申開文，張瑞波，王強(qiáng)，袁強(qiáng)，沈俊

（1.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外科，貴陽 550004；2.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院貴州醫(yī)院泌尿外科，貴陽 550000）

腎缺血再灌注損傷 （renal ischemia reperfusion injury，RIRI） 是急性腎損傷 （acute kidney injury，AKI）的常見原因，也是影響腎移植術(shù)后存活率的關(guān)鍵因素。AKI 進(jìn)展經(jīng)常導(dǎo)致多器官衰竭和敗血癥，因此有必要開發(fā)有效的方法來預(yù)防或減輕RIRI［1］。細(xì)胞焦亡是RIRI的一個(gè)重要過程，是一種不同于細(xì)胞凋亡和壞死的促炎程序性細(xì)胞死亡，其特征是促炎細(xì)胞因子和細(xì)胞內(nèi)容物的釋放。抑制細(xì)胞焦亡可以減輕RIRI。Gasdermin D （GSDMD） 蛋白是細(xì)胞焦亡的關(guān)鍵效應(yīng)蛋白。GSDMD的N末端由活性caspase 1或caspase 11產(chǎn)生，它們形成細(xì)胞膜孔，導(dǎo)致細(xì)胞死亡并釋放成熟形式的白細(xì)胞介素 （interleukin，IL） -1β和IL-18，進(jìn)而發(fā)生細(xì)胞焦亡［2-3］。Toll樣受體4 （tolllike receptor 4，TLR4） 信號通路過度激活也是RIRI的一種機(jī)制，在RIRI大鼠模型中可觀察到TLR4表達(dá)明顯上調(diào)，導(dǎo)致TLR4下游信號分子MyD88和NF-κB激活，促炎細(xì)胞因子和趨化因子分泌增加［4］。

丹皮酚是從牡丹皮中提取的一種生物活性成分，具有廣泛緩解動脈粥樣硬化病變的藥理特性，與改善內(nèi)皮損傷、抑制血管平滑肌細(xì)胞及降低血脂有關(guān)［5］。除此之外，丹皮酚還具有抑制炎癥反應(yīng)、抗氧化、抗腫瘤等多種藥理作用［6-8］。以往關(guān)于丹皮酚在RIRI中的重要作用主要集中在對肝臟、大腦及心臟方面的研究，目前，丹皮酚在RIRI中作用的研究鮮有報(bào)道。本研究應(yīng)用丹皮酚干預(yù)后建立大鼠RIRI模型，探討丹皮酚對大鼠RIRI的影響及其機(jī)制，旨在為臨床防治RIRI提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與試劑

SPF級雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量170～200 g，購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司 ［合格證號：SCXK （遼） 2020-0001］。大鼠于貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件：濕度40%～70%、溫度20～26 ℃、晝夜12 h明暗交替、自由飲水和進(jìn)食。丹皮酚、TLR4抑制劑 （TAK242） 購于貴州明涵生物科技有限公司，HE 染液購于武漢阿斯本生物技術(shù)有限公司，血尿素氮 （blood urea nitrogen，BUN） 和血清肌酐 （serum creatinine，Scr） 檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所，胱抑素C （cystatin C，CysC） 檢測試劑盒、IL-1β和IL-18檢測試劑盒購于科鹿 （武漢）生物科技有限責(zé)任公司。蛋白質(zhì)印跡抗體，NLRP3、GSDMD、IL-1β 一抗購于英國 Abcam 公司，caspase 1購于江蘇親科生物研究中心有限公司，TLR4、IL-18一抗購于武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，MyD88一抗購于美國CST公司，二抗均購于武漢阿斯本生物技術(shù)有限公司。免疫組化抗體，caspase 1、IL-18一抗購于武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，TLR4，IL-1β 一抗購于美國 Affinity 公司，MyD88一抗購于英國Abcam公司，二抗均購于武漢塞維爾生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組與RIRI模型建立

將30只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后隨機(jī)分為 5 組：假手術(shù)組 （Sham組）、模型組 （RIRI 組）、丹皮酚組 （Pae組）、TLR4抑制劑組 （TAK242組） 和丹皮酚+ TLR4抑制劑組 （Pae+TAK242組），每組6只。本研究獲得貴州醫(yī)科大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)。

大鼠術(shù)前8～12 h禁飲食。建模前2 h Pae組和Pae+TAK242組分別腹腔注射丹皮酚 （50 mg/kg）［9］，TAK242組和Pae+TAK242組大鼠分別腹腔注射TAK242 （3 mg/kg）［10］，Sham組和RIRI組大鼠腹腔注射等量生理鹽水。大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉 （50 mg/kg） 進(jìn)行麻醉，麻醉生效后沿腹中線切開腹部，逐層分離皮膚、皮下組織進(jìn)入腹腔，RIRI 組、Pae組、TAK242組和Pae+TAK242組大鼠暴露雙側(cè)腎蒂后用微型動脈夾鉗夾住雙腎腎蒂周圍 45 min 后松開。通過腎臟顏色改變判斷缺血及再灌注是否成功。Sham組大鼠手術(shù)進(jìn)入腹腔后僅游離雙側(cè)腎蒂，但不夾閉腎蒂。術(shù)閉，各組大鼠縫合腹部切口后飼養(yǎng)24 h，麻醉處死后留取血清和腎組織進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 檢測方法

1.3.1 大鼠腎功能檢查：采用試劑盒檢測各組大鼠BUN、Scr和CysC水平，具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) （enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）：采用ELISA試劑盒檢測各組大鼠血清IL-1β和IL-18水平，具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.3 病理學(xué)檢查：4%多聚甲醛固定腎組織標(biāo)本24 h以上，脫水后包埋在石蠟中。石蠟切片脫蠟水洗后進(jìn)行HE染色，通過光鏡觀察腎臟損傷情況。

1.3.4 免疫組織化學(xué)染色：腎組織石蠟切片脫蠟后水洗，抗原修復(fù)，封閉。一抗 （1∶300） 覆蓋切片 4℃ 孵育過夜，洗滌后辣根過氧化物酶 （horseradish peroxidase，HRP） 偶聯(lián)的山羊抗兔二抗 （1∶200） 孵育，顯微鏡控制下3，3’-二氨基聯(lián)苯胺 （3，3’-diaminobenzidine，DAB） 染色，光學(xué)顯微鏡觀察，MicroPublisher 獲取圖像，細(xì)胞核或胞質(zhì)染色呈黃褐色為陽性染色。

1.3.5 Western blotting檢測：提取各組大鼠腎組織蛋白，檢測TLR4、MyD88以及焦亡相關(guān)蛋白 NLRP3、caspase 1、GSDMD、IL-1β、IL-18的表達(dá)。一抗覆蓋聚偏氟乙烯膜 4 ℃孵育過夜，洗滌后HRP偶聯(lián)的二抗孵育 1 h。使用化學(xué)發(fā)光對印跡進(jìn)行檢測，采用Image J軟件進(jìn)行分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用 GraphPad Prism 7.01 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 丹皮酚對RIRI后大鼠腎臟病理及腎功能的影響

HE染色結(jié)果顯示，與 Sham組比較，RIRI組腎臟結(jié)構(gòu)紊亂，腎小管上皮細(xì)胞嚴(yán)重變性壞死，Pae組及TAK242組腎小管上皮細(xì)胞輕度壞死，Pae聯(lián)合TAK242組腎臟結(jié)構(gòu)基本完整，少量細(xì)胞壞死 （圖1）。RIRI組Scr、BUN和CysC水平較Sham組升高；Pae組、TAK242組及Pae組+TAK242組 Scr、BUN、CysC水平較RIRI組下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （均P< 0.05），見圖2。

圖2 各組大鼠BUN、Scr、CysC水平比較Fig.2 Comparison of BUN，Scr，and CysC in each group

2.2 丹皮酚對大鼠RIRI后腎組織及血清炎性細(xì)胞因子的影響

各組大鼠RIRI后24 h免疫組化結(jié)果顯示，與 Sham組比較，RIRI組、Pae組、TAK242組及Pae+TAK242組TLR4、MyD88、caspase 1、IL-18、IL-1β 表達(dá)增多；與RIRI比較，Pae 組、TAK242組及Pae+TAK242組TLR4、MyD88、caspase 1、IL-18、IL-1β 表達(dá)均減少，見圖3。ELISA檢測結(jié)果顯示，與Sham組比較，Pae組、TAK242組及Pae+TAK242組IL-18、IL-1β水平均升高；與RIRI組比較，Pae組、TAK242組及Pae+TAK242組IL-18、IL-1β水平均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （均P< 0.05，圖4）。

圖5 各組大鼠TLR4、MyD88蛋白及焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)Fig.5 Expression of TLR4，MyD88，and pyrodeath related proteins in each group

2.3 丹皮酚對大鼠RIRI后TLR4、MyD88蛋白及焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與Sham組比較，RIRI組中TLR4、MyD88、NLRP3、caspase 1、GSDMD、IL-1β、IL-18蛋白表達(dá)水平均升高；與RIRI組比較，Pae 組、TAK242組及Pae+TAK242組TLR4、MyD88、NLRP3、caspase 1、GSDMD、IL-1β、IL-18蛋白表達(dá)水平下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （均P< 0.05，圖 5）。

3 討論

RIRI是一個(gè)復(fù)雜的病理生理現(xiàn)象，RIRI過程中過量的活性氧引起氧化應(yīng)激，繼而引發(fā)缺血組織中脂質(zhì)過氧化和細(xì)胞死亡。此外，炎癥在RIRI中起著重要作用，缺血組織中DNA和蛋白質(zhì)損傷引起凋亡、焦亡等程序性細(xì)胞死亡，伴隨白細(xì)胞浸潤和促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生過多，進(jìn)而加重腎臟組織損傷［11］。

細(xì)胞焦亡是由GSDMD蛋白介導(dǎo)的一種程序性細(xì)胞死亡方式，其特點(diǎn)是過度的細(xì)胞死亡和炎癥。GSDMD在質(zhì)膜上形成孔道，最終導(dǎo)致細(xì)胞腫脹、膜溶解和炎性細(xì)胞因子釋放。已證實(shí)GSDMD蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡是RIRI的必要過程［12］。細(xì)胞焦亡過程需要NLRP3炎癥小體和 GSDMD蛋白共同參與，NLRP3炎癥小體在細(xì)胞焦亡中同樣至關(guān)重要。NLRP3炎癥小體是一種細(xì)胞質(zhì)多蛋白復(fù)合體，由先天免疫受體蛋白NLRP3、適配器蛋白ASC和炎癥蛋白酶caspase 1組成，對微生物感染、內(nèi)源性危險(xiǎn)信號和環(huán)境刺激產(chǎn)生反應(yīng)。組裝的NLRP3炎癥小體可以激活蛋白酶caspase 1，誘導(dǎo)GSDMD激活，促進(jìn)IL-1β和IL-18釋放，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，引起細(xì)胞焦亡［13］。本研究結(jié)果顯示，與Sham組比較，RIRI組大鼠焦亡相關(guān)蛋白及炎性細(xì)胞因子明顯升高，說明細(xì)胞焦亡在RIRI中發(fā)揮關(guān)鍵作用。與RIRI組比較，Pae 組、TAK242組及Pae+TAK242組TLR4、MyD88、NLRP3、caspase 1、GSDMD、IL-1β、IL-18蛋白表達(dá)水平下降 （均P< 0.05），表明應(yīng)用丹皮酚預(yù)處理可減輕RIRI引起的細(xì)胞焦亡。

TLR4是細(xì)胞膜Ⅰ型跨膜蛋白，能識別病原體相關(guān)的分子模式，通過細(xì)胞信號路徑最終導(dǎo)致炎性細(xì)胞因子和趨化因子釋放。已有研究［14-15］證明TLR4信號通路激活可以增加NLRP3炎癥小體、caspase 1和促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡。RIRI中TLR4觸發(fā)了腎臟的炎癥反應(yīng)，加劇了腎組織損傷。

本研究結(jié)果顯示，與Sham組比較，RIRI組大鼠炎性細(xì)胞因子釋放增加，腎損傷加重。丹皮酚預(yù)處理大鼠細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)減少，腎臟組織損傷減輕及炎性細(xì)胞因子釋放減少，效果與TAK242預(yù)處理相似。其機(jī)制可能是RIRI使TLR4信號通路活化，刺激NLRP3生成增多，產(chǎn)生大量細(xì)胞焦亡，誘發(fā)炎癥風(fēng)暴；而丹皮酚通過抑制TLR4-MyD88-NLRP3通路減少了細(xì)胞焦亡，發(fā)揮腎臟保護(hù)作用。

綜上所述，本研究證實(shí)了丹皮酚可減輕大鼠RIRI，其機(jī)制可能是通過抑制TLR4-MyD88-NLRP3通路，從而抑制細(xì)胞焦亡實(shí)現(xiàn)的。因此，丹皮酚有可能成為未來RIRI精準(zhǔn)治療的新靶點(diǎn)。本研究僅為動物模型實(shí)驗(yàn)研究，丹皮酚調(diào)控TLR4-MyD88-NLRP3通路的具體機(jī)制需完善細(xì)胞實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步論證。