單娜，俞耀軍，林李淼，蔡振寨

1.紹興市人民醫(yī)院 消化內(nèi)科，浙江 紹興 312000；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 胃腸外科，浙江 溫州 325000；3.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 消化內(nèi)科，浙江 溫州 325000

以腫瘤新生抗原為靶點(diǎn)的免疫治療因其腫瘤特異性和免疫原性強(qiáng)、安全性高而被認(rèn)為是腫瘤免疫治療的最優(yōu)靶點(diǎn)。我們之前的研究探索了基于腫瘤新生抗原的疫苗療法在小鼠結(jié)直腸癌模型中的可行性和有效性[1]，但此類疫苗在人類結(jié)直腸癌中尚未見(jiàn)應(yīng)用。為進(jìn)一步拓展新生抗原疫苗對(duì)晚期微衛(wèi)星穩(wěn)定（microsatellite stability, MSS）型結(jié)直腸癌（colorectal cancer, CRC）的治療作用，本研究為1例晚期MSS型CRC患者制備并注射了新生抗原疫苗，研究的初步結(jié)果證明了基于腫瘤新生抗原疫苗的可行性及安全性。

1 病例資料

1.1 病史及一般資料 患者，男，40歲，既往體健。2010年3月10日于上海行“結(jié)腸癌根治術(shù)”，術(shù)后病理提示：乙狀結(jié)腸潰瘍型中分化腺癌，侵及全層，周圍淋巴結(jié)見(jiàn)癌轉(zhuǎn)移（5/18），術(shù)后因個(gè)人原因未進(jìn)行輔助化療及定期隨訪。2013年復(fù)查發(fā)現(xiàn)肝、肺轉(zhuǎn)移性腫瘤，隨后于揚(yáng)州武警醫(yī)院行肝肺轉(zhuǎn)移瘤微波消融術(shù)。2019年至溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院行肝、肺穿刺檢查，病理免疫組化結(jié)果均提示符合結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移，基因檢測(cè)提示未測(cè)得用藥靶點(diǎn)，后接受兩次肺轉(zhuǎn)移瘤微波消融術(shù)及一次肝轉(zhuǎn)移瘤微波消融術(shù)。2019年12月開始接受新生抗原疫苗治療。本研究涉及人體樣本，相應(yīng)的設(shè)計(jì)、方案和修改均獲得溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（編號(hào)：LCKY2018-67）。

1.2 腫瘤新生抗原疫苗制備及注射 使用All-Prep DNA/RNA微型試劑盒（Qiagen, USA/Illumina,USA）從術(shù)后腫瘤組織的石蠟切片及外周靜脈血中提取DNA和RNA，完成全外顯子組DNA和RNA測(cè)序?；贛uPeXI（V1.2.0）[2]、NetMHCpan 4.0和變異效應(yīng)預(yù)測(cè)器（variant effect predictor, VEP）數(shù)據(jù)庫(kù)[3]對(duì)DNA突變和人類白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen, HLA）進(jìn)行整合分析，根據(jù)HLA結(jié)合親和力、表達(dá)水平、與自身肽的相似性和突變等位基因頻 率[4-6]，對(duì)每個(gè)肽進(jìn)行優(yōu)先級(jí)評(píng)分。具有高優(yōu)先級(jí)得分的候選新生抗原將最終被選擇用于合成疫苗。

疫苗為27個(gè)氨基酸組成的長(zhǎng)多肽，以入選的新生抗原突變點(diǎn)為中心，突變點(diǎn)前后各增加13個(gè)氨基酸[7-8]。采用標(biāo)準(zhǔn)固相合成肽的原理合成新生抗原多肽，多肽的純化和純度分析采用反相高效液相色譜法（reversed phase-high performance liquid chromatography, RP-HPLC）。疫苗的質(zhì)檢包括細(xì)菌內(nèi)毒素、真菌D葡聚糖檢測(cè)、細(xì)菌真菌涂片檢查及小鼠異常毒性檢測(cè)。

擬于患者治療第1、第4、第8、第15和第22天接受疫苗基礎(chǔ)階段注射，在第12周和第20周接受疫苗加強(qiáng)階段注射。具體方法為：將疫苗與聚肌胞注射液（廣東南國(guó)藥業(yè)有限公司）1:1混勻，在雙側(cè)腋下和腹股溝行皮下注射治療，每次按照逆時(shí)針順序完成4個(gè)部位的皮下注射。

1.3 安全性評(píng)估 使用國(guó)家癌癥研究所不良事件共同術(shù)語(yǔ)標(biāo)準(zhǔn)（4.0版）進(jìn)行評(píng)分，通過(guò)評(píng)估臨床不良事件的發(fā)生率來(lái)評(píng)估疫苗治療安全性?；颊咭呙缱⑸淝昂蟮某Ｒ?guī)血指標(biāo)變化也作為安全性評(píng)價(jià)的客觀依據(jù)。

1.4 臨床監(jiān)測(cè)及干擾素-γ（i n t e r f e r o n gamma, IFN-γ）酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)（enzyme-linked immunosorbent spot, ELISpot）檢測(cè) 在新生抗原疫苗治療前后進(jìn)行臨床腫瘤標(biāo)記物監(jiān)測(cè)。每?jī)蓚€(gè)月進(jìn)行一次增強(qiáng)CT檢查，以確定是否存在可測(cè)量的腫瘤轉(zhuǎn)移灶。在完成基礎(chǔ)階段及加強(qiáng)階段的注射治療后，利用IFN-γ ELISPOT試劑盒（深圳達(dá)科為生物科技有限公司）檢測(cè)新生抗原特異性T細(xì)胞中的IFN-γ，評(píng)估新生抗原的免疫反應(yīng)。

1.5 本例患者疫苗治療的可行性及安全性評(píng)估結(jié)果 患者于2019年12月至2020年7月完成了8次疫苗注射治療（見(jiàn)圖1）。治療及隨訪期間，患者癌胚抗原（carcinoembryonic antigen, CEA）指標(biāo)降至正常范圍并維持11個(gè)月（見(jiàn)圖2），胸部增強(qiáng)CT顯示肺部多發(fā)轉(zhuǎn)移灶進(jìn)展較前控制（見(jiàn)圖3）。ELISpot結(jié)果顯示，新生抗原疫苗治療后的外周單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMCs）對(duì)新生抗原的應(yīng)答活性顯著增強(qiáng)（見(jiàn)圖4）。

圖1 患者治療和臨床隨訪圖

圖2 CEA監(jiān)測(cè)圖

圖3 肺部轉(zhuǎn)移瘤胸部增強(qiáng)CT圖像

圖4 疫苗治療免疫反應(yīng)監(jiān)測(cè)圖

疫苗治療期間未觀察到明顯的治療相關(guān)不良事件，常規(guī)血檢查也未發(fā)現(xiàn)明顯異常。

2 討論

經(jīng)全外顯子組測(cè)序分析，該患者共測(cè)得508個(gè)突變肽，根據(jù)評(píng)分系統(tǒng)其中有246個(gè)突變肽被認(rèn)定為新生抗原，最終有7個(gè)新生抗原被選定用于疫苗的合成。患者入組后共接受8次疫苗治療，在新生抗原疫苗接種期間未觀察到明顯的不良事件，并且沒(méi)有因毒性作用而延遲給藥。在觀察期間，患者CEA指標(biāo)降至正常范圍并維持11個(gè)月，胸部增強(qiáng)CT顯示肺部多發(fā)轉(zhuǎn)移灶進(jìn)展較前控制。通過(guò)監(jiān)測(cè)外周靜脈血中的PBMCs，發(fā)現(xiàn)疫苗治療后機(jī)體產(chǎn)生了較強(qiáng)的免疫反應(yīng)。截至臨床試驗(yàn)截止日期，患者的無(wú)進(jìn)展生存期（progression-free survival, PFS）已達(dá)24個(gè)月。上述結(jié)果的分析表明，即使是MSS型晚期CRC患者也有望從這種免疫療法中獲益。

目前，我國(guó)CRC的發(fā)病率在全身惡性腫瘤中居第五位[9]，約20%的CRC首次就診時(shí)已是IV期，其5年生存率僅為13%[10-12]。CRC晚期確診率高、晚期生存率低已成為不容忽視的現(xiàn)狀。由于錯(cuò)失最佳手術(shù)機(jī)會(huì)、放化療方案單一、可用的靶向藥物不多等因素使得晚期CRC患者經(jīng)常面臨“無(wú)藥可醫(yī)”的困境。2013年，腫瘤的免疫治療被Science雜志評(píng)為年度十大科學(xué)突破之首[13]。目前，基于免疫檢查點(diǎn)抑制劑（immune checkpoint inhibitors, ICIs）的免疫療法已廣泛應(yīng)用于肺癌、轉(zhuǎn)移性黑色素瘤、食管癌等腫瘤的治療[14-16]。Keynote-177隨機(jī)III期臨床試驗(yàn)表明，使用帕博利珠單抗（pembrolizumab）治療微衛(wèi)星不穩(wěn)定型（microsatellite instabilityhigh,MSI-H）轉(zhuǎn)移性CRC患者的PFS優(yōu)于化療，同時(shí)影像學(xué)評(píng)價(jià)也顯示帕博利珠單抗組的總緩解率和完全緩解率較高[17]。這有力地證明了基于ICIs的免疫療法在MSI-H型轉(zhuǎn)移性CRC治療中的臨床價(jià)值。2015年和2016年，美國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)（American Society of Clinical Oncology, ASCO）發(fā)表了程序性死亡受體1（programmed cell death protein 1, PD-1）/程序性死亡配體1（programmed cell death 1 ligand 1, PD-L1）抑制劑帕博利珠單抗和納武單抗（nivolumab）治療晚期CRC的臨床試驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果表明MSI-H型CRC患者客觀緩解率優(yōu)良，緩解時(shí)間較長(zhǎng)，藥物不良反應(yīng)可控。然而，占絕大多數(shù)MSS型的晚期患者很難從ICIs免疫治療中獲益[18]。因此，破除MSS型晚期CRC患者的免疫抵抗或提出新的免疫治療方法，成為了CRC免疫治療研究的熱點(diǎn)。

基于新生抗原的腫瘤疫苗已被證明是治療黑色素瘤和晚期肺癌的安全有效的疫苗[8，19]。相關(guān)研究表示基于腫瘤新生抗原的疫苗會(huì)觸發(fā)特異性T細(xì)胞對(duì)疫苗接種前未檢測(cè)到的預(yù)測(cè)新表位的反應(yīng)，這也有力地證明了存在利用自身免疫系統(tǒng)殺死腫瘤細(xì)胞的可能性[20]。目前，一些臨床試驗(yàn)已經(jīng)證明了這些疫苗的安全性和有效性[21]。然而，關(guān)于晚期CRC腫瘤個(gè)體化疫苗治療的研究很少。課題組前期將個(gè)體化新生抗原疫苗注射到結(jié)腸癌小鼠模型體內(nèi)，初步驗(yàn)證了新生抗原鑒定的可行性、治療的安全性和有效性[1]。本研究為1例MSS型晚期CRC患者進(jìn)行新生抗原疫苗治療，評(píng)估了腫瘤疫苗治療晚期CRC的可行性和安全性，為結(jié)直腸癌患者的免疫治療提供了新的思路。初步結(jié)果表明，新生抗原疫苗是一種安全可行的MSS型CRC治療策略。

然而，我們的臨床試驗(yàn)入組患者數(shù)量少，且未能進(jìn)行多中心臨床試驗(yàn)，對(duì)新生抗原疫苗有效性的評(píng)估仍欠完善，這些問(wèn)題都需要投入更多的時(shí)間和精力去解決。