蘭艷素，潘 樂，黃義橙，周 蝶

（黃山學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，安徽 黃山 245041）

荔枝草（Salvia plebeiaR. Br.）是一種二年生草本植物[1]，又名蛤蟆草、雪里青。我國擁有豐富的荔枝草藥材資源，主要分布在安徽、浙江等省[2]。作為傳統(tǒng)中藥材，荔枝草被應(yīng)用于傳統(tǒng)處方中，對治療腹瀉、痔瘡、咳嗽等，均具有較好療效[3，4]。

藥理學(xué)角度研究發(fā)現(xiàn)，荔枝草具有顯著的抗氧化[5]、抗炎、保肝、止咳平喘[6]、鎮(zhèn)痛、抗菌、抑制α-糖苷酶、抗腫瘤等作用[7，8]，因此，越來越多的學(xué)者加入到荔枝草的研究隊(duì)伍中，隨著研究的不斷深入，其中所含的生物活性成分陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)。主要包括黃酮、倍半萜和二萜、苯丙素類化合物，此外還含有少量的揮發(fā)油、脂肪酸酯等[9-11]。研究結(jié)果還顯示：荔枝草中所含的黃酮類成分具有抗炎[12]、抗氧化[13]和免疫抑制等多方面的藥理作用[14]，非常具有研究價(jià)值。

中藥材中總黃酮成分的提取方法很多，常見的有回流提取法、微波輔助提取法、超臨界提取法[15，16]，其中微波輔助提取具有省時(shí)、提取率高等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于中藥材中有效成分的提取[17-19]。

Alara 等[20]利用微波法輔助提取苦杏仁葉中的黃酮類成分，在料液比0.10g/mL、提取溫度為100℃、微波功率為416W 的條件下提取7min，黃酮提取率最高，與索氏提取法相比較，微波法提取得到的黃酮量更高，而且具有更高的抗氧化活性。截至目前，將該技術(shù)應(yīng)用于荔枝草中總黃酮提取方面的研究尚未見報(bào)道。

本文以黃山本地產(chǎn)荔枝草資源為原料，在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，通過建立Central Composite Design 方案，并采用Design Expert 8.0.6 優(yōu)化得到微波法輔助提取荔枝草總黃酮的最佳工藝條件，以期為該地區(qū)荔枝草資源的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 儀器與試劑

荔枝草在5 月份采摘于黃山學(xué)院南區(qū)，經(jīng)鑒定為唇形科鼠尾草屬植物荔枝草的全草。UV-2600型紫外可見分光光度計(jì)：日本島津公司；MCR-3S型常壓微波合成萃取儀：鞏義市予華儀器有限公司；GZX-9030 MBE 電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；蘆丁對照品：中國藥品生物制品檢定所，NaNO2、Al（NO3）3、NaOH、乙醇：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司均為分析純。

2 方 法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

參照之前的工作以及文獻(xiàn)的方法[21]，用電子分析天平稱取0.0110g 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，溶解后配置成0.22mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。用移液槍準(zhǔn)確移取一系列體積的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，依次加入0.3mL 5%亞硝酸鈉，0.3mL 10%硝酸鋁，4mL 4%氫氧化鈉，用乙醇溶液定容，搖勻后靜置15min，在510nm 處測定各溶液的吸光度值，并制作A-C 曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A=11.89C-0.0102（R2=0.9992）。

2.2 荔枝草中總黃酮的提取

新采摘的荔枝草藥材，用蒸餾水將泥沙沖洗干凈，平鋪于實(shí)驗(yàn)室陰涼處8h后，放入鼓風(fēng)干燥箱中，45℃條件下，鼓風(fēng)干燥20h，粉碎后，過200 目篩后備用。

稱取2.000g 已經(jīng)處理好的藥材，加入一定量的乙醇溶液后，將圓底燒瓶放入微波提取腔正中間，進(jìn)行微波輔助提取。為了減少乙醇揮發(fā)，整個(gè)提取過程均用冷凝水進(jìn)行冷凝回流。待提取結(jié)束，提取液在室溫下冷卻，經(jīng)離心機(jī)離心后，定容于50 mL容量瓶中，得到黃酮提取待測液。

2.3 總黃酮含量測定與提取率的計(jì)算

取6 個(gè)10mL 容量瓶，編號0～5，其中0 號瓶為空白對照組。準(zhǔn)確移取2.0mL 待測液于1～5 號瓶中，依次向6 個(gè)容量瓶加入亞硝酸鈉，硝酸鋁，氫氧化鈉進(jìn)行顯色，并于510nm處測定溶液吸光度值A(chǔ)。將吸光度值A(chǔ) 代入下面公式，計(jì)算得到總黃酮提取率。

2.4 單因素試驗(yàn)

2.4.1 微波提取時(shí)間

按液料比為20:1（mL/g），分別加入體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇溶液，在微波功率為450W 的條件下分別提取3min、5min、7min、9min、11min，提取液離心定容后，移取2mL 待測液，按照制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法進(jìn)行顯色，于510nm處測定溶液吸光度值。

2.4.2 液料比

準(zhǔn)確稱取荔枝草藥材粉末2.000g，分別加入40mL、50mL、60mL、70mL、80mL 體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇溶液，在微波功率為450W 的條件下進(jìn)行提取，溶液經(jīng)處理后，移取2mL，并按照2.3 項(xiàng)下的方法，測定提取液的吸光度值。

2.4.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)

按液料比為30:1（mL/g），分別加入體積分?jǐn)?shù)為40%、50%、60%、70%、80%的乙醇溶液，并在微波功率為450W 的條件下提取7min，移取2mL 處理后溶液，顯色后，測定提取液的吸光度值。

2.4.4 微波功率

準(zhǔn)確稱取荔枝草藥材粉末2.000g，分別加入60 mL 體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇溶液，分別在微波功率為360W、450W、540W、630W、720W 的條件下，進(jìn)行微波提取7min，提取液離心定容后，移取2mL，按照2.3項(xiàng)下的方法，測定提取液的吸光度值。

2.5 Center Composite Design試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，以微波提取時(shí)間、液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、微波功率為自變量，總黃酮提取率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)出星點(diǎn)試驗(yàn)方案。準(zhǔn)確稱取2.000g荔枝草粉末，按照試驗(yàn)方案加入乙醇溶液后，微波法輔助提取荔枝草中的總黃酮，測定提取液的吸光度并計(jì)算總黃酮提取率，綜合考察4 個(gè)試驗(yàn)自變量對總黃酮提取率的影響。

3 結(jié)果與分析

3.1 提取時(shí)間對黃酮提取率的影響

由圖1所示，隨著提取時(shí)間的延長，荔枝草中總黃酮的提取率呈現(xiàn)出先快速升高后趨于平穩(wěn)的趨勢，當(dāng)提取時(shí)間在3～7min之間時(shí)，提取率有明顯增加，當(dāng)提取時(shí)間為7min時(shí)，黃酮的得率出現(xiàn)最大值，但提取時(shí)間超過7min 后，黃酮提取率趨于穩(wěn)定，再進(jìn)一步延長提取時(shí)間，對總黃酮得率的提高幫助甚微，由于延長提取時(shí)間，不僅耗能，而且會(huì)導(dǎo)致提取液中的雜質(zhì)會(huì)變多。因此，選擇7min為最佳。

圖1 不同提取時(shí)間的提取效果

3.2 液料比對黃酮提取率的影響

圖2為不同液料比對總黃酮提取效果的影響曲線，當(dāng)藥材量一定，加入的提取液體積太多、太少，都不利于總黃酮的提取，液料比為20:1（mL/g）時(shí)，提取率比較低，只有1.35%，當(dāng)液料比擴(kuò)大到25:1（mL/g）時(shí)，黃酮提取率快速升高，并于30:1（mL/g）處達(dá)到最大值。繼續(xù)擴(kuò)大液料比，35:1（mL/g）增加到40:1（mL/g），總黃酮得率有略微下降，這可能是由于隨著液料比的慢慢增加，提取液的體積也隨之增加，有利于黃酮成分的溶出，但若液料比過大，當(dāng)微波提取條件不變，提取過程中所能達(dá)到的溫度等相關(guān)因素都會(huì)有所改變，從而導(dǎo)致提取率降低。

圖2 不同液料比的提取效果

3.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對黃酮提取率的影響

由圖3 可見，乙醇體積分?jǐn)?shù)為30%～50%之間時(shí)，總黃酮類化合物的溶出量明顯增加，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%時(shí)，提取率為2.03%，效果最好，繼續(xù)增加乙醇的體積分?jǐn)?shù)，黃酮提取率反而有所下降，可能是由于荔枝草藥材中所含黃酮類成分的極性為中等強(qiáng)度極性，過高或者過低極性的溶劑都不利于該類化合物的溶出。

3.4 微波功率對黃酮提取率的影響

從圖4 可以看出，當(dāng)微波功率從360W 增加到630W 時(shí)，總黃酮提取率會(huì)隨著微波功率的增加有明顯的升高，且在630W 處黃酮得率最大，持續(xù)加大微波提取功率，提取率稍微下降?？赡苁且?yàn)槲⒉üβ侍岣?，能夠加大微波能對物料的處理?qiáng)度，從而有效提高黃酮的提取率，但若微波功率過大，使得提取出來的黃酮組分中結(jié)構(gòu)不是很穩(wěn)定的化合物遭到破壞，所以導(dǎo)致總黃酮提取率略有下降。

圖4 不同微波功率的提取效果

3.5 星點(diǎn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)水平及結(jié)果

采用Design-Expert 8.0.6 軟件中的Central Composite Design 方法進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)，得到荔枝草中總黃酮提取的響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平表見表1。

表1 荔枝草中黃酮提取的響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平表

準(zhǔn)確稱取荔枝草粉末2.000g，共30 份，按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案進(jìn)行提取，提取液經(jīng)過離心處理后，用移液管移取2.0mL 待測液，依次加入硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉，定容于10mL 容量瓶中，510nm 處測定溶液的吸光度值，并計(jì)算黃酮的提取率，試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

采用Design Expert 8.0.6 軟件對試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面分析，得到模型回歸方程為：Y=-7.2328+0.4432A+0.0097B+0.1860C+0.0818D-0.0001AB-0.0019AC-0.0005AD-0.0004CD-0.0239A2-0.0025C2-0.0006D2，實(shí)驗(yàn)方差分析結(jié)果見表3。

表3 方差分析結(jié)果

由方差分析表可知，提取時(shí)間的P 值小于0.0001，說明其對黃酮提取率的影響非常顯著，其次是微波提取功率，液料比對試驗(yàn)結(jié)果的影響最弱。在兩兩因素交互影響中，乙醇體積分?jǐn)?shù)與液料比的交互作用對總黃酮得率的影響極顯著（P=0.0007），提取時(shí)間與微波提取功率、乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比的交互影響顯著，其P 值均＜0.05，微波提取功率與乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比的交互影響的P 值分別為0.8036、0.6999，對黃酮的提取效果影響不大。各因素平方項(xiàng)的影響也達(dá)到極顯著水平，說明微波提取時(shí)間、微波功率，液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)對荔枝草總黃酮得率的影響呈二次曲線關(guān)系，而不是簡單的線性關(guān)系。

總的來看，所得模型的P＜0.0001，影響極顯著，R2=0.988，變異系數(shù)C.V.只有1.06%，失擬項(xiàng)P 值為0.3298（大于0.05），說明該模型的擬合度較好，能較好預(yù)測出荔枝草總黃酮的提取工藝條件，試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確，可靠。

3.6 響應(yīng)面分析

通過軟件分析，得到提取時(shí)間與微波提取功率、乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比兩兩交互作用對總黃酮提取率的影響曲面圖見圖5。

圖5 兩兩因素交互作用對總黃酮得率的影響曲面圖

由圖5 可見，提取時(shí)間與微波功率、液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)兩兩因素交互作用對荔枝草總黃酮提取率均有影響，響應(yīng)面均為開口朝下的曲面，說明隨著各因素的變化，黃酮得率也會(huì)受到一定影響，呈現(xiàn)出先增加后減小的趨勢，并在合適的條件下，可以將荔枝草中總黃酮最大限度的提取出來。

圖5（a）為乙醇體積分?jǐn)?shù)與液料比對總黃酮得率的影響曲面，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%，液料比為30:1（mL/g）時(shí)，總黃酮提取率最高可達(dá)到2.12%。圖5（b）、（c）、（f）的影響曲面圖比較陡峭，等高線為橢圓形，說明微波功率與提取時(shí)間、液料比與提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取時(shí)間的交互作用對荔枝草總黃酮的提取影響顯著。圖5（d）、（e）的響應(yīng)曲面相對平滑，說明在微波輔助提取過程中，液料比與微波功率、乙醇體積分?jǐn)?shù)與微波功率的交互作用對黃酮提取率的影響不顯著。

響應(yīng)面法綜合分析后，得到的最佳提取工藝為：微波提取時(shí)間6.53min，微波功率623.68W，液料比30.26:1(mL/g)，乙醇體積分?jǐn)?shù)為51.08%，荔枝草中總黃酮的提取率為2.122%。

3.7 最佳工藝驗(yàn)證

準(zhǔn)確稱取荔枝草粉末2.000g，共10 份。在模型預(yù)測得到的最佳條件下進(jìn)行微波輔助提取，提取液經(jīng)處理后，測量溶液吸光度值，黃酮含量的計(jì)算方法與2.3 項(xiàng)一致。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：10 組平行試驗(yàn)的平均總黃酮提取率為2.093%，相對誤差為1.386%，說明該模型方程穩(wěn)定、準(zhǔn)確。

4 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)通過建立Central Composite Design方案，采用Design Expert 8.0.6 進(jìn)行優(yōu)化分析，得到微波法輔助提取荔枝草中總黃酮的最佳提取工藝為：微波提取時(shí)間6.5min，微波功率623.7W，液料比30.3:1（mL/g），乙醇體積分?jǐn)?shù)為51%。在此條件下，荔枝草中總黃酮的提取率為2.093%。提取效果與已報(bào)道的有所差異，可能是因?yàn)樵牧系漠a(chǎn)地、采摘季節(jié)以及提取的方法對提取率都有一定的影響。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，利用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化得到的提取工藝具有較好的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性，能較好地預(yù)測出荔枝草中總黃酮的提取工藝，能為該資源的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。