曹丹，陳星，湯曉燕，張宇華，鄧尚貴

（1.浙江海洋大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院食品系，浙江 舟山 316022；2.浙江省腫瘤醫(yī)院肝膽胰外科，杭州 310022；3.杭州醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系，杭州 310059）

胰腺導(dǎo)管腺癌 （簡(jiǎn)稱胰腺癌） 是一種高度惡性的腫瘤，患者預(yù)后極差，5年生存率非常低，并且近幾十年來胰腺癌發(fā)病率一直呈上升趨勢(shì)［1］。盡管在藥物治療、免疫治療、手術(shù)治療和介入治療等方面，各種惡性腫瘤的治療方法都取得了突破性進(jìn)展，但胰腺癌的治療進(jìn)展仍非常緩慢［2］。由于胰腺癌對(duì)化療的敏感性較低，并且腫瘤間質(zhì)和微環(huán)境處于免疫抑制狀態(tài)，從而限制了化療和免疫治療的療效。玫瑰樹堿是一種已知有抗腫瘤療效的天然產(chǎn)物，其存在于夾竹桃科植物［3］。作為一種吲哚類生物堿，玫瑰樹堿對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有細(xì)胞毒作用［4］。其主要作用機(jī)制包括抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ活性或與DNA結(jié)合形成共價(jià)鍵，從而阻礙細(xì)胞周期的進(jìn)程，引發(fā)細(xì)胞凋亡等反應(yīng)［5］。近年來研究顯示，玫瑰樹堿能減輕重癥急性胰腺炎相關(guān)性急性肺損傷［6］，并可以發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)［7］。關(guān)于玫瑰樹堿在胰腺癌中作用的相關(guān)研究較少，且玫瑰樹堿能否影響胰腺癌細(xì)胞焦亡的發(fā)生，目前尚未見研究報(bào)道。本研究采用玫瑰樹堿處理胰腺癌PANC-1細(xì)胞，檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)的變化，并結(jié)合癌癥基因組圖譜 （The Cancer Genome Atlas，TCGA） 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析，以闡明玫瑰樹堿誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞焦亡的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

人胰腺癌細(xì)胞系PANC-1，購(gòu)自中科院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所；玫瑰樹堿鹽酸鹽，購(gòu)自美國(guó)Med-ChemExpress公司；青霉素鏈霉素雙抗，購(gòu)自上海Biosharp公司。胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基，購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；CCK-8試劑盒，購(gòu)自美國(guó)Cell Biolabs公司；Western blotting所用抗體，購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；活性氧 （reactive oxygen species，ROS） 檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。以上試劑均按照說明書操作使用。

1.2 方法

1.2.1 CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)：將每孔含有5 000個(gè)PANC-1細(xì)胞的100 μL培養(yǎng)液接種到96孔板中，在5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中穩(wěn)定培養(yǎng)過夜。第2天分別用0、0.625、1.25、2.5、5、10、20、40 μmol/L的玫瑰樹堿處理細(xì)胞，24 h后加入 CCK-8試劑，450 nm波長(zhǎng)下測(cè)量吸光度值。

1.2.2 顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)：使用含0 μmol/L （對(duì)照組） 和3 μmol/L玫瑰樹堿的培養(yǎng)液處理PANC-1細(xì)胞，每天進(jìn)行傳代，經(jīng)過5 d換藥和培養(yǎng)后，100倍和40倍鏡下觀察拍照。

1.2.3 ROS含量檢測(cè)：用0 μmol/L （對(duì)照組） 和3 μmol/L的玫瑰樹堿處理PANC-1細(xì)胞24 h后，倒掉培養(yǎng)液，殘余培養(yǎng)基用PBS洗滌1次。按照說明書配置ROS染色工作液，熒光染色處理細(xì)胞，熒光顯微鏡下拍攝照片。

1.2.4 Transwell實(shí)驗(yàn)：用0 μmol/L （對(duì)照組） 和3 μmol/L的玫瑰樹堿處理PANC-1細(xì)胞24 h后，棄上清，PBS洗3次。消化并收集細(xì)胞，離心。先在下室中添加600 μL含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，再用200 μL 10%胎牛血清培養(yǎng)基重新懸浮10 000個(gè)細(xì)胞并將其加入上室中。孵育24 h后，輕輕刮去上室中的細(xì)胞，并在4%多聚甲醛中固定15 min。PBS洗1次，0.1%結(jié)晶紫染色20 min，再用PBS洗3次，干燥后拍照。

1.2.5 Western blotting：用0、4、8 μmol/L的玫瑰樹堿處理PANC-1細(xì)胞，24 h后收集細(xì)胞并提取蛋白。測(cè)定蛋白濃度后，配置蛋白上樣液，加樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，4 ℃過夜孵育一抗，室溫孵育二抗2 h。最后，用TBST洗滌膜3次，用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光液在凝膠圖像處理系統(tǒng)曝光。

1.2.6 生物信息學(xué)分析：使用京都基因和基因組數(shù)據(jù)庫(kù) （Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）、TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)、分子標(biāo)簽數(shù)據(jù)庫(kù) （一個(gè)包含多個(gè)癌癥相關(guān)基因的數(shù)據(jù)庫(kù)） 和單樣本基因集富集分析等，分析焦亡相關(guān)基因的表達(dá)、預(yù)后和功能等。校正P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。計(jì)量資料用±s表示，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行比較。P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 玫瑰樹堿抑制PANC-1細(xì)胞增殖

不同濃度的玫瑰樹堿處理PANC-1細(xì)胞后，細(xì)胞存活率隨藥物濃度的增加而下降。藥物濃度越高，對(duì)PANC-1細(xì)胞的殺傷力越大。通過細(xì)胞數(shù)量下降程度，計(jì)算半數(shù)抑制濃度 （half maximal inhibitory concentration，IC50）。處理24 h時(shí)，玫瑰樹堿的IC50值為2.836 μmol/L。0.625、1.25、2.5、5、10、20、40 μmol/L玫瑰樹堿處理的PANC-1細(xì)胞與0 μmol/L玫瑰樹堿處理的PANC-1細(xì)胞相比，細(xì)胞存活率均明顯降低 （均P< 0.05）。見圖1。

圖1 玫瑰樹堿對(duì)PANC-1細(xì)胞存活率的影響Fig.1 Effect of ellipticine on the survival rate of PANC-1 cells

2.2 PANC-1細(xì)胞內(nèi)ROS含量增加

熒光染色結(jié)果顯示，3 μmol/L玫瑰樹堿處理24 h后PANC-1細(xì)胞熒光強(qiáng)度較強(qiáng)，ROS含量明顯上升；對(duì)照組部分細(xì)胞仍有熒光染色，表明未處理的PANC-1細(xì)胞中也存在ROS，但含量相對(duì)較低。見圖2。

2.3 玫瑰樹堿使PANC-1細(xì)胞出現(xiàn)焦亡特征性改變

3 μmol/L玫瑰樹堿處理PANC-1細(xì)胞48 h后，大部分細(xì)胞死亡 （高亮細(xì)胞為死細(xì)胞），存活的細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的漲大破裂等焦亡特征性光鏡表現(xiàn)。見圖3。

圖3 玫瑰樹堿處理PANC-1細(xì)胞后細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化Fig.3 Morphological changes of PANC-1 cells treated with ellipticine

2.4 玫瑰樹堿抑制PANC-1細(xì)胞轉(zhuǎn)移

與3 μmol/L玫瑰樹堿組比較，對(duì)照組細(xì)胞結(jié)晶紫染色面積明顯較多 （P< 0.05）。見圖4。提示玫瑰樹堿抑制PANC-1細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。

圖4 玫瑰樹堿對(duì)PANC-1細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響Fig.4 Effect of ellipticine on the migration of PANC-1 cells

2.5 玫瑰樹堿使PANC-1細(xì)胞焦亡

使用0、4、8 μmol/L玫瑰樹堿處理PANC-1細(xì)胞。與0 μmol/L玫瑰樹堿處理的PANC-1細(xì)胞比較，4、8 μmol/L玫瑰樹堿處理的PANC-1細(xì)胞中Bax蛋白表達(dá)未發(fā)生明顯變化，而線粒體復(fù)合物Ⅰ組裝過程中重要蛋白TMEM70的表達(dá)上調(diào) （P< 0.05），焦亡相關(guān)蛋白caspase 3、caspase 4、gasdermin D的表達(dá)均有不同程度上調(diào) （均P< 0.05）。見圖5。4 μmol/L玫瑰樹堿處理的PANC-1細(xì)胞中TMEM70的表達(dá)明顯高于8 μmol/L玫瑰樹堿處理的PANC-1細(xì)胞 （P= 0.023）。4和8 μmol/L玫瑰樹堿處理的PANC-1細(xì)胞比較，其他蛋白的表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （P> 0.05）。

圖5 Western blotting檢測(cè)蛋白表達(dá)的變化Fig.5 Changes of protein expression detected by Western blotting

2.6 預(yù)后模型的建立

為了預(yù)測(cè)胰腺癌的預(yù)后情況，分析6個(gè)與胰腺癌預(yù)后有關(guān)的焦亡相關(guān)基因的表達(dá)，包括白細(xì)胞介素-6 （interleukin，IL-6）、AIM2、NLRP1、caspase4、白細(xì)胞介素-18 （interleukin，IL-18）、caspase3。使用以上基因構(gòu)建Nomogram預(yù)測(cè)模型，該模型基于一些可能與胰腺癌預(yù)后相關(guān)的蛋白，并將胰腺癌原發(fā)灶的病理分期 （T分期） 和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 （N分期） 作為參數(shù)。見圖6。

圖6 ROC曲線及生存預(yù)測(cè)模型Fig.6 ROC curve and survival prediction model

2.7 焦亡相關(guān)蛋白可能影響T細(xì)胞免疫浸潤(rùn)

免疫分析發(fā)現(xiàn)，IL-6、AIM2、NRLP1作為焦亡相關(guān)蛋白，與T細(xì)胞的免疫浸潤(rùn)有關(guān)。按照r> 0.25和P<0.05標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，這3個(gè)焦亡相關(guān)蛋白與胰腺癌T細(xì)胞的免疫浸潤(rùn)呈正相關(guān)關(guān)系。見圖7。

圖7 焦亡相關(guān)蛋白與胰腺癌T細(xì)胞免疫浸潤(rùn)的關(guān)系Fig.7 Relationship between pyroptosis-associated proteins and immune infiltration of T cells in pancreatic ductal adenocarcinoma

3 討論

胰腺癌由于侵襲性高、預(yù)后差，發(fā)病率在全球范圍內(nèi)不斷上升，其發(fā)病機(jī)制可能與吸煙、糖尿病、慢性胰腺炎等因素相關(guān)［7-9］。作為全球第4大癌癥相關(guān)死亡原因，胰腺癌患者的5年生存率僅為9%［10］。盡管近年來手術(shù)治療、免疫治療等方法取得進(jìn)展，但胰腺癌患者的預(yù)后總體不佳。傳統(tǒng)的預(yù)后指標(biāo)，如年齡、大小、分子分型和TNM分期，被廣泛用于評(píng)估胰腺癌的預(yù)后，然而由于個(gè)體間的異質(zhì)性和微環(huán)境差異，臨床病理參數(shù)相同的患者可能表現(xiàn)出不同的預(yù)后結(jié)果。因此，深入探索胰腺癌的發(fā)病機(jī)制并尋找可靠的預(yù)后生物標(biāo)志物具有重要意義。

研究［11］表明，焦亡可以激活gasdermin D等打孔蛋白，形成6～8個(gè)打孔蛋白復(fù)合物附著于細(xì)胞膜上，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)外流；由于電解質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境失衡，導(dǎo)致細(xì)胞漲大、破裂和解體。通過焦亡的激活，可以使細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)外流，引發(fā)強(qiáng)烈的組織炎癥反應(yīng)，吸引 T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞聚集，形成瀑布效應(yīng)，來攻擊腫瘤。胰腺癌組織內(nèi)部往往處于強(qiáng)烈的免疫抑制狀態(tài)，限制了免疫治療對(duì)胰腺癌的作用效果［12］。而焦亡可以引起強(qiáng)烈的微環(huán)境炎癥，招募免疫細(xì)胞聚集，可能是治療胰腺癌的潛在機(jī)制之一［13］。

玫瑰樹堿是一種存在于植物中的生物堿，有研究表明，其具有抗腫瘤效果。玫瑰樹堿主要通過影響腫瘤細(xì)胞的DNA復(fù)制來發(fā)揮抗腫瘤作用［4］。本研究采用玫瑰樹堿處理PANC-1細(xì)胞后，細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力下降，ROS含量增加。同時(shí)，PANC-1細(xì)胞表現(xiàn)出漲大、破裂并最終死亡的焦亡形態(tài)學(xué)特征。此外，玫瑰樹堿處理PANC-1細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)自噬和調(diào)亡途徑中重要蛋白的表達(dá)并未受到明顯影響，而焦亡相關(guān)蛋白和線粒體代謝相關(guān)蛋白TMEM70表達(dá)上調(diào)。TMEM70是一個(gè)已知影響線粒體復(fù)合物Ⅰ組裝的重要蛋白，能維持腫瘤細(xì)胞線粒體的能量代謝［14］。據(jù)此推測(cè)，玫瑰樹堿可能通過影響線粒體代謝，誘導(dǎo)PANC-1細(xì)胞發(fā)生焦亡。

生物信息學(xué)在生物醫(yī)學(xué)研究和疾病機(jī)制探索中發(fā)揮重要作用，是在基于高通量平臺(tái)的微陣列分析中，從基因表達(dá)譜中篩選出與腫瘤發(fā)生和進(jìn)展相關(guān)的差異表達(dá)基因的較好手段。由于胰腺癌預(yù)后極差，單個(gè)蛋白或單個(gè)因素對(duì)腫瘤的預(yù)后影響往往有限。因此，本研究選擇具有功能性的6個(gè)焦亡相關(guān)蛋白進(jìn)行免疫浸潤(rùn)分析，并構(gòu)建了預(yù)后分析圖。結(jié)果表明，其中3個(gè)蛋白的表達(dá)可能參與招募T細(xì)胞的免疫浸潤(rùn)，可能因此影響胰腺癌免疫治療的效果和預(yù)后。

本研究也存在一定的局限性：（1） 未對(duì)玫瑰樹堿對(duì)其他正常組織、特別是肝腎功能的影響進(jìn)行評(píng)估，可能需要進(jìn)一步的器官或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來確定其在活體中的給藥劑量和給藥方式，以及不良反應(yīng)情況；（2） 未對(duì)足夠數(shù)量的細(xì)胞或組織樣本進(jìn)行研究；（3） 未詳細(xì)論證玫瑰樹堿對(duì)細(xì)胞ROS含量影響的具體機(jī)制以及激活焦亡通路的具體節(jié)點(diǎn)蛋白。

綜上所述，玫瑰樹堿可能通過影響線粒體和ROS含量，激活胰腺癌細(xì)胞的焦亡，從而抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為。這為今后的研究提供了思路，即通過使用玫瑰樹堿提高胰腺癌細(xì)胞對(duì)化療和免疫治療的敏感性，激活胰腺癌的焦亡，改變腫瘤微環(huán)境，影響腫瘤的免疫浸潤(rùn)，提高腫瘤的治療效果，最終改善胰腺癌患者的預(yù)后。