陽(yáng)性表達(dá)率越高。按照NF-κB/P65 在癌內(nèi)TILs的陽(yáng)性表達(dá)率＜30%和≥30%分為低表達(dá)組和高表達(dá)組，結(jié)果顯示，高表達(dá)組患者預(yù)后高于低表達(dá)組（χ2=4.293，P=0.038），說(shuō)明NF-κB/P65 在癌內(nèi)TILs 中陽(yáng)性表達(dá)率越高，患者生存期越長(zhǎng)。對(duì)于癌周TILs 中NF-κB/P65 的表達(dá)，結(jié)果顯示，癌周TILs 的量與癌周TILs 中NF-κB/P65 的陽(yáng)性表達(dá)率呈正相關(guān)（r=0.316，P＜0.05），表明癌周TILs的量越多，癌周TILs 中NF-κB/P65 的陽(yáng)性表達(dá)率越高。檢測(cè)NF-κB/P65 在癌內(nèi)和癌周TILs 表達(dá)的差異性，結(jié)果顯示，NF-κB/P65 在癌周TILs的陽(yáng)性率為（52.09±2.71）%，癌內(nèi)TILs 的陽(yáng)性率為（34.88±2.61）%，癌周TILs 的陽(yáng)性率高于癌內(nèi)TILs 的陽(yáng)性率（P＜0.001）。另外，NF-κB/P65 在浸潤(rùn)性癌TILs 的陽(yáng)性率為（51.20±2.77）%，原位癌為（70.00±2.36）%，浸潤(rùn)性癌TILs 的陽(yáng)性率低于在原位癌TILs 的陽(yáng)性率（P=0.009 1）。生存分析結(jié)果顯示，將NF-κB/P65在癌周TILs 陽(yáng)性表達(dá)率＜30%和≥30%分為低表達(dá)組和高表達(dá)組，高表達(dá)組存活率高于低表達(dá)組（χ2=7.064，P=0.008），見(jiàn)圖5。

圖5 ESCC 中NF-κB/P65 在TILs 表達(dá)的作用

2.7 生物信息分析ESCC 中NF-κB/P65 的功能

通過(guò)TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)NF-κB/P65 與癌癥的形成和進(jìn)展，以及對(duì)TILs 相關(guān)因子進(jìn)行功能分析，結(jié)果顯示，ESCC 中NF-κB/P65 表達(dá)與DNA修復(fù)、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、基質(zhì)形成呈正相關(guān)（P＜0.05），與炎性反應(yīng)和IL-10 信號(hào)通路均呈正相關(guān)（P＜0.05），與T 淋巴細(xì)胞表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05），見(jiàn)圖6。

圖6 ESCC 中NF-κB/P65 功能分析

3 討論

NF-κB/P65 作為一個(gè)經(jīng)典的炎癥因子可以誘導(dǎo)細(xì)胞增殖[5]。與結(jié)腸炎相關(guān)癌癥和肝炎相關(guān)癌癥小鼠模型均表明NF-κB/P65 可能通過(guò)TILs促進(jìn)癌癥的發(fā)生[6-7]。

本研究檢測(cè)NF-κB/P65 在ESCC 細(xì)胞中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，NF-κB/P65 在原位鱗癌和浸潤(rùn)性鱗癌中的表達(dá)均高于正常鱗狀上皮細(xì)胞，表明NF-κB/P65 可能參與了ESCC 的發(fā)生。就癌組織分化程度而言，NF-κB/P65 在非角化型鱗癌細(xì)胞中的表達(dá)高于角化型鱗癌，表明NF-κB/P65可能參與了ESCC 去分化。癌細(xì)胞NF-κB/P65 陽(yáng)性表達(dá)率與有絲分裂象數(shù)量呈正相關(guān)，說(shuō)明NFκB/P65 促進(jìn)了ESCC 細(xì)胞分裂與增殖，導(dǎo)致癌細(xì)胞生長(zhǎng)加快，有研究[8]表明，NF-κB/P65 可能通過(guò)ADAM17 的持續(xù)激活導(dǎo)致ESCC 細(xì)胞活力增強(qiáng)、凋亡減少。Shi 等[9]的研究也顯示P65 可促進(jìn)ESCC的增殖。癌細(xì)胞中NF-κB/P65 高表達(dá)患者的生存率明顯比低表達(dá)的低，這些結(jié)果說(shuō)明，NF-κB/P65可能通過(guò)促進(jìn)癌細(xì)胞去分化和增殖來(lái)促進(jìn)ESCC進(jìn)展，導(dǎo)致患者生存性差[10]。生物信息學(xué)分析結(jié)果也表明，NF-κB/P65 可能通過(guò)與DNA 修復(fù)、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及腫瘤基質(zhì)的作用促進(jìn)ESCC 的發(fā)生和進(jìn)展。Han 等[11]的研究也表明NF-κB/P65 作為ESCC 中重要的信號(hào)通路，可以通過(guò)對(duì)SFE 的作用抑制ESCC 的進(jìn)展。

ESCC 中，癌內(nèi)TILs 的百分比在臨床1 期患者中明顯高于臨床2、3 期患者，且與癌灶大小呈負(fù)相關(guān)，說(shuō)明在ESCC 初期招募TILs 使其數(shù)量增多，隨著臨床分期的增高、癌灶增大，TILs 的量逐漸減少，但是TILs 量的多少與患者預(yù)后長(zhǎng)短差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與Jiang 等[12]和Sudo 等[13]的研究結(jié)果相似。本研究結(jié)果表明，ESCC 中癌內(nèi)和癌周中NF-κB/P65 在TILs 的表達(dá)均與TILs 的量呈正相關(guān)，TILs 所占間質(zhì)百分比越高，其內(nèi)NFκB/P65 表達(dá)的陽(yáng)性率越高，Millen 等[14]在結(jié)直腸癌和Vecchio 等[15]在惡性黑色素瘤中的研究結(jié)果均與本研究一致。另外，NF-κB/P65 在癌周TILs的陽(yáng)性表達(dá)率高于癌內(nèi)TILs，且癌周TILs 中NF-κB/P65 的陽(yáng)性表達(dá)率在原位癌高于浸潤(rùn)性癌，生存分析結(jié)果顯示，癌內(nèi)和癌周TILs 中NFκB/P65 陽(yáng)性表達(dá)率越高，患者預(yù)后越好。這些結(jié)果表明，NF-κB/P65 在TILs 中的作用對(duì)ESCC 進(jìn)展具有一定的抑制作用，癌周TILs 中NF-κB/P65 的作用比癌內(nèi)TILs 中更強(qiáng)，隨著從原位鱗癌向浸潤(rùn)性鱗癌進(jìn)展，癌周TILs 中，NF-κB/P65 對(duì)ESCC 的保護(hù)作用逐漸變?nèi)?。通過(guò)生物信息分析，NF-κB/P65 在ESCC 中TILs 的表達(dá)可能通過(guò)與炎性反應(yīng)、T 淋巴細(xì)胞和IL-10 抗炎癥信號(hào)通路的作用，對(duì)ESCC 進(jìn)展具有抑制作用。Zhang 等[16]的研究表明，在結(jié)腸癌中，Agpat4/LPA 通過(guò)巨噬細(xì)胞對(duì)NF-κB/P65 的作用調(diào)節(jié)抗腫瘤反應(yīng)。

ESCC 中NF-κB/P65 的作用復(fù)雜，其在癌細(xì)胞和TILs 中表達(dá)可能通過(guò)不同的下游作用因子發(fā)揮作用，對(duì)ESCC 進(jìn)展和患者預(yù)后的影響也具有明顯差異性。NF-κB/P65 在ESCC 細(xì)胞中高表達(dá)，對(duì)ESCC 的發(fā)生和侵襲能力增強(qiáng)可能具有促進(jìn)作用，NF-κB/P65 陽(yáng)性率越高，患者預(yù)后越差，相關(guān)的研究表明，TNF-α 刺激NF-κB/P65 通路上調(diào)SLC52A3 的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致癌細(xì)胞增殖和集落能力增強(qiáng)，最終使患者預(yù)后差[17]。TILs 在ESCC 初期作用更強(qiáng)，隨著ESCC 進(jìn)展，癌灶越大，TILs 作用越小。ESCC 中TILs 的量越多，NF-κB/P65 陽(yáng)性表達(dá)率也越高，且癌周TILs 中NF-κB/P65 陽(yáng)性表達(dá)率更明顯，NF-κB/P65 在癌內(nèi)和癌周TILs中表達(dá)越高，患者預(yù)后越好。NF-κB/P65 在TILs的表達(dá)可能對(duì)ESCC 具有一定抑制作用，相似的研究表明，PD-1/PD-L1 信號(hào)通過(guò)NF-κB/P65 上調(diào)淋巴上皮中VCAM-1 的表達(dá)，阻斷高度脆弱的Treg 和Teffs 向引流淋巴結(jié)的腫瘤出口，促進(jìn)腫瘤消退[18]。總之，NF-κB/P65 在ESCC 細(xì)胞中呈現(xiàn)癌基因的潛在功能比較明顯，但其在TILs 中的作用可能是機(jī)體免疫能力的反映，對(duì)ESCC 的進(jìn)展和預(yù)后具有保護(hù)作用，其具體的作用機(jī)制尚需廣泛深入研究。