馬龍，徐美隆*，范培格*，喬改霞，劉玉娟，王榮，謝軍，馬東海

（1.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏銀川 750021；2.中國(guó)科學(xué)院植物研究所，北京 100093；3.寧夏農(nóng)林科學(xué)院園藝研究所，寧夏銀川 750002；4.寧夏林業(yè)研究院/種苗生物工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏銀川 750002）

葡萄作為全球重要的果樹之一，具有極高的栽培價(jià)值。據(jù)國(guó)際葡萄與葡萄酒組織（OIV）統(tǒng)計(jì)，2021年全球葡萄種植面積達(dá)730萬(wàn) hm2[1]。我國(guó)是葡萄生產(chǎn)大國(guó)，種植面積約為78.3萬(wàn) hm2，占全球總面積的10.73%[2]。我國(guó)釀酒葡萄種植區(qū)域主要集中于北方地區(qū)，以西北地區(qū)種植面積最廣。由于這些地區(qū)淡水資源匱乏，降水量較低，干旱成為了釀酒葡萄產(chǎn)業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展的主要限制因素之一[3-4]。干旱環(huán)境下植物葉片中的葉綠素發(fā)生降解，光合能力、原初光能轉(zhuǎn)化效率（Fv/Fm）下降，同時(shí)，葉片受水分虧缺的影響導(dǎo)致與外界環(huán)境進(jìn)行氣體交換的通道關(guān)閉，葉片的光合速率和蒸騰速率下降，胞間CO2濃度因此降低[5]，膜脂過氧化反應(yīng)也隨干旱脅迫的延長(zhǎng)而加重，細(xì)胞膜選擇透性發(fā)生改變，嚴(yán)重影響了植物的正常生長(zhǎng)發(fā)育[6]。通過嫁接抗旱性強(qiáng)的砧木改變植株根系構(gòu)型，在干旱環(huán)境下表現(xiàn)出較高的活力和水分利用效率，有的砧木還出現(xiàn)增強(qiáng)接穗枝條生長(zhǎng)、改變物候期、增大葉面積等一些優(yōu)良特性[7]。眾多研究和實(shí)踐表明，利用抗性砧木嫁接可以明顯增強(qiáng)栽培品種的抗逆性，從而擴(kuò)大了葡萄的種植區(qū)域[8-9]。目前關(guān)于抗旱砧木的研究已取得一定的成效，‘110R’為抗旱能力突出的葡萄砧木之一，針對(duì)其耐旱能力的評(píng)價(jià)研究也較多[10-11]。而‘黑比諾’作為寧夏釀酒葡萄產(chǎn)區(qū)主栽品種之一，抗性相對(duì)較弱。因此，以砧木‘110R’嫁接增強(qiáng)‘黑比諾’對(duì)干旱的耐受性，系統(tǒng)評(píng)價(jià)砧木‘110R’嫁接葡萄的耐旱性，對(duì)加快葡萄耐旱砧木的推廣應(yīng)用具有重要的意義。

本研究以‘110R’自根苗、‘黑比諾’自根苗、‘黑比諾’自接苗和‘黑比諾/110R’嫁接苗為試材，對(duì)比分析干旱脅迫下葡萄葉片生理指標(biāo)的變化，并利用主成分分析和隸屬函數(shù)對(duì)其耐旱能力進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，為寧夏產(chǎn)區(qū)‘黑比諾’葡萄嫁接苗的砧木選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為一年生砧木品種‘110R’、釀酒品種‘黑比諾’扦插營(yíng)養(yǎng)袋苗，由種苗生物工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。2022年6月2日將生長(zhǎng)基本一致的葡萄苗木移栽于營(yíng)養(yǎng)缽（盆高×盆底徑=18 cm×21 cm），每盆栽種1株葡萄苗。移栽后澆透水，正常管理。每盆含6.0 kg營(yíng)養(yǎng)土（體積比為黃土∶草炭∶珍珠巖=4∶2∶1）。2022年7月10日在寧夏銀川植物園日光溫室采用劈接法分別進(jìn)行‘黑比諾/黑比諾’和‘黑比諾/110R’嫁接，砧木嫁接口粗度為0.3 cm左右，嫁接高度為15 cm左右。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 干旱脅迫

選擇生長(zhǎng)基本一致的‘黑比諾’自根苗（DH）、‘110R’自根苗（DR）、‘黑比諾’自接苗（DHH）和‘黑比諾/110R’嫁接苗（DHR）植株各20株，進(jìn)行正常管理。于2022年8月7日，待植株長(zhǎng)至10片葉以后開始進(jìn)行中度干旱脅迫處理，即通過人工控水的方式，利用稱重法將營(yíng)養(yǎng)缽中的土壤含水量控制在田間持水量的40%～50%，在干旱脅迫處理后第15天選取相同部位的葉片進(jìn)行不同生理指標(biāo)的測(cè)定，3個(gè)重復(fù)。

1.2.2 生理指標(biāo)測(cè)定

新梢生長(zhǎng)量、光合指數(shù)、葉綠素?zé)晒獾壬碇笜?biāo)為活體測(cè)定，葉片水勢(shì)、相對(duì)含水量、相對(duì)電導(dǎo)率、葉綠素含量等生理指標(biāo)采用鮮樣測(cè)定，可溶性糖、可溶性蛋白、丙二醛（MDA）、脯氨酸（Pro）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）等生理指標(biāo)測(cè)定的樣品為采后液氮速凍，置于-80 ℃保存。

其中，新梢生長(zhǎng)量用直尺直接測(cè)量（干旱脅迫后株高減去脅迫前株高）；葉片水勢(shì)的測(cè)定選取不同植株從基部第11片葉開始，采用PSYPRO露點(diǎn)水勢(shì)儀（Wescor公司，美國(guó)）和C52樣品室進(jìn)行測(cè)定；光合指數(shù)的測(cè)定采用GFS-3000光合儀（Heinz Walz GmbH公司，德國(guó)）于晴天上午10:00測(cè)定基部第7片葉；葉綠素?zé)晒鈪?shù)測(cè)定采用OS-30P熒光儀（美國(guó)OPTISCIENC-E儀器公司）測(cè)定基部第7片葉；葉片相對(duì)含水量采用飽和相對(duì)含水量法[12]測(cè)定；葉綠素含量采用乙醇浸提比色法[13]測(cè)定；葉片相對(duì)電導(dǎo)率采用電導(dǎo)率法[14]測(cè)定；可溶性糖、可溶性蛋白含量分別采用蒽酮比色法和考馬斯亮藍(lán)G-250染色法[12]測(cè)定；MDA、Pro、SOD、POD和CAT含量選用索萊寶公司的相關(guān)試劑盒通過比色法測(cè)定，具體方法參考使用說明。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析；采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行方差分析和主成分分析。

按照下列公式計(jì)算自根苗和嫁接苗各綜合指標(biāo)的隸屬函數(shù)值：

與生長(zhǎng)呈正相關(guān)的參數(shù)用公式（1）計(jì)算各綜合指標(biāo)的隸屬函數(shù)值：

與生長(zhǎng)呈負(fù)相關(guān)的參數(shù)用公式（2）計(jì)算各綜合指標(biāo)的隸屬函數(shù)值：

式中，u(Xij)表示第i個(gè)處理第j項(xiàng)指標(biāo)的隸屬，且u(Xij)[0,1]；Xj表示第j個(gè)綜合指標(biāo)；Xmax和Xmin分別表示所有參試處理中的第j個(gè)綜合指標(biāo)的最大值和最小值。

各綜合指標(biāo)的權(quán)重和D值：

式中，Wj表示第j個(gè)綜合指標(biāo)在所有綜合指標(biāo)中的權(quán)重；Pj為自根苗和嫁接苗第j個(gè)綜合指標(biāo)的貢獻(xiàn)率；D值為干旱條件下綜合指標(biāo)評(píng)價(jià)所得的評(píng)價(jià)值。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫對(duì)葡萄新梢生長(zhǎng)量的影響

由圖1可知，干旱脅迫下‘110R’新梢生長(zhǎng)量最大，為146.15 mm，與其他3種試材存在顯著性差異，‘黑比諾/110R’嫁接苗的新梢生長(zhǎng)量次之，與‘黑比諾’自根苗和自接苗具有顯著性差異。

2.2 干旱脅迫對(duì)葉片相對(duì)含水量和水勢(shì)的影響

由圖2 可知，干旱脅迫下葉片相對(duì)含水量以‘110R’自根苗最高，為92.59%，與其他3個(gè)材料具有顯著性差異。‘黑比諾/110R’嫁接苗的降幅較小，‘黑比諾’自根苗和自接苗的降幅較大，且嫁接苗與后兩者差異顯著。

圖2 干旱脅迫對(duì)葡萄葉片相對(duì)含水量（A）和葉片水勢(shì)（B）的影響Figure 2 Effects of drought conditions on relative water content (A) and water potential (B) of grapevine leaves

干旱脅迫下葉片水勢(shì)以‘110R’與‘黑比諾/110R’嫁接苗相近，分別為-1.44、-1.45 MPa，均與‘黑比諾’自根苗、自接苗存在顯著性差異。

2.3 干旱脅迫對(duì)葡萄葉片光合作用的影響

由表1所示，干旱脅迫下‘黑比諾’自根苗的葉綠素含量最高，為1.37 mg·g-1，顯著高于其他3個(gè)材料?！?10R’自根苗的葉綠素含量次之，為1.25 mg·g-1，‘黑比諾/110R’嫁接苗的葉綠素含量高于‘黑比諾’自接苗。

表1 干旱脅迫對(duì)葡萄葉片光合作用的影響Table 1 Effects of drought stress on photosynthesis of grapevine leaves

干旱脅迫下，原初光能轉(zhuǎn)化效率（Fv/Fm）和潛在光化學(xué)效率（Fv/Fo）、蒸騰速率（Tr）、氣孔導(dǎo)度（Gs）、凈光合速率（Pn）和胞間CO2濃度（Ci）等光合參數(shù)在不同處理中呈現(xiàn)相同規(guī)律，即砧木‘110R’的這些光合參數(shù)均為最大值，且顯著高于其他3個(gè)材料；而‘黑比諾/110R’嫁接苗次之，也是顯著高于‘黑比諾’自根苗和自接苗。

2.4 干旱脅迫對(duì)葡萄葉片細(xì)胞膜損傷的影響

由表2可知，干旱脅迫后對(duì)葉片的相對(duì)電導(dǎo)率和MDA含量有一定的影響，以‘黑比諾/110R’嫁接苗相對(duì)電導(dǎo)率最小，為15.32%，顯著低于‘110R’自根苗和‘黑比諾’自接苗，而‘黑比諾’自根苗和自接苗之間的葉片相對(duì)電導(dǎo)率差異不顯著。MDA含量在4個(gè)材料之間的差異也與葉片相對(duì)電導(dǎo)率的趨勢(shì)基本一致，即‘黑比諾/110R’嫁接苗葉片MDA含量顯著低于其他3個(gè)材料。

表2 干旱脅迫對(duì)葡萄葉片細(xì)胞膜損傷和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響Table 2 Effects of drought stress on cell membrane damage and osmotic adjustment substances in grapevine leaves

由表2所示，干旱脅迫下，不同的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)在4個(gè)不同材料中的變化趨勢(shì)存在差別，其中，‘黑比諾/110R’嫁接苗葉片中可溶性糖含量達(dá)到3.89%，顯著高于其他3個(gè)材料；‘黑比諾’自根苗葉片中的可溶性蛋白低于其他3個(gè)材料；‘110R’自根苗葉片中的脯氨酸含量顯著高于其他3個(gè)材料。

2.5 干旱脅迫對(duì)葡萄葉片抗氧化酶的影響

本研究重點(diǎn)關(guān)注干旱脅迫下不同材料中的SOD、POD和CAT三種抗氧化酶的差異，結(jié)果見表3。干旱脅迫下，SOD和POD活性在4個(gè)材料中的變化趨勢(shì)是一致的，即‘110R’自根苗葉片中最高，與其他3個(gè)材料的差異顯著，而‘黑比諾’自根苗和‘黑比諾’自接苗葉片中的SOD和POD活性相對(duì)較低，兩者間無顯著差異；‘黑比諾/110R’嫁接苗葉片中CAT活性最高，顯著高于其他3個(gè)處理，而‘110R’自根苗葉片中的CAT活性則處于較低水平。

表3 干旱脅迫對(duì)葡萄葉片抗氧化酶活性的影響Table 3 Effects of drought stress on antioxidant enzymes in grapevine leaves

2.6 不同葡萄植株耐旱性綜合評(píng)價(jià)

干旱脅迫往往會(huì)引起植物多項(xiàng)生理指標(biāo)的變化，利用單一或少數(shù)幾個(gè)生理指標(biāo)評(píng)判植物的耐旱性具有片面性，為更加科學(xué)地評(píng)價(jià)‘黑比諾’自根苗和自接苗、‘110R’自根苗和‘黑比諾/110R’嫁接苗的耐旱性，需對(duì)獲得的各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行主成分分析和隸屬函數(shù)綜合評(píng)價(jià)。

利用主成分分析，前2 個(gè)主成分貢獻(xiàn)率達(dá)95.21%（圖3和表4），其中，主成分1累計(jì)貢獻(xiàn)率為69.80%，反映了新梢生長(zhǎng)量、葉片含水量、葉片水勢(shì)、原初光能轉(zhuǎn)化效率（Fv/Fm）、潛在光化學(xué)效率（Fv/Fo）、蒸騰速率、氣孔導(dǎo)度、光合速率、胞間二氧化碳濃度（Ci）、相對(duì)電導(dǎo)率、可溶性蛋白、脯氨酸、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）的指標(biāo)信息，第一主成分的這14個(gè)指標(biāo)綜合反映了樹體長(zhǎng)勢(shì)、葉片的水分變化和吸收、葉片光合、細(xì)胞膜損傷和大部分滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)及抗氧化酶的狀況；主成分2累計(jì)貢獻(xiàn)率為25.41%，主要反映了葉綠素含量、丙二醛（MDA）、可溶性糖和過氧化氫酶（CAT）的指標(biāo)狀況。

圖3 葡萄各指標(biāo)因子載荷分布圖Figure 3 Load distribution map of each index factor of grape

各項(xiàng)指標(biāo)的隸屬函數(shù)值見表5。綜合利用隸屬函數(shù)值和權(quán)重，計(jì)算干旱脅迫下‘110R’自根苗、‘黑比諾’自根苗及自接苗和‘黑比諾/110R’嫁接苗干旱條件下綜合指標(biāo)評(píng)價(jià)所得D值（表6）。并利用D值評(píng)價(jià)干旱脅迫不同植株綜合表現(xiàn)。結(jié)果表明，干旱脅迫下不同植株的綜合表現(xiàn)排序?yàn)椋骸?10R’自根苗＞‘黑比諾/110R’嫁接苗＞‘黑比諾’自根苗＞‘黑比諾’自接苗。說明砧木‘110R’的耐旱性高于‘黑比諾’，而以‘110R’為砧木嫁接后，可以提高釀酒葡萄‘黑比諾’的耐旱性。

表5 各項(xiàng)葡萄植株生長(zhǎng)和葉片生理指標(biāo)隸屬函數(shù)值Table 5 Membership function values of various grape plant growth and leaf physiological indexes

表6 葡萄綜合評(píng)分和排序Table 6 Grapevine comprehensive score and sorting

3 討論

植物受干旱脅迫的影響可直接表現(xiàn)在枝條生長(zhǎng)量和葉片失水狀況上。相對(duì)于抗旱能力弱的植物而言，抗旱性強(qiáng)的植物在干旱脅迫下生存能力與體內(nèi)水分運(yùn)輸水平較強(qiáng)，具有較高的生長(zhǎng)量和保水能力[15-16]。本研究中，‘110R’自根苗較‘黑比諾’自根苗新梢生長(zhǎng)量和葉片水分虧缺受干旱脅迫抑制較弱，植株各種代謝活動(dòng)能正常進(jìn)行。‘黑比諾’自接苗的葉片含水量和葉片水勢(shì)下降幅度比‘黑比諾/110R’嫁接苗大；同時(shí)，‘黑比諾’自接苗新梢生長(zhǎng)量受干旱脅迫影響較大，而以‘110R’為砧木的嫁接苗可以自身的某種機(jī)制調(diào)節(jié)葉片組織內(nèi)的水分狀況，增強(qiáng)葉片的保水能力，減少水分的散失。

干旱脅迫下，參與光合作用的葉綠素被降解，葉綠素含量相應(yīng)減少[17]。本試驗(yàn)干旱脅迫下，自根苗的葉綠素含量以‘黑比諾’較高，這可能是葉綠素含量超出光合能力的范圍或與色素之間的轉(zhuǎn)化有關(guān)，嫁接苗的葉綠素含量以‘黑比諾/110R’較高，葉綠素含量與抗旱系數(shù)是否相關(guān)還有待驗(yàn)證[18]。研究表明，抗旱性強(qiáng)的品種做砧木時(shí)接穗在水分脅迫環(huán)境中表現(xiàn)出頑強(qiáng)的生命力，葉片光合能力也相應(yīng)的提高[19-20]。同時(shí)，處于同一逆境下的植物葉片F(xiàn)v/Fm越高，該植物對(duì)于光能的轉(zhuǎn)化效率就越大，在逆境中的生存能力就越強(qiáng)[21]。本研究通過對(duì)比兩種自根苗葉綠素?zé)晒鈪?shù)和光合指數(shù)發(fā)現(xiàn)，‘110R’自根苗較‘黑比諾’自根苗的光能轉(zhuǎn)化效率和光合速率更高。對(duì)應(yīng)的嫁接苗PSⅡ活性中心損傷越輕，光合參數(shù)下降幅度越小，適應(yīng)干旱的能力就越強(qiáng)，葉片光合能力也相應(yīng)提高，已有相關(guān)報(bào)道[22-23]。

植物遭受逆境傷害時(shí)，植物體內(nèi)的活性氧迅速增加，并發(fā)生膜脂過氧化反應(yīng)，產(chǎn)生丙二醛[24]。同時(shí)，由于膜通透性增大，導(dǎo)致電解質(zhì)外滲，植物的相對(duì)電導(dǎo)率也會(huì)增大[25]。為保證植物正常生長(zhǎng)，植物本身會(huì)主動(dòng)積累更多的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，通過滲透調(diào)節(jié)使其維持原本的生理代謝過程[26]。本試驗(yàn)通過比較干旱脅迫下兩種自根苗和兩種嫁接苗的相對(duì)電導(dǎo)率、MDA、可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸等生理指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，兩種自根苗可溶性糖含量差異不顯著；‘110R’自根苗的相對(duì)電導(dǎo)率變化較‘黑比諾’自根苗大，這可能與品種間的差異有關(guān)；其余指標(biāo)說明了‘110R’自根苗的耐旱性強(qiáng)于‘黑比諾’自根苗。對(duì)比兩種嫁接苗生理指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，除可溶性蛋白含量差異不顯著外，其余指標(biāo)間接證明了‘110R’作為砧木可有效提升接穗‘黑比諾’的耐旱性，這與徐美隆、劉國(guó)志等[27-28]研究結(jié)果相似。

抗氧化酶具有清除植物組織內(nèi)活性氧自由基（ROS）的功效，將形成的過氧化物轉(zhuǎn)換為毒害較低或無害物質(zhì)，緩解環(huán)境因素對(duì)植物造成的傷害[29]。由于干旱脅迫引起迅速產(chǎn)生的大量ROS對(duì)膜系統(tǒng)造成一定的損傷，使蛋白質(zhì)的合成和酶的活性受到影響，SOD、POD、CAT作為植物體內(nèi)的酶促保護(hù)系統(tǒng)，與抗旱性密切相關(guān)[30]。本研究中，‘110R’自根苗具有較‘黑比諾’自根苗更強(qiáng)的ROS清除能力。嫁接苗以‘黑比諾/110R’葉片中SOD、POD和CAT含量較高，這與甘海峰等[31]研究結(jié)果相似。說明‘110R’砧木能顯著增強(qiáng)接穗的抗氧化酶系統(tǒng)。

砧穗互作是一個(gè)極其復(fù)雜的過程，逆境條件下，抗性砧木嫁接往往會(huì)引起接穗的生理應(yīng)答機(jī)制發(fā)生改變，從而增強(qiáng)接穗的抗逆性[32]。對(duì)于我國(guó)西北地區(qū)，干旱是葡萄栽培的主要逆境因素之一，其引起的植物生理響應(yīng)是一個(gè)系統(tǒng)工程，以單一的生理指標(biāo)對(duì)葡萄的耐旱性進(jìn)行評(píng)價(jià)存在片面性，而采用主成分分析和隸屬函數(shù)分析方法對(duì)各項(xiàng)生理指標(biāo)進(jìn)行綜合性評(píng)價(jià)更加科學(xué)。目前，該方法已經(jīng)在蘋果、葡萄、大豆等[33-35]多種植物的抗旱性評(píng)價(jià)中得到了應(yīng)用。本研究采用主成分分析和隸屬函數(shù)分析方法對(duì)各項(xiàng)生理指標(biāo)進(jìn)行綜合性評(píng)價(jià)，得出4種供試材料中抗旱性強(qiáng)弱為‘110R’自根苗＞‘黑比諾/110R’嫁接苗＞‘黑比諾’自根苗＞‘黑比諾’自接苗。

4 結(jié)論

本研究利用主成分分析和隸屬函數(shù)法分別對(duì)‘110R’自根苗、‘黑比諾’自根苗及自接苗和‘黑比諾/110R’嫁接苗的抗旱性相關(guān)生理指標(biāo)進(jìn)行了綜合評(píng)價(jià)，表明‘110R’自根苗的抗旱性要明顯強(qiáng)于‘黑比諾’自根苗，而以抗旱砧木‘110R’嫁接釀酒葡萄‘黑比諾’，能明顯提高‘黑比諾’自身的抗旱能力。