李洪艷，成果*，吳代東*，梁翡翠，張勁，謝林君，譚宗琨，楊鑫，韋志勇，蒙仙

（1.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院葡萄與葡萄酒研究所，廣西南寧 530007；2.廣西氣象研究所，廣西南寧 530022；3.羅城縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，廣西羅城 547000；4.羅城縣東門農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站，廣西羅城 547000）

釀酒葡萄產(chǎn)區(qū)的風(fēng)土條件和栽培管理方式是影響果實(shí)風(fēng)味物質(zhì)和葡萄酒風(fēng)格的重要因素[1-2]。不同品種對(duì)栽培土質(zhì)、水分、溫度和光照條件的要求存在差異，在相對(duì)適宜栽植區(qū)域其品質(zhì)表現(xiàn)更佳[3-6]。廣西河池市羅城縣（簡(jiǎn)稱羅城）地處亞洲東南部，屬亞熱帶氣候，山巒縱橫，具有典型的喀斯特巖溶山區(qū)地形地貌，是世界葡萄家族東亞種群葡萄屬的主要起源地之一。腺枝葡萄（Vitis adenocladaHand.-Mazz）是我國(guó)特有的野生葡萄種類，廣泛分布于湖南、福建和廣西等長(zhǎng)江以南省區(qū)，在分類上屬于東亞種群毛葡萄組[7-8]。

本研究團(tuán)隊(duì)自2011年起在羅城縣水源野生葡萄基地開展腺枝葡萄選育工作，迄今已獲得以‘桂黑珍珠3號(hào)’為代表的系列腺枝葡萄優(yōu)系，命名為‘桂黑珍珠’系列[9]?！鸷谡渲?號(hào)’表現(xiàn)生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)，根系發(fā)達(dá)，耐濕熱，結(jié)實(shí)力強(qiáng)，適應(yīng)南方地區(qū)高溫、高濕、多雨、寡日照等氣候環(huán)境，特別是在喀斯特巖溶山區(qū)進(jìn)行人工栽培的表現(xiàn)為果實(shí)低糖高酸、澀味重、果皮厚、皮孔明顯。經(jīng)2～3年的田間觀察，該品種與目前廣西主栽的加工型品種‘野釀2號(hào)’相比具有抗性好、穗形整齊、果粒大小和松緊度適中、著色好等優(yōu)點(diǎn)，屬于優(yōu)質(zhì)釀酒原料。近年來(lái)本團(tuán)隊(duì)利用廣泛靶向代謝物檢測(cè)方法闡明了‘桂黑珍珠3號(hào)’的代謝物特征[9]，公布了‘桂黑珍珠6號(hào)’高質(zhì)量染色體級(jí)別基因組序列[10]，為我國(guó)原生葡萄種質(zhì)資源精準(zhǔn)化開發(fā)利用奠定了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

目前，圍繞腺枝葡萄開展的研究主要集中于資源鑒定和抗病性評(píng)價(jià)方面[11-12]，有關(guān)果實(shí)品質(zhì)特征尤其是風(fēng)味物質(zhì)與氣候因子相關(guān)性的研究鮮見報(bào)道。因此，分析‘桂黑珍珠3號(hào)’在廣西不同產(chǎn)地的品質(zhì)表現(xiàn)，對(duì)探索不同氣候條件下優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)具有重要意義。

‘桂黑珍珠3號(hào)’已通過(guò)扦插、嫁接方式在羅城和南寧市武鳴區(qū)（簡(jiǎn)稱武鳴）試種。通過(guò)觀察該品種在兩地的物候期，測(cè)定其果實(shí)理化指標(biāo)和揮發(fā)性化合物含量，為進(jìn)一步開發(fā)和利用我國(guó)東亞種葡萄資源，優(yōu)化廣西地方特色釀酒葡萄品種結(jié)構(gòu)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

廣西南寧市武鳴區(qū)（108.06°E，23.25°N），地表特征為旱坡地，土壤肥力中等；羅城縣四把鎮(zhèn)里樂村毛葡萄基地（108.72°E，24.69°N），屬丘陵山地，土質(zhì)為粘壤，肥力中等，肥水管理中等。兩地的株行距均為3.5 m×4.0 m。

1.2 試材及氣象數(shù)據(jù)

武鳴、羅城兩地毛葡萄樹齡均在6年以上，平棚架式，露天栽培，其他管理模式均一致。

兩地2020年4—9月的氣象資料均來(lái)源于廣西氣象研究所統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。水熱系數(shù)K=∑P/∑t×10，其中，∑P和∑t分別指降水量與有效積溫。

主要儀器設(shè)備：小型氣象站、雨量收集器。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2020年4—9月進(jìn)行。自萌芽起追蹤記錄兩地‘桂黑珍珠3號(hào)’的物候期進(jìn)程，發(fā)育期編號(hào)采用E-L系統(tǒng)[13]，分別在果實(shí)轉(zhuǎn)色初期（E-L35）、轉(zhuǎn)色結(jié)束（E-L37）和成熟采收期（E-L38）進(jìn)行樣品采集。選擇樹體生長(zhǎng)狀況相對(duì)一致的9株葡萄作為采樣株，每3株為一個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.3.2 指標(biāo)測(cè)定及方法

每個(gè)發(fā)育期隨機(jī)剪下100粒漿果（即每個(gè)樣品300粒），兼顧果穗的各個(gè)部位，采樣后立即用冰盒保存帶回實(shí)驗(yàn)室。其中，150粒果實(shí)樣品（每個(gè)生物學(xué)重復(fù)50粒）用于果實(shí)質(zhì)量、果皮鮮質(zhì)量、可溶性固形物和可滴定酸含量測(cè)定，其余樣品-80 ℃冰箱保存，用于測(cè)定揮發(fā)性代謝物種類。

色度色調(diào)利用色度計(jì)（Konika Minolta CR-10，Japan）測(cè)定。白藜蘆醇測(cè)定參照雷紹榮等[14]的方法，單寧含量測(cè)定參照聶繼云等[15]的方法。

揮發(fā)性代謝組檢測(cè)委托邁維生物科技有限公司采用GC-MS進(jìn)行測(cè)定、分析。前處理方法及色譜質(zhì)譜采集條件如下：從-80 ℃冰箱中取出樣品進(jìn)行液氮研磨（球磨儀，MM400Retsch），渦旋混合均勻，每個(gè)樣本稱取1.0 g（液體1.0 mL）于頂空瓶中，分別加入1～2 mL飽和NaCl溶液，加入內(nèi)標(biāo)溶液：[2H5]-2-甲氧基苯酚（CAS：20189-11-1）10 μL。全自動(dòng)頂空固相微萃取HS-SPME進(jìn)行萃取，以供GC-MS（美國(guó)：Agilent 7890B-7000D）分析。SPME進(jìn)樣參數(shù)：老化溫度250 ℃，老化時(shí)間5 min，加熱溫度60 ℃，加熱時(shí)間10 min，吸附時(shí)間20 min，解析時(shí)間5 min；進(jìn)樣后老化時(shí)間5 min，不分流模式，載氣He，色譜柱DB-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm），柱流速1.0 mL·min-1。柱箱升溫程序：40 ℃保持5 min，以6 ℃·min-1速度升至280 ℃保持5 min，前進(jìn)樣口溫度為250 ℃，傳輸線溫度280 ℃，離子源溫度230 ℃，四級(jí)桿溫度150 ℃。

定性定量分析方法：定性分析通過(guò)安捷倫自動(dòng)質(zhì)譜解卷積定性系統(tǒng)，解卷積參數(shù)峰寬設(shè)為20，分辨率、靈敏度及色譜峰形的要求均設(shè)為中等，匹配因子最小值設(shè)置為60，譜圖檢索NIST數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行定性。樣本質(zhì)譜圖與NIST數(shù)據(jù)庫(kù)提供的參考質(zhì)譜圖進(jìn)行匹配，匹配率60%以上，再結(jié)合保留指數(shù)偏差20%以下的物質(zhì)進(jìn)行提取。用MassHunter定量軟件打開樣本下機(jī)質(zhì)譜文件，進(jìn)行色譜峰的積分和校正工作，每個(gè)色譜峰的峰面積代表對(duì)應(yīng)物質(zhì)的相對(duì)含量，最后導(dǎo)出所有色譜峰面積積分?jǐn)?shù)據(jù)保存。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

分析G C-M S 獲取的原始數(shù)據(jù)文件，首先由MassHunter軟件（Agilent）進(jìn)行峰提取，獲得特征峰的質(zhì)荷比、保留時(shí)間和峰面積等信息，然后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。利用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析，極顯著差異（P＜0.01），顯著差異（P＜0.05）。以SPSS 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，以Prism 8.0和Excel制圖，以MetboAnalyt 3.0進(jìn)行判別分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩地‘桂黑珍珠3號(hào)’生長(zhǎng)季的氣候因子分析

由表1可知，羅城葡萄生長(zhǎng)季（4—9月）的有效積溫、采收前3個(gè)月均溫之和、日照時(shí)數(shù)3個(gè)氣候因子均低于武鳴，漿果成熟月的降水量和采收前兩個(gè)月的水熱系數(shù)均高于武鳴，說(shuō)明武鳴毛葡萄種質(zhì)資源圃溫度高，羅城毛葡萄基地降雨多。從圖1可看出，在葡萄生長(zhǎng)季，羅城的日照時(shí)數(shù)僅在4月高于武鳴，其他月份均低于武鳴（圖1A）；羅城的月均溫均低于武鳴（圖1B），降雨量均高于武鳴（圖1C）。

圖1 羅城和武鳴兩地2020年4—9月的氣候因子比較Figure 1 Comparison of climate factors in Wuming and Luocheng regions from April to September of 2020

表1 2020年羅城和武鳴‘桂黑珍珠3號(hào)’生長(zhǎng)季的主要?dú)夂蛞蜃覶able 1 Climate factors of 'Gui Heizhenzhu No.3' during growing season from Wuming and Luocheng regions in 2020

2.2 兩地‘桂黑珍珠3號(hào)’的物候期

由表2可看出，羅城、武鳴兩地的‘桂黑珍珠3號(hào)’生長(zhǎng)季均在4—9月，其中，4月上中旬萌芽，5月中下旬開花。武鳴‘桂黑珍珠3號(hào)’的果實(shí)7月上旬開始轉(zhuǎn)色，8月中旬轉(zhuǎn)色結(jié)束，9月上旬成熟采收；羅城‘桂黑珍珠3號(hào)’的果實(shí)于7月底轉(zhuǎn)色，8月底轉(zhuǎn)色結(jié)束，9月中旬成熟采收；羅城‘桂黑珍珠3號(hào)’自萌芽到盛花、盛花到果實(shí)轉(zhuǎn)色持續(xù)時(shí)間均比武鳴的長(zhǎng)，自盛花到果實(shí)成熟、萌芽到果實(shí)成熟周期分別長(zhǎng)2、7 d，但自果實(shí)轉(zhuǎn)色到成熟比武鳴時(shí)間短。綜上，武鳴‘桂黑珍珠3號(hào)’各物候期開始時(shí)間早于羅城6～17 d。

表2 2020年羅城和武鳴‘桂黑珍珠3號(hào)’的物候期比較Table 2 Phenology of 'Gui Heizhenzhu No.3' in Wuming and Luocheng regions in 2020

2.3 ‘桂黑珍珠3號(hào)’果實(shí)不同發(fā)育期的理化指標(biāo)

從圖2可看出，‘桂黑珍珠3號(hào)’采收期果實(shí)粒質(zhì)量（BW）在兩地間差異極顯著（圖2A）；可溶性固形物（TSS）含量分別為13.8%和12.8%，二者間無(wú)顯著差異（圖2B）；羅城和武鳴兩地的果實(shí)pH和可滴定酸（TA）含量在轉(zhuǎn)色過(guò)程中變化不明顯，但轉(zhuǎn)色結(jié)束至采收階段pH迅速升高（圖2C），可滴定酸呈降低趨勢(shì)（圖2D），采收期兩地的可滴定酸含量分別為14.21、13.57 g·L-1，說(shuō)明不同產(chǎn)地‘桂黑珍珠3號(hào)’的理化指標(biāo)隨著果實(shí)發(fā)育進(jìn)程變化趨勢(shì)基本一致；羅城果實(shí)粒質(zhì)量極顯著高于武鳴，兩產(chǎn)地的可溶性固形物、pH及可滴定酸含量無(wú)顯著差異。

圖2 羅城和武鳴‘桂黑珍珠3號(hào)’不同發(fā)育期的果實(shí)理化指標(biāo)Figure 2 Physical and chemical indexes of 'Gui Heizhenzhu No.3' at different growing stages in Wuming and Luocheng regions

2.4 ‘桂黑珍珠3號(hào)’采收期果實(shí)品質(zhì)指標(biāo)

為更全面評(píng)價(jià)兩個(gè)產(chǎn)地‘桂黑珍珠3號(hào)’果實(shí)品質(zhì)差異，對(duì)采收期果實(shí)樣品進(jìn)行縱徑（VD）、橫徑（HD）、果皮鮮質(zhì)量（PW）、果實(shí)籽數(shù)（SN）、籽質(zhì)量（SW）及白藜蘆醇（Res）和單寧（Tan）含量進(jìn)行對(duì)比。由表3可知，羅城的‘桂黑珍珠3號(hào)’采收期的果實(shí)縱橫徑、單粒籽數(shù)、籽質(zhì)量及白藜蘆醇和單寧含量均顯著高于武鳴，但單果果皮鮮質(zhì)量無(wú)顯著差異。說(shuō)明采收時(shí)羅城‘桂黑珍珠3號(hào)’果實(shí)的果粒大、種子多，白藜蘆醇和單寧含量均優(yōu)于武鳴。

表3 羅城和武鳴兩地‘桂黑珍珠3號(hào)’采收期果實(shí)品質(zhì)指標(biāo)Table 3 Fruit index of 'Gui Heizenzhu No.3' at harvest stage in Wuming and Luocheng regions

2.5 ‘桂黑珍珠3號(hào)’不同發(fā)育期的果實(shí)顏色比較

由圖3可看出，武鳴和羅城兩個(gè)產(chǎn)地腺枝葡萄果實(shí)成熟過(guò)程中的色度色調(diào)變化趨勢(shì)一致，果皮顏色逐漸加深，a*逐漸增強(qiáng)，b*逐漸減弱。其中，采收期羅城的果實(shí)L*顯著高于武鳴，a*和b*均顯著低于武鳴。說(shuō)明采收期羅城‘桂黑珍珠3號(hào)’的果實(shí)顏色更淺，紅色和黃色色調(diào)較弱。

圖3 羅城縣和武鳴區(qū)‘桂黑珍珠3號(hào)’不同發(fā)育期果實(shí)色度色調(diào)Figure 3 The fruit color of ' Gui Heizhenzhu No.3' during different developing stages in Wuming District and Luocheng County

2.6 采收期果實(shí)揮發(fā)性代謝物組成與含量的差異

由表4可知，羅城和武鳴成熟期‘桂黑珍珠3號(hào)’果實(shí)中共檢出20種有差異的揮發(fā)性代謝物。從圖4A可看出，兩產(chǎn)地因代謝物組成與含量差異巨大而分為兩組，其中，除MW0073（6,10,4-三甲基-2-十五烷酮）外，羅城果實(shí)中的揮發(fā)性化合物含量均高于武鳴（圖4B）；造成兩地差異貢獻(xiàn)排名第一和第四的揮發(fā)性化合物分別為MW0025（芳樟醇）和MW0033（α-松油醇），這兩種揮發(fā)性化合物均具有典型的花香類萜類化合物香氣。

圖4 羅城和武鳴兩地‘桂黑珍珠3號(hào)’成熟期果實(shí)揮發(fā)性代謝物判別分析Figure 4 Discriminant analysis of volatile metabolites in fruits of 'Gui Heizhenzhu No.3' at harvest stage in two regions

綜上所述，羅城‘桂黑珍珠3號(hào)’成熟期果實(shí)中檢出的揮發(fā)性代謝物種類多于武鳴，含量總體上均高于武鳴，尤其是芳樟醇。

2.7 ‘桂黑珍珠3號(hào)’果實(shí)品質(zhì)指標(biāo)間的相關(guān)分析

對(duì)羅城與武鳴的‘桂黑珍珠3號(hào)’果實(shí)品質(zhì)指標(biāo)間進(jìn)行相關(guān)分析（表5）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，果實(shí)粒質(zhì)量除與果實(shí)縱徑、橫徑和芳樟醇含量呈極顯著正相關(guān)外，還與果實(shí)籽數(shù)、籽質(zhì)量、果皮鮮質(zhì)量、L*和α-松油醇含量呈顯著正相關(guān)，與a*呈顯著負(fù)相關(guān)；果實(shí)籽數(shù)、籽質(zhì)量和果皮質(zhì)量與果實(shí)中白藜蘆醇和單寧含量無(wú)明顯相關(guān)性；L*與芳樟醇和α-松油醇含量均呈顯著正相關(guān)，a*與芳樟醇和α-松油醇含量均呈極顯著負(fù)相關(guān)，b*與芳樟醇和α-松油醇含量均呈顯著負(fù)相關(guān)。說(shuō)明果實(shí)質(zhì)量和體積越大越有利于種子數(shù)目和質(zhì)量增多，也有利于芳樟醇和α-松油醇積累，但可能會(huì)降低果實(shí)b*和a*。

表5 羅城和武鳴‘桂黑珍珠3號(hào)’果實(shí)品質(zhì)指標(biāo)間相關(guān)分析Table 5 Corelation coefficients among fruit quality characteristics of 'Gui Heizhenzhu No.3' in Wuming and Luoheng regions

3 討論

產(chǎn)地氣象條件是決定葡萄原料及其釀酒品質(zhì)的主要因素之一[16]。研究表明，植物物候期對(duì)氣候變化的響應(yīng)較敏感，氣溫高會(huì)使植物物候期提前，有利于鮮食葡萄的加溫促早栽培[17-19]。對(duì)比武鳴、羅城兩地的溫度指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，武鳴‘桂黑珍珠3號(hào)’果實(shí)生長(zhǎng)季的有效積溫、采收前3個(gè)月的均溫之和高于羅城，各物候期開始時(shí)間早于羅城6～17 d，除果實(shí)轉(zhuǎn)色至成熟天數(shù)外，其余各物候期時(shí)間均較羅城短2～7 d。因此判斷，造成武鳴和羅城兩地釀酒葡萄果實(shí)物候期不同的主要原因是兩地的溫度差異。

釀酒葡萄全生育期的溫度、光照和降水對(duì)葡萄果實(shí)成分合成、代謝和積累具有重要影響[20]，溫度被認(rèn)為是影響葡萄果實(shí)中酚類物質(zhì)合成和積累的主要因素之一[21]。楊洋等[2]研究表明，夜間低溫可加速‘赤霞珠’葡萄可溶性糖、花色苷和類黃酮的積累，減緩可滴定酸和單寧的降解，顯著增加‘赤霞珠’葡萄成熟時(shí)果實(shí)揮發(fā)性香氣化合物種類，有助于提高果實(shí)品質(zhì)。葡萄是嗜光植物，漿果著色、糖分積累和酸度形成均與光存在緊密關(guān)系[22]。于飛等[23]研究表明，日照時(shí)數(shù)對(duì)葡萄可溶性固形物和固酸比形成具有明顯促進(jìn)作用，對(duì)總酸形成具有明顯抑制作用，對(duì)單寧含量影響不顯著。本研究中，武鳴4—9月葡萄生長(zhǎng)季的月均溫及累計(jì)日照時(shí)數(shù)均高于羅城，降雨量低于羅城，結(jié)合上述研究結(jié)果推斷，溫度高可能是造成武鳴‘桂黑珍珠3號(hào)’可溶性糖、白藜蘆醇和揮發(fā)性化合物含量較低的主要原因。光照增強(qiáng)對(duì)果實(shí)花色苷積累具有積極影響[24-25]，武鳴和羅城‘桂黑珍珠3號(hào)’果實(shí)成熟過(guò)程中色度色調(diào)變化趨勢(shì)一致，但從5月開始，羅城的日照時(shí)數(shù)均低于武鳴，推測(cè)日照時(shí)數(shù)少是造成采收期羅城‘桂黑珍珠3號(hào)’果實(shí)紅色色調(diào)和黃色色調(diào)較弱的原因。

不同緯度和海拔葡萄園的光照強(qiáng)度、溫度條件不同，使葡萄果實(shí)風(fēng)味物質(zhì)存在差異[26-27]，海拔越高紫外線越強(qiáng)，越有利于葡萄果實(shí)中酚類及香氣等次生代謝產(chǎn)物累積[28]，進(jìn)而影響葡萄果實(shí)品質(zhì)和葡萄酒質(zhì)量。本研究中，羅城海拔高、溫度低、雨水多、日照少，所產(chǎn)的‘桂黑珍珠3號(hào)’果實(shí)揮發(fā)性化合物種類多、含量高，白藜蘆醇和單寧含量也較高，與上述研究結(jié)果一致。已有研究表明，在持水性較高的土壤上種植葡萄生產(chǎn)的葡萄酒酚類成分含量顯著降低[29]，在排水性好的土壤上生產(chǎn)的葡萄，所釀葡萄酒具有較成熟的果實(shí)芳香味[30]。由此推測(cè)，羅城的喀斯特巖溶地質(zhì)條件可有效避免連續(xù)降雨帶來(lái)積水對(duì)‘桂黑珍珠3號(hào)’果實(shí)發(fā)育的影響，這也是導(dǎo)致羅城雖然日照少、雨水多但果實(shí)品質(zhì)卻優(yōu)于武鳴的原因。

4 結(jié)論

與南寧武鳴區(qū)相比，相對(duì)氣溫低、海拔高、土壤排水性好是羅城腺枝葡萄‘桂黑珍珠3號(hào)’物候期晚、生育期長(zhǎng)、酚類及揮發(fā)性化合物豐富的主要原因。在‘桂黑珍珠3號(hào)’葡萄實(shí)際生產(chǎn)中可通過(guò)栽培措施調(diào)整其果實(shí)發(fā)育期來(lái)提高葡萄的釀造品質(zhì)。