張浩月，穆玉敏，秦浩杰，楊夢茜，劉麗榮，任麗梅

（1.美邦美和生物科技有限公司，河北 石家莊 050000；2.石家莊學(xué)院 化工學(xué)院，河北 石家莊 050035;3.河北省生物制藥國際聯(lián)合研究中心，河北 石家莊 050035;4.河北省高校微生物制藥應(yīng)用技術(shù)研發(fā)中心，河北 石家莊 050035;）

0 引言

人類細(xì)胞質(zhì)中存在一種自然合成的三肽，由L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸組成的γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酰-甘氨酸，即還原型谷胱甘肽(Glutathione，GSH)，可維持細(xì)胞生物的正常功能，對正常的免疫系統(tǒng)功能起重要作用，并且具有解毒、抗氧化等、促生長、提高生物對不良環(huán)境影響的作用，廣泛用于酒精、藥物及其他各種原因?qū)е碌母螕p傷治療。

1921 年，英國生化學(xué)家發(fā)現(xiàn)了Hopkins 谷胱甘肽，從酵母抽提物中分離得到，并正式命名為glutathione；其后對GSH 的提取、分離及分析檢測方法等方面進(jìn)行了研究。生產(chǎn)谷胱甘肽有4 種方法，分別為溶劑萃取法、傳統(tǒng)化學(xué)合成法、微生物發(fā)酵法和酶催化法。

在工業(yè)領(lǐng)域應(yīng)用最廣的是化學(xué)合成法和萃取法，目前酶催化法具有越來越高的研究價值。GSH工業(yè)化生產(chǎn)最早的方法是化學(xué)法合成法，其存在耗時長、污染大、成本高等缺點，制約了其進(jìn)一步工業(yè)化的發(fā)展。近幾年，體外酶催化法是生產(chǎn)GSH的主要研究方向。

體外酶催化法是指利用酶來催化3 種氨基酸合成GSH 的方法，生產(chǎn)工藝相對簡單，是其最大的優(yōu)勢，且可有效消除反饋抑制，使GSH 有較高的產(chǎn)量。酶法合成GSH 的關(guān)鍵在于制備高性能的GSH 合成酶體系和高效率的ATP 再生體系。由于我國對谷胱甘肽鈉的關(guān)注較晚，故近幾年對還原型谷胱甘肽鈉研究分析是人們關(guān)注的熱點，測定谷胱甘肽鈉的含量采用的是紫外分光光度法，但準(zhǔn)確度不高，干擾嚴(yán)重；毛細(xì)管區(qū)帶電泳分析法優(yōu)點在于可實現(xiàn)快速檢測，精密度及準(zhǔn)確度較高，但對操作要求較高；藥典介紹了測定谷胱甘肽片HPLC 法，C18 色譜柱（十八烷基硅烷鍵合硅膠填充）；以磷酸鹽緩沖液為流動相（稱取磷酸二氫鈉6.8 g，庚烷磺酸鈉2.2 g，加水1 000 mL 使溶解，用磷酸調(diào)節(jié)pH 值3.0）-甲醇（96∶4），檢測波長為210 nm。此方法可有效分離L-半胱氨酸、L-谷氨酸鈉、甘氨酸、ATP、還原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽等，但檢測時長為40 min，不利于日常分析檢測。故匹配新工藝的發(fā)展，開發(fā)新的快速檢測且有效的分離方法是至關(guān)重要的。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀P230Ⅱ，大連依利特分析有限公司。

電子天平AUW220D，賽多利斯儀器有限公司。

pH 計Seven2 Go S2，梅特勒-托利多儀器有限公司。

還原型谷胱甘肽，阿拉丁，純度99%。

氧化型谷胱甘肽，阿拉丁，純度99%。

L-半胱氨酸鹽酸鹽一水合物，麥克林，純度99%。

L-谷氨酸鈉一水合物，麥克林，純度99%。

甲醇為色譜純，科密歐，99.9%。

四丁基硫酸氫胺meilunbio；純度99%。

1.2 實驗方法

1.2.1 流動相

0.05mol/L 磷酸氫二鈉-0.05 mol/L 磷酸二氫鉀-8 mmol/L 四丁基硫酸氫銨(pH 值為4.5)-甲醇(V/V=80∶20)

1.2.2 色譜條件

色譜柱：島津Wonda Cract ODS-2 (4.6×250 mm，5 μm)。

流速：1.0 mL/min。

波長：214 nm。

柱溫：30 ℃。

進(jìn)樣量：10 μL。

洗脫時間：15 min。

2 結(jié)果與討論

2.1 流動相的選擇

使用島津Wonda Cract ODS-2 色譜柱，分別使用以下3 種洗脫體系進(jìn)樣檢測：

（1）0.028 mol/L 磷酸二氫鉀(pH 值為3.0)-甲醇(V/V=95∶5)。

（2）[0.028 mol/L 磷酸二氫鉀-10 mM 庚烷磺酸鈉(pH2.5)]-甲醇(V/V=96∶4)。

（3）[0.05 mol/L 磷酸氫二鈉-0.05mol/L 磷酸二氫鉀-8 mmol/L 四丁基硫酸氫銨(pH 值為4.5)]-甲醇(V/V=80∶20)。

當(dāng)采取洗脫體系（1）時，L-半胱氨酸鹽酸鹽、L-谷氨酸鈉、甘氨酸分離度差，三峰不能分離，混合標(biāo)準(zhǔn)溶液測試結(jié)果如圖1 所示。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液測試結(jié)果Fig.1 Test result of the mixed reference solution

當(dāng)采取洗脫體系（2）時，ATP 鈉鹽的保留時間40 min，不利于實際分析應(yīng)用。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液測試結(jié)果如圖2 所示。

圖2 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液測試結(jié)果Fig.2 Test result of the mixed reference solution

當(dāng)采取洗脫體系（3）時，ATP 出峰時間縮短約為13 min，干擾少，峰形良好，且L-半胱氨酸鹽酸鹽、L-谷氨酸鈉、還原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽之間分離度R 分別為2.21、5.03 和2.55，均＞1.5；甘氨酸與L-半胱氨酸鹽酸鹽之間分離度1.25，＞1.0，表明各組分可較好分離，混合標(biāo)準(zhǔn)溶液測試結(jié)果如圖3 所示。

圖3 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液測試結(jié)果Fig.3 Test result of the mixed reference solution

2.2 線性關(guān)系考察

（1）準(zhǔn)確稱取還原型谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)品12.5 mg，置于25 mL 容量瓶，用流動相溶解定容至刻度，搖勻得還原型谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)溶液0.50 mg/kg。取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液，用流動相分別稀釋至0.01、0.05、0.10、0.25 和0.50 mg/kg，搖勻備用。

（2）準(zhǔn)確稱取氧化型谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)品12.5 mg，置于25 mL 容量瓶，用流動相溶解定容至刻度，搖勻得氧化型谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)溶液0.50 mg/kg。取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液，用流動相分別稀釋至0.000 2、0.000 5、0.002 0、0.005 0 和0.010 mg/kg，搖勻備用。

（3）準(zhǔn)確稱取L-半胱氨酸鹽酸鹽一水合標(biāo)準(zhǔn)品12.5 mg，置于25 mL 容量瓶，用流動相溶解定容至刻度，搖勻得L-半胱氨酸鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液0.50 mg/kg。取上述對標(biāo)準(zhǔn)溶液，用流動相分別稀釋至0.000 5、0.001 0、0.002 5、0.005 0 和0.010 mg/kg，搖勻備用。

（4）準(zhǔn)確稱取L-谷氨酸鈉一水合物標(biāo)準(zhǔn)品50.0 mg，置于25 mL 容量瓶，用流動相定溶解容至刻度，搖勻得L-谷氨酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液2 mg/mL。取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液，用流動相分別稀釋至0.025、0.050、0.20、0.50 和1.0 mg/kg，搖勻備用。

（5）準(zhǔn)確稱取甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)品50.0 mg，置于25 mL 容量瓶，用流動相定溶解容至刻度，搖勻得甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液2 mg/mL。取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液，用流動相分別稀釋至0.025、0.050、0.10、0.20 和0.50 mg/kg，搖勻備用。

分別取上述各組分搖勻備用的稀釋液于0.45 μm 水系濾膜過濾后，進(jìn)行HPLC 檢測，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)，繪制5 組標(biāo)準(zhǔn)曲線。

線性關(guān)系測試結(jié)果見表1。

表1 線性關(guān)系測試結(jié)果Table 1 Result of linear relationship test

由表1 可以看出，GSH 在（0.01～ 0.5）mg/L內(nèi)線性關(guān)系良好。方法檢出限為0.2 ng，方法定量限為0.6 ng。

2.3 精密度和回收率試驗

在“1.2”項色譜條件下，取不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)進(jìn)樣6 次，觀察各組分峰面積的RSD 及各標(biāo)準(zhǔn)品回收率。各組分峰面積的RSD 均＜2.0%（n=6），表明儀器精密度良好；不同加標(biāo)濃度測得樣品的回收率在94.6%～110.0%，表明該方法的準(zhǔn)確度良好。精密度和準(zhǔn)確度結(jié)果見表2。

表2 精密度和準(zhǔn)確度結(jié)果Table 2 Result of the precision and spiked recoveries

2.4 樣品含量測定

反應(yīng)液中還原型谷胱甘肽含量測定，1 h 反應(yīng)結(jié)果如圖4 所示。

圖4 1 h 反應(yīng)結(jié)果Fig.4 Reaction result of 1 h

反應(yīng)液中還原型谷胱甘肽含量測定，2 h 反應(yīng)結(jié)果如圖5 所示。

圖5 2 h 反應(yīng)結(jié)果Fig.5 Reaction result of 2 h

反應(yīng)液中還原型谷胱甘肽含量測定，3 h 反應(yīng)結(jié)果如圖6 所示。

圖6 3 h 反應(yīng)結(jié)果Fig.6 Reaction result of 3 h

反應(yīng)液中還原型谷胱甘肽含量測定，4 h 反應(yīng)結(jié)果如圖7 所示。

2.5 反應(yīng)轉(zhuǎn)化率計算

（1）L-半胱氨酸鹽酸鹽轉(zhuǎn)化生成還原型谷胱甘肽的反應(yīng)轉(zhuǎn)化率計算式如下：

（2）依據(jù)不同取樣時間L-半胱氨酸鹽酸鹽轉(zhuǎn)化為還原型谷胱甘肽的轉(zhuǎn)化率結(jié)果，繪制對應(yīng)還原型谷胱甘肽轉(zhuǎn)化率曲線，表明該反應(yīng)較為迅速，2 h 時轉(zhuǎn)化率可以達(dá)到85%，考慮后續(xù)實驗需求，在反應(yīng)2 h 時即可終止反應(yīng)。樣本轉(zhuǎn)化率見表3。

表3 樣本轉(zhuǎn)化率Table 3 Conversion rate of the samples

不同時間樣品轉(zhuǎn)化率如圖8 所示。

圖8 不同時間樣品轉(zhuǎn)化率Fig.8 Conversion rate of samples at different times

3 結(jié)語

研究初期，依據(jù)常用緩沖鹽體系及藥典提及添加庚烷磺酸鈉離子對的方法進(jìn)行了嘗試。常用緩沖鹽磷酸二氫鉀體系，對反應(yīng)底物L(fēng)-半胱氨酸、L-谷氨酸鈉、甘氨酸不能完全分離。藥典方法雖然可以實現(xiàn)目標(biāo)峰可完全分離，但檢測時間較長，不利于日常分析檢測；所以2 種方法均不能達(dá)到實驗?zāi)康?。本方法針對多酶體系中各組分含量檢測建立，與藥典方法相比，縮短檢測時長，且對體系中各組分均可定量檢測。此方法應(yīng)用初期，甘氨酸、L-半胱氨酸兩物質(zhì)出峰時間較近，后期針對緩沖鹽體系的pH 值及有機(jī)相比例進(jìn)行調(diào)整。經(jīng)過驗證，優(yōu)化后的方法分離度更高、簡便快捷，可以用于生成還原型谷胱甘肽反應(yīng)液中GSH、GSSG、Gly、L-Cys、L-Glu、AMP、ADP、ATP 含量的測定，以及轉(zhuǎn)化率的計算，對實際生產(chǎn)有重要的指導(dǎo)意義。