張 婷,張瑩瑩,王新鳳,李新暢,李海燕

(1.承德市農(nóng)林科學(xué)院 河北,承德 067000;2.承德市藝風(fēng)園林綠化工程有限公司 河北,承德 067000)

園林土壤是維系園林植物生命活動(dòng)的重要物質(zhì)條件,其土壤的退化極大地制約了園林植物的生長(zhǎng),主要表現(xiàn)為爛根、死根、葉黃、枯死等癥狀。應(yīng)用土壤調(diào)理劑是改善園林花卉土壤質(zhì)量的一種重要方法。研究表明,施用土壤改良產(chǎn)品后能夠有效促進(jìn)草花的生長(zhǎng),提高土壤有效肥力[1]。土壤微生物是土壤的重要組成部分,微生物的代謝活動(dòng)在土壤肥力的形成和發(fā)展中起著重要作用。以固體廢棄物為原料做土壤調(diào)理劑時(shí),大多數(shù)研究主要集中在土壤調(diào)理劑對(duì)土壤理化性質(zhì)和植物生長(zhǎng)的影響等方面[2,3],而有關(guān)于土壤調(diào)理劑對(duì)土壤微生物多樣性影響方面的研究相對(duì)較少,近年來對(duì)土壤微生物種群及其活性影響的研究逐漸受到關(guān)注。本研究利用前期以菌渣和粉煤灰為主要原料制備的土壤調(diào)理劑,通過添加根瘤菌后,與田園土混合,進(jìn)行草花栽培試驗(yàn),探究土壤調(diào)理劑對(duì)土壤微生物多樣性的影響,以期從土壤微生物角度分析土壤調(diào)理劑的積極作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

前期以食用菌廢菌渣和粉煤灰為原料,并添加根瘤菌制備的土壤調(diào)理劑?；缳?gòu)自花卉市場(chǎng)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 土壤樣品采集

將土壤調(diào)理劑與田園土按比例混合后,進(jìn)行草花栽培,待進(jìn)入花期后,每種花隨機(jī)選取5盆,采集根際土壤樣品,混合均勻后裝入密封袋中,做好標(biāo)記(J0、A0、Y0分別代表三色堇、矮牽牛和一串紅對(duì)照組,JT、AT、YT分別代表三色堇、矮牽牛和一串紅土壤調(diào)理劑處理組),備用。

1.2.2 土壤DNA提取

取混合均勻后的土壤樣品約300 mg于滅菌的離心管中,加入1×PBS溶液,震蕩混勻后,10000 rpm室溫離心3 min,棄置上層液體。倒置2 mL離心管于吸水紙上1 min,直至沒有液體流出,采用OMEGA試劑盒提取土壤樣品基因組DNA,并檢測(cè)DNA濃度及質(zhì)量。

1.2.3 微生物測(cè)序

DNA樣品合格后,以細(xì)菌16SV3-V4區(qū)(341F:CCTACGGGNGGCWGCAG;805R:GACTACHVGGGTAT CTAATCC)為引物,進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件見表1。第二輪擴(kuò)增引入Illumina橋式PCR兼容引物,反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件見表2。產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格后,進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)。高通量測(cè)序工作由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

表1 第一輪擴(kuò)增反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件

表2 第二輪擴(kuò)增反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Moheur軟件進(jìn)行Alpha多樣性分析。利用R語言工具統(tǒng)計(jì)各樣本物種組成和相對(duì)豐度,并繪制柱狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤細(xì)菌Alpha多樣性變化

所有樣本所建文庫(kù)覆蓋率均在99%以上,說明測(cè)序結(jié)果比較可靠,能夠真實(shí)有效的反映土壤樣本環(huán)境。從Alpha多樣性指數(shù)來看,加入土壤調(diào)理劑后,土壤OTU數(shù)均增加,香農(nóng)指數(shù)、Chao指數(shù)、Ace指數(shù)與對(duì)照組相比均提高,Ace指數(shù)和Chao指數(shù)常用來估計(jì)物種總數(shù),能夠反映樣品群落分布豐度;香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)常用來估算樣品中微生物多樣性指數(shù),能夠反映樣品群落分布多樣性和均勻度。加入土壤調(diào)理劑后,香農(nóng)指數(shù)、Chao指數(shù)、Ace指數(shù)均增加,說明土壤調(diào)理劑能夠提高土壤微生物多樣性和豐富度。OTU數(shù)變化與多樣性指數(shù)變化相一致。

表3 Alpha多樣性指數(shù)

2.2 細(xì)菌群落組成變化

2.2.1 細(xì)菌門水平群落結(jié)構(gòu)變化

從群落結(jié)構(gòu)門水平分布圖上來看,各樣本的優(yōu)勢(shì)菌門種類相同,主要有變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria),相對(duì)豐度均大于3%,但在不同樣本中相對(duì)豐度存在差異。其中變形菌門和酸桿菌門在對(duì)照組中的相對(duì)豐度均大于處理組,放線菌門在對(duì)照組中的相對(duì)豐度均小于處理組,說明加入土壤調(diào)理劑后,降低了土壤中變形菌門和酸桿菌門細(xì)菌的數(shù)量,但使放線菌門的細(xì)菌數(shù)量增加。研究表明,放線菌門在土壤有機(jī)質(zhì)變化過程中起到重要作用。酸桿菌門多數(shù)為貧營(yíng)養(yǎng)型微生物,有機(jī)養(yǎng)分的施入能夠?qū)ζ浔憩F(xiàn)為抑制作用[4],酸桿菌門相對(duì)豐度降低,說明土壤中的養(yǎng)分含量增加,不利于酸桿菌門的生長(zhǎng)。而擬桿菌門在不同花卉中表現(xiàn)出不同的變化,使用土壤調(diào)理劑后,三色堇中擬桿菌門相對(duì)豐度明顯降低,由15.19%降低至6.65%,而在矮牽牛和一串紅中,擬桿菌門的相對(duì)豐度分別增加14.02%和7.18%。說明土壤調(diào)理劑在不同花卉土壤中的影響效果不同。

2.2.2 細(xì)菌綱水平群落結(jié)構(gòu)變化

從細(xì)菌綱水平上來看,主要優(yōu)勢(shì)細(xì)菌綱有α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)、γ-變形菌綱(Gammaprot-eobacteria)、噬幾丁質(zhì)菌綱(Chitinophagia)和放線菌綱(Actinobacteria),相對(duì)豐度均在2.5%以上。其中α-變形菌綱在三種花卉處理組中的相對(duì)豐度均小于對(duì)照組,放線菌綱處理組相對(duì)豐度均大于對(duì)照組,這些變化結(jié)果與門水平變化結(jié)果相一致。除此之外,酸微菌綱(Acidimicrobiia)在加入土壤調(diào)理劑后相對(duì)豐度均增加,研究表明,酸微菌綱在中性、酸性和弱堿性環(huán)境中均有存在,具有礦石氧化和合成新型活性物質(zhì)的能力[5]。

圖1 細(xì)菌門水平群落結(jié)構(gòu)分布圖

圖2 細(xì)菌綱水平群落結(jié)構(gòu)分布圖

2.2.3 細(xì)菌屬水平群落結(jié)構(gòu)變化

從細(xì)菌屬水平上來看,紅腸桿菌屬(Rhodanobacter)、德沃斯菌屬(Devosia)、Dongia屬、假單胞菌屬(Pseudomonas)和噬幾丁質(zhì)菌屬(Chitinophaga)在各個(gè)樣本中均屬于優(yōu)勢(shì)菌屬,相對(duì)豐度均≥1%。但在不同花卉上,優(yōu)勢(shì)菌屬相對(duì)豐度的變化不同。其中紅腸桿菌屬、德沃斯菌屬和Dongia屬在三色堇處理組中相對(duì)豐度均增加,紅腸桿菌屬、噬幾丁質(zhì)菌屬在矮牽牛處理組中相對(duì)豐度均增加,但僅有假單胞菌屬在一串紅處理組中增加,其余優(yōu)勢(shì)菌屬均表現(xiàn)出下降趨勢(shì)。使用土壤調(diào)理劑后,三種花根際土壤中有益菌屬均增加。其中根瘤菌屬在三種花中相對(duì)豐度分別增加1.28%、0.62%和0.10%,說明土壤調(diào)理劑中的根瘤菌能夠在土壤中定殖,并使土壤中的根瘤菌數(shù)量增加。除此之外,使用土壤調(diào)理劑后,三種花根際土壤中的Saccharibacteria_genera_incertae_sedis、WPS-1_genera_incertae_sedis和GP6菌屬相對(duì)豐度也有所增加,其中Saccharibacteria_genera_incertae_sedis和WPS-1_genera_incertae_sedis在三色堇處理組中相對(duì)豐度增加最多,分別高達(dá)4.36%、4.44%。研究表明,Saccharibacteria_genera_incertae_sedis能夠降解一些碳水化合物和有機(jī)大分子物質(zhì),對(duì)提高土壤肥力和養(yǎng)分含量起著重要作用。

圖3 細(xì)菌屬水平群落結(jié)構(gòu)分布圖

3 結(jié)論與討論

土壤微生物是土壤—植物系統(tǒng)中重要的組成部分,也是相對(duì)活躍的組成成分,它在土壤有機(jī)質(zhì)和養(yǎng)分循環(huán)與轉(zhuǎn)化過程中起到重要作用。通過施用土壤調(diào)理劑,增加了草花根際土壤中微生物多樣性和豐富度,提高了土壤放線菌門的相對(duì)豐度,同時(shí)增加了土壤中根瘤菌屬、Saccharibacteria_genera_incertae_sedis、WPS-1_genera_incertae_sedis和GP6菌屬的相對(duì)豐度。

細(xì)菌是土壤中數(shù)量最多的微生物,施用有機(jī)肥料有利于提高土壤細(xì)菌數(shù)量和多樣性[6,7],土壤調(diào)理劑中的菌渣含有豐富的有機(jī)質(zhì),施用后提高了土壤中細(xì)菌的數(shù)量。土壤調(diào)理劑中添加了植物促生菌根瘤菌,與田園土配施栽培草花后,土壤中根瘤菌數(shù)量增加,說明根瘤菌能夠在調(diào)理劑和土壤中定殖。根瘤菌是具有固氮功能的一類微生物,其相對(duì)豐度的增加會(huì)促進(jìn)土壤氮素平衡供應(yīng)[8]。土壤調(diào)理劑對(duì)不同草花土壤微生物群落結(jié)構(gòu)影響效果存在一定差異,土壤調(diào)理劑的施入能夠改變土壤理化性質(zhì),同時(shí)也會(huì)對(duì)植物根系分泌物產(chǎn)生影響,不同植物根系分泌物變化不同,對(duì)根系微生物菌群產(chǎn)生不同的刺激,從而引起土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化[9]。

土壤調(diào)理劑中添加的粉煤灰和有機(jī)酸能夠維持土壤中的酸堿平衡,使土壤保持適宜的pH值,同時(shí)改變土壤的透氣性,改善土壤微生物生存環(huán)境,提高微生物活性。調(diào)理劑中的菌渣富含有機(jī)質(zhì)和氮磷鉀等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),增加了土壤中微生物可利用的養(yǎng)分,同時(shí)能夠激發(fā)微生物活性和一些功能酶的分泌,從而調(diào)控土壤微生物群落結(jié)構(gòu)[10-12]。