朱程程 程占軍 萬(wàn) 寧 佘 奕 李來(lái)有

胞外pH 值的下降能激活一種在體內(nèi)廣泛分布的特殊配體門(mén)控通道，即酸敏感離子通道（scid-sensing ion channels, ASICs)。ASICs 也稱(chēng)作H+門(mén)控離子通道，是上皮鈉離子通道/退化蛋白（ENaC/DEG）超家族一個(gè)分支。ASICs 由5 個(gè)功能基因編碼，分別為ASIC1、ASIC2、ASIC3、ASIC4和ASIC5。迄今為止，已克隆出ASICs 的7 個(gè)亞單位：ASIC1a、ASIC1b、ASIC2a、ASIC2b、ASIC3、ASIC4、ASIC5，不同亞基存在分布特異性，7個(gè)亞基可以組成同聚體或異聚體酸敏感離子通道。

ASIC1a 是哺乳動(dòng)物體內(nèi)含量最為豐富的ASICs 亞基，由ASIC1 基因編碼，廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周感覺(jué)神經(jīng)元。有研究報(bào)道，ASIC1a 參與突觸可塑性、學(xué)習(xí)記憶及條件性和天生恐懼情緒等生理過(guò)程。課題組前期研究結(jié)果表明，史賓格犬ASIC1 基因存在三個(gè)單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism, SNP），分別在外顯子2 的9 bp 處存在一個(gè)G →C 的單堿基突變（9 G＞C）、在外顯子4 的102 bp 處存在一個(gè)A →C 的單堿基突變（102 A＞C）和外顯子5 的20 bp 處存在一個(gè)G →A 的單堿基突變（20 G＞A），突變位點(diǎn)102 A＞C 和20 G＞A 屬于同義突變，其中突變位點(diǎn)102 A＞C 與史賓格犬恐懼行為密切相關(guān)。

雖然同義SNP 不會(huì)改變編碼的氨基酸，但有研究表明，同義SNP 可通過(guò)改變mRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)而影響基因功能的發(fā)揮，因此，本研究的主要目的在于分析史賓格犬ASIC1 基因的SNPs 是否會(huì)對(duì)mRNA 的二級(jí)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，為今后探索ASIC1 基因影響犬恐懼行為的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

一、材料與方法

（一）序列獲取

犬ASIC1 基因參考序列（NC_006609.3）和mRNA 參 考 序 列（XM_022411217.1）信息資料來(lái)源于美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)中心（National Center Biotechnology Information, NCBI）的GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)。

（二）mRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

使用RNA fold web server 在線(xiàn)生物信息學(xué)分析軟件對(duì)史賓格犬ASIC1 基因外顯子2 上的9 G＞C 位點(diǎn)、外顯子4 上的102 A＞C 位點(diǎn)和外顯子5 上的20 G＞A 位點(diǎn)突變前后基因轉(zhuǎn)錄mRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)并對(duì)比分析。

二、 結(jié)果與分析

利用RNA fold web server 在線(xiàn)軟件對(duì)ASIC1基因外顯子2 上的9 G＞C 位點(diǎn)、外顯子4 上的102 A＞C 位點(diǎn)和外顯子5 上的20 G＞A 位點(diǎn)突變前后轉(zhuǎn)錄的mRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果見(jiàn)下圖。對(duì)比突變前后的ASIC1 基因mRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)圖發(fā)現(xiàn)，外顯子區(qū)3 處突變位點(diǎn)均導(dǎo)致mRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。外顯子2 上的9 G＞C 位點(diǎn)使最小自由能由-1442.34kcal/mol 變?yōu)?1440.44 kcal/mol，突變后最小自由能升高，穩(wěn)定性降低。外顯子4 上的102 A＞C 位點(diǎn)和外顯子5 上的20 G＞A 位點(diǎn)，使最小自由能由-1442.34kcal/mol 分別 變 為-1444.14kcal/mol 和-1442.84kcal/mol，突變后最小自由能降低，穩(wěn)定性升高。

圖1 參考序列

圖2 外顯子2 上9 G＞C 突變后

圖4 外顯子5 上的20 G＞A 位點(diǎn)突變后

三、討論

ASIC1a 不僅參與外周疼痛的感受和傳導(dǎo)、中樞的學(xué)習(xí)和記憶等高級(jí)功能及情感性精神活動(dòng)的調(diào)節(jié)，而且還對(duì)異常的恐懼和焦慮癥的發(fā)生發(fā)展有一定作用。有研究表明，敲除ASIC1a 蛋白，小鼠與杏仁核相關(guān)的暗示功能和恐懼條件反射都明顯受損，而過(guò)表達(dá)ASIC1a，小鼠獲得性恐懼相關(guān)行為會(huì)明顯增加。除小鼠外，人ASIC1 基因rs685012 位點(diǎn)也與驚恐障礙等疾病顯著相關(guān)。課題組前期的研究結(jié)果表明，史賓格犬ASIC1 基因也存在與恐懼行為相關(guān)的SNP位點(diǎn)。

mRNA 是單鏈分子，傾向于通過(guò)自身堿基互補(bǔ)配對(duì)形成大量穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)。mRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)是mRNA 上最重要的翻譯調(diào)控因素之一，參與了mRNA 的細(xì)胞質(zhì)定位、翻譯起始、蛋白質(zhì)共翻譯折疊等過(guò)程的調(diào)控。mRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)可以通過(guò)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的變化來(lái)調(diào)控翻譯過(guò)程，且mRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性與蛋白質(zhì)表達(dá)量之間存在顯著正相關(guān)。

關(guān)于SNP 位點(diǎn)會(huì)對(duì)基因轉(zhuǎn)錄的mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響已經(jīng)在豬、牦牛、荷斯坦牛等多種動(dòng)物上被證實(shí)。從江香豬DRD1 基因的SNPs 位點(diǎn)、大通牦牛TLR2基因SNPs 位點(diǎn)、荷斯坦牛BoLA-DRA 基因和DQA2 基因SNPs 位點(diǎn)都會(huì)影響基因轉(zhuǎn)錄的mRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)，改變最小自由能，改變穩(wěn)定性。

本研究使用RNA fold web server 在線(xiàn)生物信息學(xué)分析軟件對(duì)史賓格犬ASIC1基因外顯子2 上的9 G＞C 位點(diǎn)、外顯子4 上的102 A＞C 位點(diǎn)和外顯子5 上的20 G＞A 位點(diǎn)突變前后mRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)并對(duì)比分析。本研究結(jié)果表明，外顯子2 上的9 G＞C 位點(diǎn)使ASIC1 基因轉(zhuǎn) 錄mRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性降低，外顯子4 上的102 A＞C 位點(diǎn)和外顯子5 上的20 G＞A位點(diǎn)均提高了mRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。由于SNP 可通過(guò)改變mRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性進(jìn)而影響基因功能的發(fā)揮，因此，本研究結(jié)果可為今后探索ASIC1 基因影響犬恐懼行為的分子機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。