阮建橋，王 晶，徐 輝，曹相玫

（1.寧夏醫(yī)科大學，銀川 750004；2.寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院病理科，寧夏醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)學院，銀川 750004）

膠質瘤是一種異質性疾病，在成人惡性原發(fā)性腦腫瘤中常見，占比為70%，由于具有極強的侵襲性，故預后不佳[1]。根據(jù)腫瘤的侵襲性生物學行為以及不良預后將其分為Ⅰ～Ⅳ級，可以為膠質瘤的治療方案提供指導[2]。異檸檬酸脫氫酶（isocitrate dehydrogenase，IDH） 是參與許多重要代謝過程的關鍵酶，包括IDH-1、IDH-2、IDH-3亞型，其中IDH-1 突變導致α-酮戊二酸（α-ketoglutaric acid，α-KG）轉化為2-羥基戊二酸（2-hydroxyglutarate，2-HG），其作為癌代謝物是膠質瘤發(fā)生的關鍵驅動因素[3]。在膠質瘤中，絕大多數(shù)IDH-1 突變導致組氨酸替代精氨酸（IDH-1 R132H），IDH-1 突變先于其他分子改變，是膠質瘤發(fā)病的早期表現(xiàn)，也是成人膠質瘤的重要鑒別因素，具有預后價值和作為藥物靶點的潛力[4-5]?，F(xiàn)階段關于IDH-1 突變對膠質瘤的遷移及侵襲尚不明確。血管生成與膠質瘤快速生長、轉移及侵襲密切相關。本研究檢測膠質瘤組織中血管生成因子與IDH-1 之間的關系，同時利用強力霉素誘導表達突變型IDH-1 的人膠質瘤U87 細胞，觀察其遷移能力，探討其可能機制，為臨床治療提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

收集2020—2023 年寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院病理科膠質瘤病例198 例，男性112 例，女性86例；年齡≤20 歲者14 例，＞20～≤40 歲者50 例，＞40～≤60 歲者97 例，＞60 歲者37 例。腫瘤分級：Ⅰ級膠質瘤8 例，Ⅱ級膠質瘤56 例，Ⅲ級膠質瘤39 例，Ⅳ級膠質瘤95 例。腫瘤部位：額葉22 例，顳葉39 例，其他部位137 例。實驗使用強力霉素（doxycycline）誘導表達mutIDH-1（含IDH-1 R132H）的人腦膠質瘤細胞（U87 細胞）由空軍軍醫(yī)大學葉菁教授饋贈，生長方式為貼壁生長，培養(yǎng)基為含1%雙抗、10%血清的最低必需培養(yǎng)基（MEM）。

1.2 實驗試劑

doxycycline 誘導表達體系：1） 含IDH -1 R132H 的慢病毒表達載體為Plvx -IDH -1（R132H）；2）Tet -On 慢病毒表達載體為Plvx -Tet-On；3）doxycycline 誘導劑量為10 μg·μL-1。MEM 購于上海帝博思生物科技有限公司，LumiBest 卓越型電化學發(fā)光液（SB-WB011）購自上海圣爾生物科技有限公司，胎牛血清購于上海素爾生物科技有限公司，全蛋白提取試劑盒購于北京中杉金橋生物技術有限公司，IDH-1 一抗試劑（均為鼠單抗）、膠質原纖維酸性蛋白（GFAP）、血管內皮生長因子（VEGF）、CD34、Ki-67，通用型二抗、EDTA （pH 9.0） 修復液、DAB 顯色液、PBS均購自北京中杉金橋生物技術有限公司；VEGFR-2 抗試劑（兔單抗）購于Bioworld Technology公司；抗體稀釋液購自上海威奧生物科技有限公司；蘇木素購自北京九州柏林生物科技有限公司；PAS 試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

1.3 免疫組化法（immunohistochemistry，IHC）

膠質瘤組織常規(guī)石蠟切片3～4 μm，65 ℃烤片過夜，切片脫蠟至水，EDTA（pH 9.0）高壓修復3 min，自然冷卻，3% H2O2水溶液阻斷內源性過氧化物酶8 min，PBS 溶液沖洗，加入一抗IDH-1、GFAP、Ki-67、VEGF（稀釋比例1∶400）、VEGFR-2（稀釋比例1∶250）、CD34（稀釋比例1∶200），37 ℃恒溫箱孵育70 min，PBS 溶液沖洗，加入二抗，37 ℃恒溫箱孵育30 min，PBS 溶液沖洗，DAB 顯色10 min，流水沖洗阻斷顯色，蘇木素滴染1 min，水洗，1%鹽酸乙醇分化3 s，水洗，淡氨水返藍數(shù)秒，水洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.4 PAS、CD34 雙重染色

CD34 進行1.3 中的IHC 檢測步驟至DAB顯色，水洗，加入過碘酸氧化5～10 min；流水沖洗5～10 min；滴加雪夫試劑10～15 min；流水沖洗10～15 min；蘇木素復染1 min，水洗，1%鹽酸乙醇分化3 s，流水沖洗返藍，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，脫色中性樹膠封片。

1.5 膠質瘤組織IHC 及特殊染色結果判讀標準

1）IDH-1、VEGF、VEGFR-2 在細胞質有棕黃色產(chǎn)物形成時判讀為陽性，細胞質無顯色則為陰性；CD34、GFAP 在細胞膜有棕黃色產(chǎn)物時判讀為陽性，細胞膜無顯色則為陰性，均采用半定量法進行判讀。每張切片隨機選取5 個高倍鏡（×400）視野，每個視野計數(shù)細胞100 個，首先計算陽性染色細胞數(shù)占總細胞數(shù)的比例，無陽性染色細胞為0 分，陽性細胞數(shù)≤10%為1 分，陽性細胞數(shù)11%～50%為2 分，陽性細胞數(shù)51%～75%為3 分，陽性細胞數(shù)＞75%為4 分。同時評判染色深淺，無色為0 分，淺黃色為1 分，棕黃色為2 分，棕褐色為3 分，染色強度依據(jù)背景著色進行對比。根據(jù)兩項計分相加所得總分進行結果判定。0～2 分為陰性（-），3～4 分為弱陽性（+或++），＞4分為強陽性（+++）[6]，陽性率=（強陽性例數(shù)÷總例數(shù)）×100%。2）Ki-67 指數(shù)代表腫瘤細胞的增殖活性，指數(shù)≤10%判讀為低表達，指數(shù)＞10%判讀為高表達[7]。3）CD34 染色檢測膠質瘤中的內皮細胞，PAS 染色檢測腫瘤血管的基底膜。CD34 染色表達于內皮細胞，呈棕黃色；PAS 標記血管基底膜，管腔基底膜呈玫紅色。高倍鏡下CD34 陰性、PAS 陽性管道樣結構，即為血管生成擬態(tài)（vasculogenic mimicry，VM）[8]。

1.6 細胞培養(yǎng)及doxycycline 誘導

用含1%雙抗、10%血清的MEM 培養(yǎng)液進行U87 細胞培養(yǎng)。細胞隔天換液。將培養(yǎng)瓶中生長至90%密度的膠質瘤U87 細胞消化、計數(shù)，在直徑10 cm 的細胞培養(yǎng)皿中接種1×106個細胞。接種8 h 后待細胞貼壁。實驗分組為doxycycline 誘導表達組（dox+組）和非doxycycline 誘導表達組（dox-組），dox+組為完全培養(yǎng)基含doxycycline（10 μg·μL-1）培養(yǎng)；dox-組為完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h 后取出至顯微鏡下觀察誘導效率。

1.7 Western blot 檢測U87 細胞內IDH-1、VEGF、VEGFR-2 的表達

U87 細胞誘導48 h 后，收集細胞沉淀提取全蛋白。配制SDS-PAGE 凝膠，上樣等量蛋白進行電泳，濕轉蛋白至PVDF 膜上。10%脫脂牛奶室溫封閉1.5 h 后用抗體稀釋液稀釋一抗（VEGF 1∶400、VEGFR-2 1∶250）4 ℃孵育過夜。二抗（1∶2 000）室溫孵育1.5 h，化學發(fā)光試劑顯色1 min 后曝光并進行灰度測量[9]。

1.8 細胞劃痕實驗檢測U87 細胞遷移能力

六孔板背面畫“十”字，每孔加入約5×105個細胞，每組設置2 個復孔，重復進行3 次。過夜后細胞貼壁且密度達到80%～90%，用200 μL 槍頭在六孔板背后的“十”字進行畫線。用PBS 沖洗劃起的細胞，在同一區(qū)域記錄采集0、24 和48 h 的劃痕范圍照片[10]。用Image J 軟件測量劃痕區(qū)域的面積，分析細胞的遷移速度，采用細胞劃痕愈合率比較細胞的遷移能力。細胞劃痕愈合率=［（0 h劃痕面積-觀察時間點劃痕面積）÷0 h 劃痕面積］×100%。

1.9 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 26.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料用例表示，兩組間比較采用卡方檢驗；計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t 法，各獨立實驗均重復3 次。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 IDH-1 突變膠質瘤患者臨床病理特征

膠質瘤組織IDH-1 蛋白陽性表達與年齡、性別、部位及組織分級均無相關性（P＞0.05）；Ki-67 增殖指數(shù)與患者性別及病理分級存在關聯(lián)：高表達在男性患者中表達率高（P＜0.05），低表達在女性患者中多見（P＜0.05），高表達在高級別膠質瘤（Ⅲ、Ⅳ級）中表達率高于低級別膠質瘤（Ⅰ、Ⅱ級）；GFAP 在低級別膠質瘤（Ⅰ、Ⅱ級）中陽性率為36.53%（61/167），在高級別膠質瘤（Ⅲ、Ⅳ級）中陽性率為63.47%（106/167），在低級別膠質瘤中陽性率低于高級別膠質瘤（P＜0.05），見表1。

表1 膠質瘤組織IDH-1、Ki-67 及GFAP 表達與患者臨床病理特征的關系（例）

2.2 膠質瘤組織HE 染色結果

經(jīng)HE 染色后確定分級，Ⅰ級膠質瘤8 例，Ⅱ級膠質瘤56 例，Ⅲ級膠質瘤39 例，Ⅳ級膠質瘤95 例，其中以Ⅱ、Ⅲ級、Ⅳ級膠質瘤常見，見圖1。

圖1 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級、Ⅳ級膠質瘤HE 染色（×200）

2.3 膠質瘤組織中IDH-1 與Ki-67、GFAP 的關系

膠質瘤組織IHC 結果顯示，Ki-67 高表達在突變型膠質瘤中表達率為56.86%（58/102），野生型膠質瘤中為57.29%（55/96）。Ki-67 高表達、低表達在突變型和野生型膠質瘤中差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；GFAP 在突變型膠質瘤中陽性表達率為92.16%（94/102），野生型中為76.04%（73/96），與野生型相比，GFAP 在突變型中高表達（P＜0.05），見表2、圖2。

圖2 膠質瘤組織IDH-1、Ki-67、GFAP 的表達（×200）

表2 膠質瘤組織Ki-67、GFAP 表達與IDH-1 突變的關系（例）

2.4 膠質瘤組織中CD34、VEGF 與VEGFR-2 的表達

在IDH-1 突變型中，VEGF 陽性表達率為70.59%（72/102），VEGFR-2 為73.63%（75/102），CD34 為68.63%（70/102）；在IDH-1 野生型中，VEGF 陽性表達率為54.17%（52/96），VEGFR-2為59.38%（57/96），CD34 為51.04%（49/96）；VEGF、VEGFR-2、CD34 在IDH-1 突變型中的表達均高于IDH-1 野生型（P 均＜0.05），見圖3。

圖3 膠質瘤組織中VEGF 與VEGFR-2、CD34 的表達（IHC×200）

2.5 IDH-1 突變膠質瘤的VM

PAS-CD34 雙染膠質瘤組織顯示，血管內壁CD34 染色呈陽性，基底膜呈玫紅色，為腫瘤血管成分（VM 陰性）；由膠質瘤細胞形成的不規(guī)則管腔樣結構，CD34 染色呈陰性，基底膜不完整，PAS 呈陽性管道樣結構（VM 陽性）。VM 在突變型以及野生型中均有表達，見圖4。

圖4 PAS-CD34 雙染檢測膠質瘤組織中的VM 形成（×400）

2.6 IDH-1 突變改變U87 細胞中VEGF、VEGFR-2 蛋白的表達水平

Western blot 檢測結果顯示，與dox-組相比，dox+組的VEGF、VEGFR-2 蛋白表達均增高，與IHC 結果一致（P 均＜0.05），見圖5。

圖5 Western blot 檢測dox-組和dox+組U87 細胞IDH-1、VEGF、VEGFR-2 相對蛋白的表達水平

2.7 IDH-1 突變對U87 細胞遷移能力的影響

細胞劃痕實驗結果顯示，在24、48 h 中dox+組的細胞劃痕愈合率均高于dox-組（P 均＜0.05），見圖6。

圖6 細胞劃痕實驗檢測IDH-1 突變對U87 細胞遷移能力的影響

3 討論

膠質瘤是顱內最常見惡性腫瘤之一，由中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的膠質細胞/膠質祖細胞發(fā)展而來[11]，最大程度手術安全切除、放療、化療、免疫療法以及相關聯(lián)合治療可以提高膠質瘤患者的預后，但是膠質瘤的極高致死率、預后效果不佳、復發(fā)率高是患者生存率極低的主要因素[12]。IDH-1 突變在Ⅱ級、Ⅲ級膠質瘤中常見，90%發(fā)生在Ⅱ級膠質瘤中，60%發(fā)生在Ⅲ級膠質瘤中，同時在繼發(fā)性膠質瘤中也很常見[13]。有研究[14]報道，IDH-1 突變會導致2HG 堆積過多并抑制多種酶的功能以及多種依賴于α-KG 的染色質重塑酶，從而影響腫瘤代謝循環(huán)過程。在本實驗中發(fā)現(xiàn)，IDH-1 突變與患者年齡、性別、發(fā)病部位、病理級別均無關聯(lián)。細胞劃痕實驗中，dox+組的U87 細胞在24、48 h劃痕面積高于dox-組，證實IDH-1 突變使細胞的遷移能力增強，從而增加腫瘤的遷移。Ki-67 是一種僅在細胞周期G1、S、G2 或M 期中期的細胞表達核心抗原，正常腦組織中幾乎不表達，Ki-67標記指數(shù)10%是區(qū)分低級別和高級別膠質瘤的臨界點，對預測患者的生存具有重要意義[15]。本研究結果顯示，Ki-67 高表達在男性患者中表達率高，低表達在女性患者中多見，在高級別膠質瘤（Ⅲ、Ⅳ級）中表達率高，在突變型和野生型膠質瘤中表達差異無統(tǒng)計學意義，這一結果與腫瘤級別越高，惡性程度越高、侵襲性越強一致。GFAP 是膠質瘤標志性的一種中間絲蛋白，幾乎只在星形細胞膠質瘤中表達，易受細胞環(huán)境的影響，與腫瘤的遷移息息相關[16]。本實驗發(fā)現(xiàn)，GFAP在突變型中高表達，在高級別膠質瘤中表達增高，這與Priambada 等[17]關于少突膠質細胞分化和IDH-1 野生型彌漫性星形細胞瘤中GFAP 表達降低的研究結果一致，考慮GFAP 與膠質瘤的侵襲性及預后有關。

在許多惡性腫瘤的治療方案中，抗血管治療至關重要。VEGF 是參與血管生成的重要因子，膠質瘤細胞在缺氧情況下，VEGF 與其受體VEGFR-2 的下游信號通路被缺氧誘導因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）激活，同時血管內皮細胞增殖、遷移，由腫瘤細胞形成不規(guī)則管狀結構，形成新生血管[18]。本實驗發(fā)現(xiàn)，VEGF、VEGFR-2、CD34 在突變型中高表達，同時Western blot 檢測顯示，dox+組中VEGF、VEGFR-2 表達升高，兩項結果提示IDH-1 發(fā)生突變，降低HIF-1α 表達水平，使VEGF 過表達，促進新生血管生成，VEGF 過表達與膠質瘤預后不良相關[19]，因此，臨床通過抗VEGF 治療增加無進展生存期并改善膠質瘤患者的生活質量。VM 在腫瘤血管形成中具有很高的可塑性，在微血管密度較低的膠質瘤區(qū)域大量存在，完成腫瘤生長過程中的血氧供應[20]。在雙染實驗中，CD34 染色陰性、PAS染色陽性的膠質瘤細胞形成的管狀結構，即VM陽性。VM 在突變型及野生型中均表達，證實膠質瘤通過血管生成，促進腫瘤轉移、侵襲。VM 在高級別膠質瘤中高表達，更易形成微血管，使膠質瘤細胞逃脫缺氧的環(huán)境及壞死區(qū)域，具有較強的侵襲性，導致患者的治療效果及預后均不佳[21]。

本實驗通過組織及細胞水平探討IDH-1 突變與膠質瘤血管生成的關系，進一步證實IDH-1突變在膠質瘤中具有至關重要的作用，一種是IDH-1 突變，2HG 大量堆積，抑制HIF-1α，誘導VEGF 表達，促進血管生成，增強膠質瘤侵襲及轉移能力[22]；另一種是IDH-1 突變過表達可以減少膠質瘤細胞增殖，使發(fā)生IDH-1 突變的膠質瘤患者預后更好[23]。本實驗通過了解血管生成的機制及其抑制在膠質瘤治療中的意義，為今后臨床膠質瘤的抗血管治療提供新的理論依據(jù)。