楊森林，張國秋，李超，李克文

（青海大學附屬醫(yī)院骨科，西寧 810000）

激素性股骨頭壞死 （steroid-induced osteonecrosis of the femoral head，SONFH） 是破壞退行性疾病，是近年來隨著糖皮質(zhì)激素廣泛應(yīng)用而引發(fā)的股骨壞死疾?。?］。皮質(zhì)類固醇是引起SONFH發(fā)生的最常見原因［2］。SONFH病理上表現(xiàn)為股骨頭局部血液循環(huán)障礙導致股骨頭供血減少、骨髓間充質(zhì)干細胞 （bone manrrow mesenchymal stem cells，BMSCs） 成骨分化受到抑制、破骨細胞異?；罨瑢е鹿俏蘸托鹿侵亟ㄊШ?，最終股骨頭壞死、塌陷［3］。目前，SONFH發(fā)病機制尚不明確，缺乏統(tǒng)一的治療方法。因此，尋找相關(guān)治療靶點至關(guān)重要。微RNA （microRNA，miRNA） 異常表達影響骨骼代謝［4］。其中，miR-133a在骨骼增殖、分化等功能中發(fā)揮重要作用［5］，沉默miR-133a表達能夠緩解糖皮質(zhì)激素誘導的骨質(zhì)疏松，并影響間充質(zhì)干細胞功能，在骨代謝中發(fā)揮重要作用［6］。生長相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2 （runt-related transcription factor 2，RUNX2） 在骨發(fā)育及后期均調(diào)解骨形成，RUNX2失活抑制間充質(zhì)干細胞向成骨分化［7］；骨形態(tài)蛋白2 （bone morphogenetic protein 2，BMP2） 能夠誘導骨和軟骨形成，其靶細胞是未分化的間充質(zhì)干細胞［8］。進一步研究［9］發(fā)現(xiàn)miR-133a能夠靶向調(diào)控RUNX2，抑制miR-133a能夠增強RUNX2的活性和增加骨骼修復(fù)能力，推測miR-133a在SONFH中可能發(fā)揮類似功效影響骨代謝。本研究分析SONFH患者BMSCs中miR-133a的表達情況，探討miR-133a調(diào)控RUNX2/ BMP2信號通路參與SONFH的機制，旨在為SONFH靶向治療提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本來源及處理

收集2021年6月至2022年6月青海大學附屬醫(yī)院接受髖關(guān)節(jié)置換的SONFH患者 （SONFH組） 骨髓（2 mL） 及股骨頸骨折不愈合患者 （對照組） 骨髓 （2 mL）。本研究獲得青海大學附屬醫(yī)院倫理委員會批準 （20210403）。將骨髓與含有抗凝劑的10%胎牛血清α-MEM培養(yǎng)液輕輕混合，取BMSCs （1.073 g/mL） 分離液在離心管中放置至室溫，轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，液面上緩慢滴加BMSCs分離液，2 000 r/min離心15 min；離心后箭頭吸管輕輕吸取云霧狀細胞層，經(jīng)磷酸緩沖液清洗、2 000 r/min離心5 min，棄上清后加10%胎牛血清α-MEM培養(yǎng)液1 000 r/min離心5 min，棄上清后加10%胎牛血清α-MEM培養(yǎng)液，調(diào)整細胞濃度為5×105/mL接種至6 cm板中，置于37 ℃、CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2 試劑與儀器

引物由上海生工生物工程有限公司合成，RUNX2-3’UTR-WT、RUNX2-3’UTR-MUT、miR-133a模擬物 （miR-133a mimic）、miR-133a模擬物對照 （mimic con）、miR-133a抑制劑 （miR-133a inhibitor）、miR-133a抑制劑對照（inhibitor con）、si-RUNX2均由廣州銳博生物科技有限公司提供。一抗RUNX2、BMP2、骨鈣素 （osteocalcin，OCN）、Ⅰ型膠原蛋白 （collagen Ⅰ，COL-Ⅰ），二抗山羊抗兔，CCK-8試劑盒 （英國Abcam公司，貨號分別為ab236639、ab214821、ab108397、ab34710、ab6721、ab228554）；茜素紅染色液 （上海愛必信生物科技有限公司，abs42012987）；油紅O染色液 （上海經(jīng)科化學科技有限公司，WB1016）；cDNA第一條鏈合成試劑盒 （碧云天科技有限公司，D7178S）；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒 （上海翌圣生物科技股份有限公司，11401ES）。主要儀器包括流式細胞儀 （美國BD公司，F(xiàn)ACSCalibur）、實時定量PCR （real-time quantitative PCR，RT-qPCR） 儀 （賽默飛世爾公司，7500）、蛋白凝膠成像儀 （美國Bio-Rad公司，BIO-RADXR）、酶標儀 （深圳匯松科技發(fā)展有限公司，MB-530）。

1.3 方法

1.3.1 BMSCs鑒定：

1.3.1.1 細胞表型鑒定 細胞培養(yǎng)至第3代，經(jīng)胰蛋白酶消化、1 500 r/min離心15 min，收集細胞沉淀，經(jīng)磷酸緩沖液清洗后制成1×105/mL細胞，取100 μL熒光標記的抗體［CD71、CD44、CD34、人類白細胞抗原DR等位基因 （human leukocyte antigen DR allele，HLA-DR） ］10 μL室溫孵育30 min，磷酸緩沖液洗去未標記抗體，上清中添加300 μL磷酸緩沖液，流式細胞術(shù)檢測細胞表型。

1.3.1.2 定向誘導BMSCs成骨分化 細胞按照1×104/mL接種至細胞爬片上，置于6孔板中，37 ℃、CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，吸取原培養(yǎng)液，加入1×10-7mol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、50 mg/L L-抗壞血酸、5 μg/L rhTGF-β1、10%胎牛血清α-MEM培養(yǎng)液；空白對照添加10%胎牛血清α-MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，倒置顯微鏡每天觀察細胞生長及增殖情況。第21天取出載玻片，茜素紅染色鑒定成骨分化能力。

1.3.1.3 定向誘導BMSCs成脂分化 細胞按照3×103/mL接種至細胞爬片上，置于6孔板中，待細胞80%～90%時，加入1 μmol/L地塞米松、0.5 mmol/L IBMX、10 mg/L牛胰島素、1 mmol/L吲哚美辛、10%胎牛血清α-MEM培養(yǎng)液；空白對照添加10%胎牛血清α-MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，7 d后取出玻片，油紅O染色并拍照。

1.3.2 RT-qPCR檢測BMSCs中miR-133a、RUNX2mRNA表達：對照組、SONFH組經(jīng)鑒定的1×105/mL BMSCs，TRIzol法提取總RNA，cDNA第一條鏈合成試劑盒合成cDNA，RT-qPCR儀檢測miR-133a、RUNX2mRNA表達。miR-133a，正向 5’-TTTGGTCCCCTTCAAC-3’，反向 5’-TAGCTATCCTTTGCT-3’；U6，正向5’-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3’，反向5’-CAGGGGCCA TGCTAATCTT-3’；RUNX2，正向5’-TTGGAATCGAT GGTAATTATCTTTAG-3’，反向5’-AATCCTATTGCG GTAATCTTACCTTAAT-3’；GAPDH，正向5’-ACGG CAAGTTCAACGGCACAG-3’，反向 5’-GAAGACGC CAGTAGACTCCACGAC-3’。20 μL反應(yīng)體系：400 ng/μL cDNA 1 μL、2×SYBR qPCR Mix 10 μL、正向/反向引物 （10 μmol/L） 各0.5 μL，ddH2O 8 μL。反應(yīng)條件：95 ℃、30 s；95 ℃、30 s，miR-133a：61 ℃、30 s；RUNX2：60 ℃、30 s，40個循環(huán)。2-ΔΔCt法計算miR-133a、RUNX2mRNA相對表達水平。

1.3.3 Western blotting檢測BMSCs中RUNX2蛋白表達：對照組、SONFH組經(jīng)鑒定的BMSCs細胞添加蛋白裂解酶冰上裂解細胞20 min，12 000 r/min 4 ℃離心20 min，上清即為總蛋白。每個樣品 （20 μg） 分離蛋白，PVDF膜280 mA 40 min轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，對應(yīng)一抗RUNX2、GAPDH，4 ℃孵育過夜；加入對應(yīng)二抗室溫孵育1 h，蛋白顯色液顯膜，蛋白凝膠成像儀拍照并定量分析。

1.3.4 雙熒光素酶驗證miR-133a與RUNX2的靶向位點：生物信息學軟件ENCORI/starBase （https：//rnasysu.com/encori/） 預(yù)測miR-133a與RUNX2存在結(jié)合位點。設(shè)計合成RUNX2的3’UTR-WT和MUT，分別與miR-133a mimic或mimic con共轉(zhuǎn)染至SONFH患者骨髓提取的BMSCs中，雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測各組熒光素酶活性。

1.3.5 實驗分組：實驗分為對照組、SONFH組、inhibitor con組、miR-133a inhibitor組、miR-133a inhibitor+si-RUNX2組。除對照組外，其他各組均用SONFH分離的BMSCs實驗，按照Lipofectamine 2000試劑說明書分別轉(zhuǎn)染inhibitor con、miR-133a inhibitor、miR-133a inhibitor+si-RUNX2，轉(zhuǎn)染6 h后更換為10%胎牛血清α-MEM培養(yǎng)液。

1.3.6 RT-qPCR檢測各組細胞中miR-133a、RUNX2mRNA：各組細胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h，參照1.3.2方法檢測。

1.3.7 Western blotting檢測各組BMSCs中RUNX2蛋白：各組細胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h，參照1.3.3方法檢測。

1.3.8 CCK-8檢測細胞增殖情況：各組細胞按照1×105/mL置于96孔板中，每孔100 μL，10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)24、48、72 h時各組對應(yīng)添加CCK-8試劑 （10 μL） 繼續(xù)培養(yǎng)2 h，酶標儀檢測450 nm處吸光度 （optical density，OD）值。

1.3.9 茜素紅染色鑒定細胞礦化能力：各組細胞按照1×105/mL置于6孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)21 d，茜素紅染液染色，倒置顯微鏡下觀察礦化結(jié)節(jié)情況。顯微鏡視野下每個樣品計數(shù)5個孔，采用Image-J軟件定量分析，每個視野下礦化結(jié)節(jié)數(shù)量為礦化結(jié)節(jié)相對數(shù)量。

1.3.10 Western blotting檢測BMSCs中BMP2、BGP、COL-Ⅰ蛋白：各組細胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h，參照1.3.3方法檢測。

1.4 統(tǒng)計學分析

利用GraphPad Prism7.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料采用±s表示，兩組比較采用t檢驗；多組比較采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用SNK-q檢驗。P< 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs鑒定結(jié)果

結(jié)果顯示，對照組和SONFH組細胞表面CD71、CD44表達，CD34、HLA-DR不表達。見圖1。成骨分化21 d茜素紅染色對照組、SONFH組均出現(xiàn)礦化結(jié)節(jié)，結(jié)節(jié)呈紅色散落分布；空白對照細胞為陰性。見圖2。成脂分化7 d油紅O染色，顯微鏡下對照組、SONFH組均可見脂滴被染，呈橙紅色；細胞內(nèi)脂滴沉著，且數(shù)量較多，部分細胞內(nèi)脂滴融合變大成泡狀，細胞核位于中央或被擠向外周?？瞻讓φ诊@微鏡下未見橙紅色出現(xiàn)，未形成脂滴。見圖3。以上結(jié)果提示BMSCs提取成功。

圖1 BMSCs鑒定結(jié)果Fig.1 BMSCs identification results

圖2 茜素紅染色結(jié)果 ×40Fig.2 Alizarin red staining results ×40

圖3 油紅O染色結(jié)果×100Fig.3 Oil red O staining results×100

2.2 對照組和SONFH組BMSCs中miR-133a、RUNX2 mRNA及蛋白表達

結(jié)果顯示，與對照組比較，SONFH組BMSCs中miR-133a表達升高 （P< 0.05），RUNX2mRNA和蛋白表達降低 （P< 0.05）。見圖4、表1。

表1 對照組和SONFH組BMSCs中miR-133a、RUNX2 mRNA和蛋白表達 （n = 6 ）Tab.1 Expression of miR-133a and RUNX2 mRNA and protein in BMSCs in the control group and SONFH group （n = 6 ）

圖4 對照組和SONFH組BMSCs中RUNX2蛋白表達Fig.4 Expression of RUNX2 protein in BMSCs in the control group and SONFH group

2.3 miR-133a與RUNX2的靶向關(guān)系驗證

結(jié)果顯示，miR-133a與RUNX2存在特異性結(jié)合位點，見圖5。雙熒光素酶驗證結(jié)果顯示，與mimic con+RUNX2 3’UTR-WT組 （1.01±0.08） 相比，miR-133a mimic+RUNX2 3’UTR-WT組 （0.52±0.06） 細胞熒光素酶活性下降 （P< 0.05）。而mimic con+RUNX2 3’UTRMUT組 （0.99±0.07） 與miR-133a mimic+RUNX2 3’UTRMUT組 （1.00±0.11） 細胞熒光素酶活性比較差異無統(tǒng)計學意義 （P> 0.05）。

圖5 預(yù)測miR-133a與RUNX2的特異性結(jié)合位點Fig.5 Predicted specific binding sites of miR-133a and RUNX2

2.4 各組BMSCs中miR-133a、RUNX2 mRNA和蛋白表達

結(jié)果顯示，與對照組相比，SONFH組、inhibitor con組、miR-133a inhibitor組、miR-133a inhibitor+si-RUNX2組BMSCs中miR-133a表達升高 （P< 0.05），RUNX2mRNA和蛋白表達降低 （P< 0.05）。與SONFH組和inhibitor con組比較，miR-133a inhibitor組、miR-133a inhibitor+si-RUNX2組BMSCs中miR-133a表達降低 （P< 0.05），RUNX2mRNA和蛋白表達升高 （P< 0.05）。與miR-133a inhibitor組比較，miR-133a inhibitor+si-RUNX2組BMSCs中miR-133a表達升高 （P< 0.05），RUNX2mRNA和蛋白表達降低 （P< 0.05）。見圖6、表2。

表2 各組BMSCs中miR-133a、RUNX2 mRNA和蛋白表達 （n = 6 ）Tab.2 Expressions of miR-133a，RUNX2 mRNA，and RUNX2 protein in BMSCs among the groups （n = 6 ）

圖6 各組BMSCs中RUNX2蛋白表達比較Fig.6 Comparison of RUNX2 protein expression in BMSCs in each group

2.5 miR-133a對各組BMSCs增殖的影響

24、48、72 h檢測細胞增殖的結(jié)果顯示，與對照組相比，SONFH組、inhibitor con組、miR-133a inhibitor組、miR-133a inhibitor+si-RUNX2組OD值降低 （P<0.05）。與SONFH組和inhibitor con組相比，miR-133a inhibitor組、miR-133a inhibitor+si-RUNX2組OD值升高 （P< 0.05）。與miR-133a inhibitor組相比，miR-133a inhibitor+si-RUNX2組OD值降低 （P< 0.05）。見表3。

表3 各組不同時間OD值比較 （n = 6 ）Tab.3 Comparison of OD values at different times in each group （n = 6 ）

2.6 miR-133a對BMSCs礦化的影響

結(jié)果顯示，與對照組 （68.48±7.18） 相比，SONFH組 （23.42±3.26）、inhibitor con組 （23.51±3.44）、miR-133a inhibitor組 （53.67±6.26）、miR-133a inhibitor+si-RUNX2組 （34.85±4.09） BMSCs礦化結(jié)節(jié)相對數(shù)量減少 （P< 0.05）。與SONFH組和inhibitor con組相比，miR-133a inhibitor組、miR-133a inhibitor+si-RUNX2組BMSCs礦化結(jié)節(jié)相對數(shù)量增加 （P< 0.05）。與miR-133a inhibitor組相比，miR-133a inhibitor+si-RUNX2組BMSCs礦化結(jié)節(jié)相對數(shù)量減少 （P< 0.05）。見圖7。

2.7 miR-133a對各組BMP2、BGP、COL-Ⅰ蛋白表達的影響

與對照組相比，SONFH組、inhibitor con組、miR-133a inhibitor組、miR-133a inhibitor+si-RUNX2組BMSCs中BMP2、BGP、COL-Ⅰ蛋白表達降低 （P< 0.05）；與SONFH組、inhibitor con組相比，miR-133a inhibitor組BMSCs中BMP2、BGP、COL-Ⅰ蛋白表達，miR-133a inhibitor+si-RUNX2組BMSCs中BMP2、COL-Ⅰ蛋白表達升高 （P< 0.05）；與miR-133a inhibitor組相比，miR-133a inhibitor+si-RUNX2組BMSCs中BMP2、BGP、COL-Ⅰ蛋白表達降低 （P< 0.05）。見圖8、表4。

圖8 各組BMSCs中BMP2、BGP、COL-Ⅰ蛋白表達比較Fig.8 Comparison of BMP2，BGP and COL-Ⅰ protein expression in BMSCs among all groups

3 討論

近年來由于激素的不規(guī)范使用，SONFH發(fā)生率明顯增加；激素已成為股骨頭壞死的第一致病因子［10］。研究［11］發(fā)現(xiàn)股骨頭壞死患者成骨分化能力明顯降低、壞死組織中出現(xiàn)大量凋亡細胞，成骨細胞數(shù)量減少和功能障礙，導致成骨能力不足，引起骨修復(fù)障礙，加重疾病。BMSCs具有多向分化潛能，在特定條件下能夠成骨分化，在傷口愈合、股骨頭壞死的治療中具有重要作用［12］。因此，發(fā)現(xiàn)與BMSCs定向分化有關(guān)的因子，進而尋找SONFH治療靶點尤為重要。本研究發(fā)現(xiàn)SONFH組BMSCs礦化結(jié)節(jié)相對數(shù)量比對照組減少，提示SONFH患者BMSCs中成骨分化能力降低，進而影響成骨細胞數(shù)量，導致骨修復(fù)障礙。

miR-133a抑制劑增強轉(zhuǎn)化生長因子-β1誘導的肌成纖維細胞分化，產(chǎn)生高水平膠原蛋白的肌成纖維細胞，從而導致肺彈性和功能喪失［13］。miR-133a模擬物可誘導線粒體生成和成肌細胞分化，而miR-133a抑制劑會減弱細胞分化［14］；miR-133a抑制劑可顯著促進糖皮質(zhì)激素 （地塞米松） 處理的間充質(zhì)干細胞的細胞增殖、活力和成骨細胞分化，并抑制向脂肪細胞分化［6］。本研究結(jié)果顯示，SONFH患者BMSCs中miR-133a高表達，BMSCs增殖受到抑制、礦化結(jié)節(jié)數(shù)量減少；降低miR-133a水平后促進細胞增殖、礦化結(jié)節(jié)數(shù)量增加，提示miR-133a可能抑制SONFH患者BMSCs的成骨分化能力和增殖能力。

miRNA靶向調(diào)控基因表達影響疾病進展。RUNX2是miR-133a靶基因之一，miR-133a能夠靶向抑制RUNX2/BMP2信號通路抑制骨形成，從而負向調(diào)節(jié)骨折愈合［15］。RUNX2作為成熟成骨分化重要指標和促進分子，在成骨細胞和間充質(zhì)干細胞中高表達，是骨形成必要轉(zhuǎn)錄因子。RUNX2能夠通過結(jié)合RUNX共有序列 （PuACCPuCA） 調(diào)控骨譜系細胞［16］，可調(diào)控多種因子發(fā)揮作用，且這些調(diào)控元件在成骨細胞基因啟動子中均可找到［17］。BMP2作為RUNX2下游調(diào)控因子之一，可作用間充質(zhì)干細胞，促進間充質(zhì)干細胞的成骨分化［18］。BGP、COL-Ⅰ作為成骨細胞晚期表型和功能蛋白，在成骨合成、礦化反應(yīng)、骨形成中發(fā)揮作用［19］。本研究發(fā)現(xiàn)miR-133a與RUNX2存在靶向結(jié)合位點，并經(jīng)雙熒光素酶驗證。降低miR-133a表達能夠上調(diào)RUNX2表達，進而調(diào)控下游BMP2水平，升高BGP、COL-Ⅰ表達促進成骨分化。在降低miR-133a基礎(chǔ)上干擾RUNX2可逆轉(zhuǎn)上述過程。提示抑制miR-133a的表達能夠靶向上調(diào)RUNX2的表達，從而促進BMSCs成骨分化和增殖，進而可能緩解疾病進展。

綜上所述，SONFH患者BMSCs中miR-133a高表達，抑制miR-133a表達可通過激活RUNX2/BMP2信號通路促進BMSCs成骨分化、增殖。本研究為臨床上SOFNH的治療提供一定理論依據(jù)，但RUNX2僅是miR-133a靶基因之一，miR-133a亦可能通過別的靶基因發(fā)揮作用，今后需進一步研究論證。