盧 鵬,陳祉宏,楊月美,尹忠浩,吳福麗,宋曉萌,吳煜農(nóng)

濃縮生長因子(concentrated growth factor,CGF)是通過差速離心得到的最新一代血小板濃縮物,幾乎含有離心血液內(nèi)全部的生長因子[1-3]。與一代血小板濃縮物——富血小板血漿(platelet rich plasma,PRP)相比,不需添加凝血酶,避免了引起患者的過敏及排異反應(yīng)的可能性;與二代血小板濃縮物——富血小板纖維蛋白(platelet rich fibrin,PRF)相比,CGF具有更加致密的網(wǎng)格結(jié)構(gòu)[4],其緩慢釋放生長因子的過程更接近組織愈合的自然過程[5-6]。CGF取材方便,制備簡單、高效,并具有一定的抗炎作用,已經(jīng)在口腔種植領(lǐng)域廣泛應(yīng)用[7-10];但是,影響其促進(jìn)骨組織愈合的具體因素尚未完全清楚,是否單獨(dú)或聯(lián)合其他生物材料應(yīng)用于骨組織缺損處,尚未達(dá)成共識[11]。

骨缺損的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ桶ú糠止侨睋p、節(jié)段骨缺損、骨鉆孔缺損等[12]。然而在不使用任何材料填充缺損的情況下,這些骨缺損也可以進(jìn)行一定程度的自我修復(fù)[13]。如果我們有一個(gè)非手術(shù)制造缺損的骨缺損模型,那么這個(gè)模型就可以更好地避免骨組織自我修復(fù)帶來的觀測上的干擾。

大鼠下頜骨由兩塊骨塊構(gòu)成,其間的下頜骨聯(lián)合由纖維結(jié)締組織連接[14]。因?yàn)樵撀?lián)合處生理情況下不會閉合,所以可作為一種先天性骨缺損模型[15]。在本研究中,我們按分組將CGF和成骨材料填入大鼠下頜骨聯(lián)合中,并觀察該天然缺損是否生成新的骨組織,使缺損愈合。成骨結(jié)果通過顯微計(jì)算機(jī)斷層掃描(micro-CT)和組織學(xué)進(jìn)行評估。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級雌性SD大鼠24只,4周齡,體重90～110 g,由南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(浙)2019-0001。動物倫理審查編號:IACUC-2011044。

1.1.2 設(shè)備與試劑 Geistlich Bio-Oss膠原骨,注冊證編號:國械注進(jìn)20153460268(Geistlich Pharma AG瑞士蓋氏制藥有限公司);TR18 CGF血纖維蛋白離心機(jī)(江蘇創(chuàng)英醫(yī)療器械有限公司);micro-CT(skyscan 1172,比利時(shí))。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分組手術(shù)及取材 SD大鼠隨機(jī)分為3組,每組8只。第1組,膠原骨組;第2組,CGF+膠原骨組;第3組,CGF組。在第3、6個(gè)月分兩批處死動物,并處理解剖獲取大鼠下頜骨。

1.2.2 建立大鼠下頜骨聯(lián)合缺損模型 ①大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉,然后將大鼠仰臥位固定,頜下備皮,消毒鋪巾。②沿下頜骨邊緣設(shè)計(jì)10 mm長新月形的切口。③切開并分離皮膚,充分暴露骨膜。④切開骨膜至骨面,剝離子鈍性剝起骨膜,暴露大鼠左右下頜骨間纖維結(jié)締組織(圖1A)。⑤刮除雙側(cè)下頜骨間纖維結(jié)締組織(圖1B)。⑥加入填充材料(圖1C、D)。⑦縫合骨膜(圖1E)。⑧檢查口內(nèi)是否與下頜骨聯(lián)合相通(圖1F)。⑨縫合皮膚。

A:切開皮膚及皮下組織;B:剝離骨膜并刮除雙側(cè)下頜骨間結(jié)締組織;C:于缺損處填入膠原骨(箭頭示);D:于缺損處填入CGF(箭頭示);E:縫合骨膜瓣;F:檢查口內(nèi)未穿通

1.2.3 CGF的制備 采用真空采血管從大鼠頸靜脈抽取靜脈血3 mL,置于TR18 CGF血纖維蛋白離心機(jī),變速離心13 min后,可見采血管中分為三層:最上層的血漿層,中間的CGF層和最下方的紅細(xì)胞層(圖2A)。倒出上清液后,采用無菌鑷子夾出CGF和下方的紅細(xì)胞凝塊,剪除凝塊后得到的黃色膠凍樣物質(zhì)即為CGF凝膠(圖2B)。

A:采血管中分為三層,最上層的血漿層、中間的 CGF 層和最下方的紅細(xì)胞層;B:黃色膠凍樣物質(zhì)即為CGF

1.2.4 micro-CT分析放射學(xué)骨愈合及骨密度情況 采集的大鼠下頜骨使用skyscan 1172 micro-CT進(jìn)行分析。使用以下參數(shù):電壓為55 kVp;電流72 μA;每隔15.6 μm對下頜骨進(jìn)行掃描。使用CTVox軟件(Bruker,Konitch,比利時(shí))生成掃描樣品的3D模型。獲得的3D圖像用于下頜骨聯(lián)合愈合的放射學(xué)檢查。使用放射學(xué)愈合量表對圖像進(jìn)行評估,0分:無明顯新骨形成;1分:沿下頜骨聯(lián)合邊緣皮質(zhì)骨增厚;2分:較多新骨生成伴明顯的間隙;3分:骨完全愈合或僅伴有微小裂縫。為每個(gè)樣本的下頜骨聯(lián)合部中線處選擇ROI區(qū)域,計(jì)算骨密度(bone mineral density)和BV/TV值。

1.2.5 組織學(xué)分析組織學(xué)骨愈合情況 micro-CT拍攝后,將所有樣本固定在4%多聚甲醛溶液中48 h。沖洗后脫鈣處理,包埋制作組織學(xué)切片。HE染色后,組織學(xué)切片采用Salkeld等報(bào)告的原始量表進(jìn)行評估,評分0分:纖維愈合伴微量新軟骨/骨形成;1分:纖維愈合伴少量新軟骨/骨形成;2分:由軟骨愈合;3分:骨完全愈合。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用Graphpad Pism 9.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,多組比較采用單因素方差分析。P<0.05表明結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié) 果

2.1 大體觀察

解剖觀察大鼠下頜骨聯(lián)合處成骨情況。CGF+膠原骨組第3個(gè)月時(shí)于大鼠下頜骨聯(lián)合處可探及部分硬組織,但并未連續(xù)(圖3A),第6個(gè)月時(shí),可見大鼠下頜骨聯(lián)合處已基本由新骨連接,探針探診可見硬組織(圖3B);CGF組第3個(gè)月時(shí),大鼠下頜骨聯(lián)合處僅可見結(jié)締組織,探診未及硬組織(圖3C),第6個(gè)月時(shí)同樣未能探及硬組織(圖3D);膠原骨組第3個(gè)月時(shí),于大鼠下頜骨聯(lián)合處可探及顆粒狀硬物(圖3E),第6個(gè)月時(shí),可及少量光滑硬組織,但并未連續(xù)(圖3F)。

A:CGF+膠原骨組第3個(gè)月時(shí);B:CGF+膠原骨組第6個(gè)月時(shí);C:CGF組第3個(gè)月時(shí);D:CGF組第6個(gè)月時(shí);E:膠原骨組第3個(gè)月時(shí);F:膠原骨組第6個(gè)月時(shí)

2.2 micro-CT分析

植入材料后第3、第6個(gè)月,分兩批處死大鼠,每批每組各4只,取材后進(jìn)行micro-CT掃描評估大鼠下頜骨聯(lián)合處骨量及形態(tài)變化。第3個(gè)月時(shí),CGF+膠原骨組標(biāo)本顯示在下頜骨聯(lián)合處有大量骨形成,但伴有較為明顯的間隙(圖4A);CGF組(圖4B)和膠原骨(圖4C)組則僅有少量的新骨生成,主要表現(xiàn)為下頜骨邊界的皮質(zhì)骨增厚。第6個(gè)月時(shí),CGF+膠原骨組標(biāo)本則主要表現(xiàn)為完全的骨愈合,僅伴有微小裂紋,同時(shí)較第3個(gè)月時(shí),新生成的骨表面更為光滑,與周圍原有下頜骨結(jié)合更為協(xié)調(diào)(圖4D);膠原骨組(圖4E)和CGF組(圖4F)除少數(shù)標(biāo)本表現(xiàn)為較多新骨生成伴有較明顯的間隙,依然僅有下頜骨邊界的皮質(zhì)骨增厚。通過既定標(biāo)準(zhǔn)對每個(gè)標(biāo)本進(jìn)行打分(表1),并對各組評分進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

表1 各組大鼠放射學(xué)成骨評分

A:第3個(gè)月時(shí),CGF+膠原骨組可見大量骨形成,但伴有較為明顯的間隙;B:第3個(gè)月時(shí),CGF組僅有少量的新骨生成,主要表現(xiàn)為下頜骨邊界的皮質(zhì)骨增厚;C:第3個(gè)月時(shí),膠原骨組可見少量新骨;D:第6個(gè)月時(shí),CGF+膠原骨組為完全的骨愈合,僅伴有微小裂紋,同時(shí)表面更為光整;E:第6個(gè)月時(shí),膠原骨組為較多新骨生成伴有較為明顯的間隙;F:第6個(gè)月時(shí),CGF組僅有骨質(zhì)增多

進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析可知,第3個(gè)月時(shí),CGF+膠原骨組評分要明顯高于CGF組和膠原骨組(P=0.026 6,P=0.026 6),而CGF組和膠原骨組間并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;第6個(gè)月時(shí),CGF+膠原骨組評分與CGF組和膠原骨組相比,具有顯著優(yōu)勢(P=0.002 1,P=0.010 1),而膠原骨組評分看似優(yōu)于CGF組,卻并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖5)。

A:第3個(gè)月時(shí),各組得分分析;B:第6個(gè)月時(shí),各組得分分析;*:P<0.05,**:P<0.01,ns:無明顯差異

將樣本的成骨區(qū)域設(shè)定為ROI(region of interest)區(qū)域,對其進(jìn)行逐個(gè)分析(表2)。結(jié)果顯示第3個(gè)月時(shí),CGF+膠原骨組骨密度(BMD)顯著高于CGF組(P=0.003 4),但與膠原骨組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.074 7);而第6個(gè)月,CGF+膠原骨組BMD較CGF、膠原骨兩組皆有顯著差異(P=0.000 9,P=0.043 8)。在micro-CT分析中,BV/TV表示骨組織體積與組織體積比值,可直接反映骨量變化情況,比較ROI區(qū)域內(nèi)各組骨組織體積占比(表3)。第3個(gè)月時(shí),CGF+膠原骨組BV/TV明顯優(yōu)于CGF組和膠原骨組(P=0.001 4,P=0.014 7)。第6個(gè)月時(shí),CGF+膠原骨組BV/TV同樣優(yōu)于CGF組和膠原骨組(P=0.000 2,P=0.001 9)。

表2 各組BMD值

表3 各組BV/TV值

2.3 組織學(xué)觀察

通過HE染色發(fā)現(xiàn), 其中第3個(gè)月時(shí), CGF+膠原骨組(圖6A)顯示雙側(cè)下頜骨表面有新生成的骨,但并未接續(xù),其間充滿纖維結(jié)締組織,周圍分布有膠原骨中所含多孔骨顆粒,經(jīng)Masson染色可發(fā)現(xiàn)中間區(qū)域?yàn)槔w維結(jié)締組織,而非新生骨組織(圖6B);第6個(gè)月時(shí),CGF+膠原骨組(圖6C)可見雙側(cè)下頜骨間由新生成的骨組織連續(xù),其中可見成骨細(xì)胞,Masson染色證實(shí)中間部分為骨組織(圖6D)。第3個(gè)月時(shí),CGF組可見少量骨質(zhì)增厚(圖6E),Masson染色表明中間仍為纖維結(jié)締組織(圖6F);第6個(gè)月時(shí),CGF組可見較多骨質(zhì)增厚(圖6G),但Masson染色表明主要為纖維結(jié)締組織(圖6H)。第3個(gè)月時(shí),膠原骨組表現(xiàn)為少量骨質(zhì)增厚及大量骨粉顆粒(圖6I),Masson染色證實(shí)了這一點(diǎn)(圖6J);第6個(gè)月時(shí),膠原骨組表現(xiàn)為較多骨質(zhì)生成,但并未連續(xù)(圖6K),Masson染色表明除邊緣增厚的骨質(zhì)外,主要為纖維結(jié)締組織(圖6L)。

A:第3個(gè)月時(shí),CGF+膠原骨組HE染色;B:第3個(gè)月時(shí),CGF+膠原骨組Masson染色;C:第6個(gè)月時(shí),CGF+膠原骨組HE染色;D:第6個(gè)月時(shí),CGF+膠原骨組Masson染色;E:第3個(gè)月時(shí),CGF組HE染色;F:第3個(gè)月時(shí),CGF組Masson染色;G:第6個(gè)月時(shí),CGF組HE染色;H:第6個(gè)月時(shí),CGF組Masson染色;I:第3個(gè)月時(shí),膠原骨組HE染色;J:第3個(gè)月時(shí),膠原骨組Masson染色;K:第6個(gè)月時(shí),膠原骨組HE染色;L:第6個(gè)月時(shí),膠原骨組Masson染色

在CGF+膠原骨組標(biāo)本中,在新生骨中可見大量血管組織,血供豐富;箭頭所示區(qū)域骨質(zhì)的結(jié)構(gòu)呈板層狀,為骨板結(jié)構(gòu),該處骨強(qiáng)度較高;五角星所示區(qū)域可見到矮柱狀單層排列并與相鄰細(xì)胞突起相連的成骨細(xì)胞(圖7)。

A:大鼠下頜骨HE染色( ×5);B:大鼠下頜骨HE染色( ×10);箭頭:板層骨;五角星:成骨細(xì)胞

CGF+膠原骨組在第3個(gè)月時(shí)評分顯著優(yōu)于CGF組和膠原骨組(P=0.003 8,P=0.003 8),而CGF組和膠原骨組間并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;第6個(gè)月時(shí),與CGF組和膠原骨組相比,CGF+膠原骨組評分依然具有顯著優(yōu)勢(P=0.008 2,P=0.019 4),膠原骨組評分略微高于CGF組,然而在統(tǒng)計(jì)學(xué)分析上并無顯著差異(圖8)。

A:第3個(gè)月時(shí),各組HE染色比較;C:第6個(gè)月時(shí),各組HE染色比較;*:P<0.05,**:P<0.01,ns:無明顯差異

3 討 論

CGF作為新一代血液提取物,含有高濃度的生長因子,如轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor, TGF)、血小板生長因子(platelet derived growth factor, PDGF)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2, BMP-2)等[2]。它們對骨組織的形成至關(guān)重要。Pang等[16]證實(shí)BMP-2信號通路的激活可以促進(jìn)人成骨細(xì)胞的增殖和分化。Rochira特別研究了CGF體外誘導(dǎo)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(human bone marrow mesenchymal stem cell, hBMSC)成骨分化的能力,證實(shí)了單獨(dú)使用CGF可誘導(dǎo)hBMSC成骨分化。其他一些體內(nèi)、體外研究也證實(shí),CGF可誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化[17-18],促進(jìn)新骨形成。CGF具有強(qiáng)纖維蛋白凝膠結(jié)構(gòu),類似于天然的血凝塊。CGF在應(yīng)用后不會迅速溶解,在一些相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn),CGF在第一階段即應(yīng)用后24 h內(nèi)釋放生長因子的主要來源于活化的血小板;第二階段的釋放高峰發(fā)生在14～28 d[19],可能是來自CGF中的纖維蛋白結(jié)構(gòu)降解和白細(xì)胞產(chǎn)生的生長因子[20]。有研究觀察了CGF膜的微觀結(jié)構(gòu),并評價(jià)其作為rhBMP-2在裸鼠皮下組織傳遞支架的能力[21]。證明CGF膜可作為rhBMP-2的短期生物支架。因此,CGF提供了較高濃度的生長因子并可持續(xù)釋放,促進(jìn)了細(xì)胞增殖和成骨分化,同時(shí)還有一定的成骨支架作用。

在本研究中,CGF+膠原骨聯(lián)合成骨效果最好,在成骨量和骨結(jié)構(gòu)重建方面均優(yōu)于其他各組。這可能是因?yàn)槟z原骨為早期成骨細(xì)胞的附著提供了可靠的支架;CGF可在術(shù)后早期釋放生長因子,促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化和增殖[17]。中后期,CGF凝膠被吸收到骨顆粒中,血管組織形成增多,局部血管化增強(qiáng),營養(yǎng)供應(yīng)增加,骨修復(fù)和再生過程中受各種生長因子調(diào)節(jié),骨組織形成增多。這也與HE染色切片觀察到的結(jié)果一致。而CGF組也有一定的新骨生成,但其單獨(dú)填充的骨缺損區(qū)未觀察到足夠數(shù)量的新骨組織,其原因可能是成骨細(xì)胞的增殖分化需要復(fù)雜的微環(huán)境,受多種生長因子和途徑的調(diào)控。雖然CGF可以起到短期支架的作用,同時(shí)其生長因子的釋放可達(dá)14～21 d,但在漫長的成骨過程中仍是相對較短的。另一個(gè)可能的原因是受限骨缺損面積較大,成骨細(xì)胞無法得到支架材料的支撐。缺乏穩(wěn)定的骨分化誘導(dǎo)環(huán)境導(dǎo)致缺損中心區(qū)域僅有少量骨形成,而大部分被纖維組織覆蓋。

1986年Schmitz等[22]首次提出了臨界性骨缺損的概念,并將其定義為缺損后不做任何處理無法自愈的最小骨缺損尺寸。對于臨界骨缺損尺寸的大小,還未完全達(dá)成一致[12],同時(shí)在許多實(shí)驗(yàn)中,即使是達(dá)到臨界尺寸,不做任何處理在缺損邊緣依然會有新生骨質(zhì),這就對實(shí)驗(yàn)構(gòu)成了干擾。而大鼠下頜骨的缺損是天然的,終身不愈的,很好地避免了這一問題[13,15]。大鼠下頜骨聯(lián)合部骨缺損模型具有其獨(dú)到之處,其雙側(cè)皆為皮質(zhì)骨,可以更好地模擬一些臨床中遇到的問題,如牙槽突裂等。

本實(shí)驗(yàn)也有一些缺點(diǎn),大鼠骨骼系統(tǒng)更為原始,該系統(tǒng)不具有哈弗斯系統(tǒng)管式的皮質(zhì)重塑,反映的成骨情況與人類有一定的不同[23];在手術(shù)中,并未于雙側(cè)下頜骨表面制作滋養(yǎng)孔,這可能影響了實(shí)驗(yàn)區(qū)的血供及成骨、破骨細(xì)胞的來源;術(shù)后沒有采用合適的方法將大鼠雙側(cè)下頜骨進(jìn)行固定,雖術(shù)后采用軟食喂養(yǎng)減少下頜骨受力,但雙側(cè)下頜骨間仍有一定動度,不能提供足夠穩(wěn)定的環(huán)境,這使得自兩側(cè)增厚新生成的骨質(zhì)較難在中間區(qū)域愈合,同時(shí)術(shù)后的取材過程也可能對成骨區(qū)域造成一定損傷。在以往的實(shí)驗(yàn)中,往往選擇觀測手術(shù)后8周[14]和12周[4]時(shí)的成骨情況,在我們的預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),12周時(shí)已可觀測到較為明顯的差異性,同時(shí)考慮膠原骨作為成骨支架可長時(shí)間留存,為了進(jìn)一步觀測遠(yuǎn)期差異性,選取了術(shù)后第3、6個(gè)月兩個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)。

綜上所述,在第3、6個(gè)月時(shí),CGF+膠原骨組在放射學(xué)及組織學(xué)成骨上,較CGF組和膠原骨組都有更好的表現(xiàn),而單獨(dú)應(yīng)用CGF較單獨(dú)應(yīng)用膠原骨并無優(yōu)勢。通過實(shí)驗(yàn),我們認(rèn)為CGF含有多種生長因子,可促進(jìn)骨生成。CGF與膠原骨聯(lián)合使用可以明顯促進(jìn)骨缺損的修復(fù),但單獨(dú)使用CGF對骨缺損的效果并不理想。