高吳陸怡，王靜艷，2，舒岑皓，尚德淑，韓鎖，商宇

（1.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生態(tài)-免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)與相關(guān)疾病重點實驗室，黑龍江 佳木斯 154007；2.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科，黑龍江 佳木斯 154003；3.中國醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院發(fā)育細胞生物學(xué)教研室，教育部醫(yī)學(xué)細胞生物學(xué)重點實驗室，沈陽 110122；4.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院中心導(dǎo)管室，哈爾濱 150001）

結(jié)直腸癌 （colorectal cancer，CRC） 是消化系統(tǒng)常見的癌癥類型之一。根據(jù)國際癌癥研究機構(gòu)的統(tǒng)計結(jié)果，2020年全球CRC發(fā)病人數(shù)約為190萬，死亡人數(shù)約為93.5萬，其發(fā)病率和死亡率均居于全球前三位［1］。CRC的發(fā)病具有隱匿性，而中晚期CRC的手術(shù)與常規(guī)輔助治療往往無法獲得理想的治療效果［2］。因此，探索新的有效的CRC輔助治療手段具有重大意義。

丹皮酚又名牡丹酚、芍藥醇，是中藥牡丹皮和徐長卿的活性成分［3］。丹皮酚的藥理作用包括抗炎、抗菌、鎮(zhèn)痛以及抗凝血等［4］。在臨床上，丹皮酚片被用于頭痛、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等疾病的治療，丹皮酚軟膏被用于濕疹、皮炎等皮膚病的治療。丹皮酚能夠在多種癌癥（如胃癌［5］、膀胱癌［6］以及食管癌［7］等）中抑制癌細胞增殖，促進癌癥細胞凋亡。丹皮酚在CRC中發(fā)揮治療作用。LI等［8］發(fā)現(xiàn)，丹皮酚通過抑制PGE2的生成和COX-2蛋白的表達，促進CRC細胞的凋亡。LIU等［9］發(fā)現(xiàn)丹皮酚通過抑制Wnt/β-catenin途徑來抑制CRC細胞的增殖，并誘導(dǎo)其發(fā)生細胞周期阻滯。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探索了丹皮酚治療CRC的核心藥物靶點與關(guān)鍵信號通路，旨在為丹皮酚在CRC治療方面的臨床轉(zhuǎn)化提供更加充分的證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫檢索及丹皮酚藥物靶點的篩選

在PubChem數(shù)據(jù)庫獲得丹皮酚的Smiles信號。將Smilesk號輸入到SwissTargetPrediction與TargetNet 2個數(shù)據(jù)庫中檢索丹皮酚的藥物靶點。SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫中可能性值 （Probability） 排序前15名的基因被認為是丹皮酚的可靠藥物靶點［10］；Target-Net數(shù)據(jù)庫中可能性值>0的基因被認為是丹皮酚的可靠藥物靶點［11］。將檢索2個數(shù)據(jù)庫的靶點合并與去除重復(fù)后即為丹皮酚的藥物靶點。

1.2 數(shù)據(jù)庫檢索及CRC疾病靶點的篩選

從數(shù)據(jù)庫GeneCards、Mendelian Inheritance in Man（OMIM） 與Therapeutic Target Database （TTD） 獲取CRC的疾病靶點。Genecards數(shù)據(jù)庫中Score>50的基因被作為疾病靶點保留。OMIM與TTD數(shù)據(jù)庫檢索到的基因均被做為疾病靶點保留。將數(shù)據(jù)匯總并刪除重復(fù)項后即為檢索到的CRC相關(guān)靶點。

1.3 丹皮酚治療CRC藥物靶點的收集

利用Venny在線工具 （https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/） 對丹皮酚的藥物靶點與CRC的藥物靶點取交集并作圖，獲得的共同靶點為丹皮酚治療CRC的靶點。

1.4 藥物靶點的富集分析

通過Metascape平臺對丹皮酚治療CRC的靶點進行基因本體 （gene ontology，GO） 富集分析與京都基因組數(shù)據(jù)庫 （Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG） 信號通路富集分析［12］。方法為輸入相交靶點蛋白的“Gene name”，物種選擇為“H.sapiens”，且選擇Custom Analysis的分析方式，在P≤0.01情況下分別進行GO的生物過程分析和KEGG信號通路分析。

1.5 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò) （protein-protein interaction networks，PPI） 的構(gòu)建

利用STRING平臺 （https：//www.string-db.org/） 與Cytoscape軟件 （版本3.6.0） 完成PPI分析［13］。將藥物靶點導(dǎo)入STRING平臺的檢索欄，設(shè)置置信度為0.4，獲得PPI結(jié)果并下載數(shù)據(jù)。將PPI數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape軟件進行可視化并獲得互作節(jié)點評分。以連通性（Degree） 為主要指標對節(jié)點蛋白排序，連通性大于均值的蛋白為相互作用的樞紐節(jié)點。

1.6 對丹皮酚與樞紐節(jié)點蛋白進行分子對接

用2款基于不同算法的軟件LeDock與CB-Dock2分別對丹皮酚與樞紐節(jié)點蛋白進行分子對接［14-15］。通過其LePro模塊自動處理受體蛋白并生成對接配置文件。用PyMOL軟件 （版本號2.2.0） 獲得受體蛋白的對接口袋，并修改LeDock對接配置文件的口袋位置［16］。導(dǎo)入丹皮酚分子結(jié)構(gòu)后，通過其LeDock模塊完成受體蛋白與丹皮酚的對接。上傳經(jīng)PyMOL軟件刪除配體與水分子的受體蛋白結(jié)構(gòu)文件與丹皮酚結(jié)構(gòu)文件，使用其Auto Blind Docking模塊自動探測受體口袋與完成對接。

2 結(jié)果

2.1 丹皮酚治療CRC的藥物靶點

從SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫篩選得到15個丹皮酚藥物靶點，從TargetNet數(shù)據(jù)庫篩選到了221個藥物靶點。藥物靶點經(jīng)匯總與刪除重復(fù)項后，最終獲得了203個藥物靶點。從GeneCards等數(shù)據(jù)庫獲得的CRC疾病靶點經(jīng)匯總與刪除重復(fù)項后共有710個疾病靶點。藥物靶點與疾病靶點進行重復(fù)交集比對后最終得到21個丹皮酚治療CRC的藥物靶點，見圖1。這些藥物靶點包括AR、ATP4A、CHEK2、CNR2、ESR1、KDR、MDM2、MET、MMP9、PDGFRA、PLA-2G2A、PPARG、PTPN22、RARA、RET、SIRT1、SRC、TERT、TLR9、VCAM1以及EP300。部分藥物靶點的可能性值以及數(shù)據(jù)來源等信息見表1。

表1 丹皮酚與結(jié)直腸癌的交集靶點列表Tab.1 List of intersecting targets between paeonol and colorectal cancer

圖1 丹皮酚靶點與結(jié)直腸癌靶點韋恩圖Fig.1 Venn diagram of paeonol and colorectal cancer targets

2.2 交集靶點的富集分析

GO富集分析結(jié)果顯示，丹皮酚治療CRC的藥物靶點富集于性腺發(fā)育、防御反應(yīng)的調(diào)節(jié)、上皮管的形態(tài)變化、對缺氧的反應(yīng)以及激酶活性的調(diào)節(jié)等生物過程。根據(jù)P值進行排序，排名前20的生物過程見圖2。在KEGG信號通路分析中，藥物靶點被富集于雌激素信號通路、Ras信號通路、Rap1信號通路、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥以及癌癥中的中心碳代謝等33條通路。P值排名前20的信號通路繪圖見圖3。

圖2 GO生物過程富集分析結(jié)果Fig.2 Bioprocess enrichment analysis results

圖3 KEGG信號通路富集分析結(jié)果Fig.3 KEGG signaling pathway enrichment analysis results

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)分析

STRING平臺分析結(jié)果顯示，輸入的21個基因共包含有72種相互作用。Cytoscape重新繪圖后，去除無效的2個節(jié)點后最終得到19個節(jié)點，見圖4。Cytoscape計算PPI網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)連通性 （Degree） 的均值為0.758，高于0.758的節(jié)點蛋白有9個，包括SRC、MMP9、PPARG、ESR1、TERT、SIRT1、MET、EP300、MDM2，說明以上9種蛋白是PPI網(wǎng)絡(luò)中的樞紐蛋白，見表2。

表2 丹皮酚靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的分析Tab.2 Analysis of the protein interaction network of paeonol targets

圖4 丹皮酚靶點蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig.4 Interaction network of paeonol target proteins

2.4 丹皮酚與樞紐蛋白的分子對接

分子對接結(jié)果顯示，丹皮酚與9個樞紐節(jié)點均具有結(jié)合潛力。在LeDock預(yù)測結(jié)果中，與丹皮酚親和力最高的5種蛋白依次為PPARG、ESR1、MMP9、EP300和SRC。CB-Dock2的預(yù)測結(jié)果中親和力最高的5種蛋白依次為MMP9、TERT、EP300、SIRT1和SRC，見表3。綜合2種軟件的預(yù)測結(jié)果，SRC、EP300和MMP9在2款軟件中均表現(xiàn)出了良好的結(jié)合能力，可能為丹皮酚的核心藥物靶點，見圖5A。SRC、EP300和MMP9通過LeDock預(yù)測的最高親和力結(jié)合模式，見圖5B。SRC、EP300和MMP9通過CB-Dock2預(yù)測的最高親和力結(jié)合模式，見圖5C。

表3 丹皮酚與9種樞紐蛋白的分子對接預(yù)測結(jié)果Tab.3 Predicted results of molecular docking of paeonol with nine hub proteins

圖5 丹皮酚與重要靶點蛋白SRC、EP300和MMP9的分子對接模式Fig.5 Molecular docking patterns of paeonol with key target proteins SRC，EP300，and MMP9

3 討論

丹皮酚是中藥材牡丹皮的主要活性成分，具有顯著的抗氧化和消炎作用，廣泛應(yīng)用于醫(yī)療與保健［17］。丹皮酚能夠通過多種分子途徑抑制細胞增殖、侵襲以及誘導(dǎo)細胞凋亡和周期停滯，表現(xiàn)出廣泛的抗癌作用［18］。研究［8-9］證實丹皮酚具有抗CRC的作用。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，從整體出發(fā)分析丹皮酚抗CRC的具體作用機制。

本研究結(jié)果顯示，共21個蛋白涉及丹皮酚的抗CRC作用。通過KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)這21個蛋白富集于Ras、雌激素和Rap1等信號通路。RAS基因（KRAS與NRAS） 的致癌突變在CRC中十分常見，其不僅驅(qū)動癌癥進展，還影響放療、化療與靶向治療的治療效果［19］。雌激素在維持結(jié)腸上皮的結(jié)構(gòu)和生理完整性中起到重要作用，雌激素及其受體與CRC的患病風(fēng)險和癌癥轉(zhuǎn)移呈負相關(guān)［20］。GO富集分析結(jié)果顯示，丹皮酚對CRC的治療作用主要涉及激酶活性的調(diào)節(jié)、MAPK級聯(lián)的調(diào)控、對缺氧的反應(yīng)等生物過程。缺氧是腫瘤微環(huán)境的特征之一，其誘導(dǎo)的HIF信號通路激活與CRC病情進展和預(yù)后不良明顯相關(guān)［21］。由此可見，丹皮酚對CRC相關(guān)信號通路與生物過程具有廣泛的調(diào)控作用。

通過PPI分析和分子對接，從21個靶點中篩選出SRC、EP300以及MMP9作為丹皮酚的核心靶點。SRC為非受體酪氨酸激酶，可以通過不同的激酶途徑 （MAPK，PI3K/Akt/mTOR、JAK/STAT3、PEAK1和Rho/ROCK等） 進行胚胎發(fā)育和細胞生長調(diào)節(jié)，并傳導(dǎo)下游信號以參與癌細胞的細胞增殖、血管生成、遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移［22］。SRC在CRC的患者中呈顯著高表達，并且與腫瘤的轉(zhuǎn)移和生存預(yù)后密切相關(guān)［23］。MMP9是基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員，腫瘤細胞中基質(zhì)金屬蛋白酶的早期表達有助于細胞外基質(zhì)的重塑，并釋放膜結(jié)合生長因子，為腫瘤發(fā)生奠定微環(huán)境。MMP9在血管生成、轉(zhuǎn)移和癌癥侵襲中的作用已被證實，并且與癌細胞的存活和擴散相關(guān)［24］，其在CRC中高表達并且參與癌細胞的轉(zhuǎn)移［25］。EP300是組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶，其通過影響染色質(zhì)重塑調(diào)控基因表達。EP300在CRC癌組織中表達異常，其可能通過調(diào)控BAX的表達影響CRC的疾病進程［26］。SRC、EP300和MMP9廣泛參與到顯著富集的信號通路與生物過程。例如，在排名前20的KEGG信號通路中，SRC參與其中11條通路，MMP9參與其中10條通路，SRC與MMP9共同參與的信號通路有6條。以上的結(jié)果表明SRC、EP300以及MMP9可能通過多種途徑調(diào)控CRC細胞的發(fā)展進程，有望成為新的治療靶點。

綜上所述，丹皮酚能夠靶向SRC、EP300與MMP9，通過調(diào)控Ras、Rap1等信號通路與激酶活性、對缺氧的反應(yīng)等生物過程，發(fā)揮治療結(jié)直腸癌的作用。本研究的不足之處是沒有進行體內(nèi)與體外的實驗驗證，應(yīng)該在未來的研究中繼續(xù)探索與補充。