金勁激，蔡一奇，楊佳欣，程駿，王鵬飛

溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 胃腸外科，浙江 溫州 325015

胃癌在全球癌癥相關死亡原因中排名第四，也是排名第五的常見癌種[1]，其發(fā)病率有明顯的地域差異，近60%的胃癌發(fā)生在東亞[2]，而東亞也是全球胃癌相關病死率最高的地區(qū)。此外，研究表明，亞裔美國人的胃癌發(fā)病率高于非西班牙裔白人[3-4]，這表明亞裔胃癌不僅與生活方式和文化有關，還與遺傳有關。但亞洲胃癌患者較其他地區(qū)的胃癌患者有更好的預后，這可能得益于胃癌的早期篩查工作和積極的治療[5]。由于胃癌的預后不僅取決于腫瘤分期，還取決于腫瘤的異質(zhì)性和表觀遺傳分子特征[6]，而胃癌不同種族群體之間存活差異的可能原因尚未闡明，因此探索亞洲胃癌患者的發(fā)病機制將為胃癌患者的預后預測和治療提供新的思路。

MAGEA3（melanoma-associated antigen A3）是最常見也是研究最多的腫瘤睪丸抗原（cancertestis antigen, CTA）之一。它在正常組織中不表達，但在許多腫瘤中特異性高表達[7]。我們的前期研究通過分析TCGA（the Cancer Genome Atlas）數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)MAGEA3可以顯著影響胃癌患者的免疫調(diào)控，并促進胃癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[8]。但TCGA是美國國立衛(wèi)生研究院發(fā)起的一個針對全球的癌癥基因組研究項目，患者構成以美國人群為主，故TCGA的分析結(jié)果不一定適用亞洲人群。而亞洲腫瘤研究組（the Asian Cancer Research Group, ACRG）是由亞洲地區(qū)的實驗室和研究人員組成的一個合作組織，主要致力于研究亞洲地區(qū)的癌癥發(fā)生、發(fā)展和治療，通過對該數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)分析可反映MAGEA3對亞洲胃癌患者的免疫調(diào)控影響。因此，本研究通過分析ACRG中的GSE52254數(shù)據(jù)集，探討MAGEA3對亞洲胃癌患者免疫微環(huán)境及免疫調(diào)節(jié)的影響，并進一步通過收集臨床胃癌患者血清進行了驗證。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)準備 從GEO數(shù)據(jù)庫（GEO:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中下載GSE52254/ACRG數(shù)據(jù)集，其中共有300例亞洲胃癌患者基因信息及臨床信息。根據(jù)MAGEA3基因表達值的中位數(shù)（1.012），將胃癌患者分為MAGEA3 高表達組（150 例）和MAGEA3低表達組（150例）。從TCGA數(shù)據(jù)庫（https://genome-cancer.ucsc.edu/）中下載375例胃癌患者信息，同樣根據(jù)MAGEA3表達值的中位數(shù)將患者分為MAGEA3高表達組（188例）和MAGEA3低表達組（187例）。

1.2 MAGEA3 與腫瘤免疫微環(huán)境的關系 采用ESTIMATE算法對不同組間的RNA表達數(shù)據(jù)進行基質(zhì)評分和免疫評分。比較2組的基質(zhì)評分，免疫評分以及ESTIMATE評分的差異，并用Spearman相關進行相關性分析。

1.3 數(shù)據(jù)庫使用 B E S T 數(shù)據(jù)庫（h t t p s://rookieutopia.com/app_direct/BEST/）是可對生物標志物進行多隊列以及多層面的綜合分析的網(wǎng)站，其中包含17個胃癌數(shù)據(jù)集，3 126個胃癌患者。本研究通過該網(wǎng)站，完成了GSEA分析，并進一步對胃癌患者的免疫微環(huán)境進行驗證。

STRING數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/）是目前數(shù)據(jù)量最豐富、應用最廣泛的研究蛋白質(zhì)相互作用的數(shù)據(jù)庫之一。收錄了超過14 000個物種、 6 000多萬種蛋白、200多億個相互作用的信息。本研究通過STRING數(shù)據(jù)庫完成了蛋白互作分析。

1.4 腫瘤浸潤免疫細胞分析 CIBERSORT是基于線性支持向量回歸（linear support vector regression）原理對人類免疫細胞亞型的表達矩陣進行去卷積的工具。用于芯片表達矩陣和測序表達矩陣，對未知混合物和含有相近細胞類型表達矩陣的去卷積分析優(yōu)于其他方法[5]。通過CIBESORT軟件從GSE52254數(shù)據(jù)集中預測每個組織中22種浸潤免疫細胞類型的比例，對于每個樣品，所有評估的免疫細胞類型部分的總和等于1。為了結(jié)果準確，設定模擬次數(shù)為1 000次，并通過過濾對P＜0.05的樣本進行后續(xù)分析。

1.5 胃癌患者血清及臨床信息收集 收集2022年1月至2022年4月在溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院胃腸外科住院的86例胃癌患者的血清樣本，于手術前留取。入選標準：①經(jīng)病理診斷為胃惡性腫瘤，并行胃癌根治手術（開放或腹腔鏡）或行探查術（開放或腹腔鏡）明確病理分級的胃癌患者。②術前有完整的臨床資料，包括血常規(guī)、血生化、凝血功能指標，淋巴細胞亞群（流式細胞儀檢測）包括T細胞絕對數(shù)（CD4+T細胞絕對數(shù)、CD8+T細胞絕對數(shù)）、B細胞絕對數(shù)、NK細胞絕對數(shù)。③術后有完整的組織病理分期，包括腫瘤大小、位置、分級、病理類型。排除標準：①術前接受新輔助治療患者；②拒絕我院治療或未明確分期患者。本項研究已通過我院倫理委員會備案（KY2022-R042），所有入組患者均簽署知情同意書。

1.6 MAGEA3血清ELISA檢測 MAGEA3 ELISA檢測試劑盒購于長春晶美生物工程有限公司，通過雙抗體夾心法測定血清標本中MAGEA3水平。具體步驟根據(jù)操作說明書進行：①標準品的加樣：設置標準品孔及樣本孔，標準品孔內(nèi)各加不同濃度的標準品 50 μL。②加樣：設空白孔、樣本孔，空白孔除不加樣本及酶標試劑，其余步驟相同。在待測樣本孔中先加樣品稀釋液40 μL，然后再加待測樣本10 μL，輕輕晃動使均勻混合。③每孔加入酶標試劑100 μL。 ④用封板膜封板后37 ℃溫育1 h。⑤將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水稀釋20倍后備用。⑥小心揭開封板 膜，棄去液體，甩干，每孔加入洗滌液靜置0.5 min后棄去，共重復5次后再拍干。⑦每孔加入顯色劑A 50 μL，再加入顯色劑B 50 μL，震蕩均勻，37 ℃避光顯色15 min。⑧每孔加入終止液50 μL，終止反 應。⑨進行測定，以空白孔調(diào)零，測各孔OD值，通過標準曲線計算樣品中MAGEA3含量。

1.7 統(tǒng)計學處理方法 應用R（v.3.6.3）軟件進行數(shù)據(jù)分析。正態(tài)分布的計量資料以表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗；非正態(tài)分布的計量資料以M（P25，P75）表示，2組間比較采用秩和檢驗。計數(shù)資料以頻數(shù)和百分比表示，2組間比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法。應用Spearman相關檢驗分析兩因素相關性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 MAGEA3與腫瘤免疫微環(huán)境的關系 ESTIMATE結(jié)果可見MAGEA3低表達組的免疫評分、基質(zhì)評分以及ESTIMATE評分均顯著高于MAGEA3高表達組（P＜0.001），見圖1。通過Spearman相關分析進一步發(fā)現(xiàn)，MAGEA3表達與腫瘤免疫微環(huán)境中的免疫評分（r= -0.244，P＜0.001）、基質(zhì)評分（r=-0.266，P＜ 0.001）以及ESTIMATE評分（r=-0.277，P＜0.001）呈顯著負相關性（見圖2）。而GSEA分析表明在MAGEA3低表達組中主要富集的相關通路為：T細胞分化、T細胞活化、T細胞擴增、巨噬細胞活化以及免疫細胞調(diào)節(jié)的相關通路，見表1。

表1 基因集富集分析

圖1 MAGEA3高低表達組間ESTIMATE評分、免疫評分以及基質(zhì)評分的比較

圖2 MAGEA3表達與ESTIMATE評分、免疫評分以及基質(zhì)評分的Spearman相關性分析

2.2 MAGEA3與腫瘤浸潤淋巴細胞的關系 為了進一步驗證MAGEA3表達影響胃癌免疫微環(huán)境，使用CIBERSORT算法計算分析了腫瘤浸潤淋巴細胞的比例，并構建了22種免疫細胞譜。與MAGEA3高表達組相比，小提琴圖提示，在MAGEA3低表達組中，幼稚B細胞、漿細胞、CD8+T細胞、γδT細胞、激活的NK細胞浸潤更多，而巨噬細胞M0浸潤更少（見圖3A）。圖3B的關聯(lián)熱圖展示了過濾后的基因表達矩陣以及22個免疫細胞的相對百分比，圖3C表明巨噬細胞M1與活化的CD4+記憶T細胞呈正相關（r=0.580），而巨噬細胞M1與主細胞的負相關最顯著（r=-0.570）。

圖3 使用CIBERSORT方法分析MAGEA3高低表達組之間的免疫浸潤淋巴細胞

2.3 血清MAGEA3蛋白表達與免疫細胞亞群的關系 使用ACRG數(shù)據(jù)分析MAGEA3基因表達與各免疫細胞亞群的相關性，通過Spearman相關性分析可見MAGEA3表達與CD8+T細胞（r=-0.160，P=0.006）及B細胞（r=-0.140，P=0.010）呈顯著負相關，與NK細胞（r=0.130，P=0.020）呈正相關。為進一步驗證上述結(jié)果，我們通過ELISA法檢測了本研究中心胃癌患者血清中的MAGEA3蛋白表達量，并在術前通過流式細胞分析技術計數(shù)了患者的各淋巴細胞亞群的數(shù)量，通過Spearman分析發(fā)現(xiàn)MAGEA3表達量與CD8+T細胞數(shù)量呈顯著負相關，這結(jié)果與ACRG數(shù)據(jù)結(jié)果一致（r=-0.310，P=0.004）。見圖4。

圖4 ACRG（A）以及臨床胃癌血清（B）中各淋巴細胞數(shù)與MAGEA3表達的Spearman相關性分析

2.4 血清MAGEA3蛋白表達與臨床病理資料相關性分析 患者基線資料表見表2，根據(jù)血清MAGEA3 ELISA檢測中位數(shù)14.160，將86例胃癌患者分為高MAGEA3表達組及低表達組。通過對兩組之間臨床病理資料的分析表明，MAGEA3高表達組的淋巴轉(zhuǎn)移數(shù)更多（P=0.020），而在性別、年齡、病理類型、分期等方面，兩組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表3。

表2 胃癌患者基線資料（n=86）

表3 MAGEA3高低表達組與臨床病理資料相關分析（每組n=43）

2.5 MAGEA3表達與CD8+T細胞相關基因的關系 我們從既往文獻及研究中獲取CD8+T細胞相關基因共27個[9]，發(fā)現(xiàn)在MAGEA3高低表達組中有17個基因存在顯著性表達差異（見圖5A），而在獲取的TCGA數(shù)據(jù)庫中，同樣發(fā)現(xiàn)有17個差異表達基因（見圖5B）。對兩組表達差異的基因，取維恩圖后獲取共同表達差異基因14個（見圖5C），分別為：ADRM1、CD37、CD3D、CD3E、CD8A、CSE1L、GZMA、GZMH、GZMK、IL2RB、LCK、NKG7、PIK3IP1、ZAP70。通過STRING數(shù)據(jù)庫構建蛋白互作相互網(wǎng)絡（見圖5D）可發(fā)現(xiàn)MAGEA3與CD8A存在直接相互作用。并進一步將MAGEA3與14個差異表達基因進行功能及通路富集分析（見圖5E、圖5F），發(fā)現(xiàn)這些基因與免疫功能及相關通路存在密切相關性。

圖5 CD8+ T細胞相關基因與MAGEA3相關性

3 討論

在臨床工作中，我們發(fā)現(xiàn)胃癌患者存在非常顯著的個體差異性，生存時間可為數(shù)月至數(shù)十年[10]。即使相同的TNM分期和接受相同治療的患者，生存結(jié)局也大相徑庭[11]。而在亞洲和西方國家之間，胃癌發(fā)病率和總體生存時間也存在著顯著的種族差異。因此，在胃癌發(fā)病機制的研究中也應關注到研究樣本的種族差異。本研究特意選取了亞洲人群的胃癌數(shù)據(jù)進行進一步分析，使研究結(jié)果更適用于我們中國人群。

在過去的十年中，免疫治療，特別是免疫檢查點抑制劑的使用，成為一種有效的癌癥治療策略[12-13]。 TAKEI等[14]證明，抗PD-1、抗PD-L1和抗CTLA-4可改善晚期胃癌的總生存時間，提示免疫治療方法具有長期和持久緩解胃癌的前景，但現(xiàn)有的胃癌免疫治療仍存在整體有效率低，個體差異大，獲益人群受限等缺點，這促使了研究者們不斷地進行免疫相關基因的篩選以及靶向藥物的研發(fā)。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤微環(huán)境，包括細胞外基質(zhì)、基質(zhì)細胞和免疫浸潤細胞，在多種腫瘤的進展、轉(zhuǎn)移和治療反應中起重要作用[15-16]。BAGAEV等[17]研究認為腫瘤微環(huán)境可以預測并影響免疫治療反應。我們通過ESTIMATE評分計算亞洲人群腫瘤中的免疫評分和基質(zhì)評分，發(fā)現(xiàn)在胃癌中MAGEA3的表達與兩者評分呈顯著負相關，提示MAGEA3的表達可能抑制了腫瘤微環(huán)境的免疫狀態(tài)，而通過后續(xù)的GSEA分析證實了MAGEA3的低表達患者中存在多條免疫相關通路的激活。其中，免疫細胞是免疫微環(huán)境的重要組成部分，我們使用CIBERSORT算法評估了胃癌樣品中22種免疫細胞的浸潤比例，發(fā)現(xiàn)MAGEA3低表達組中，幼稚B細胞，漿細胞，CD8+T細胞，γδT細胞，激活的NK細胞浸潤更多。同時，本研究在臨床樣本中，通過ELISA實驗以及流式細胞術檢測進一步驗證上述結(jié)果。通過血清ELISA分析胃癌患者MAGEA3蛋白與外周血淋巴細胞亞群相關性，同樣觀察到MAGEA3與CD8+T細胞呈負相關，而CD8+T細胞是持續(xù)性免疫活動的關鍵因素[18]。JIN等[19]檢索了EMBASE、PubMed和Web of Science數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)具有高水平的CD8+T細胞的腫瘤患者在接受免疫治療后，可以有更好的無進展生存期和總生存期。因此，低表達MAGEA3的胃癌患者因較高的CD8+T細胞比例，可能對免疫治療的應答更佳，這也需要后續(xù)大規(guī)模臨床研究分析證實。而蛋白互作分析提示MAGEA3與CD8A可能存在直接相互作用，這需進一步實驗進行驗證。

本研究提示了MAGEA3的高表達影響胃癌的免疫微環(huán)境，從而可能影響腫瘤的進展和治療效果，與我們前期的研究[8]具有一致性，即，不管在亞洲人群還是西方人群，MAGEA3對于胃癌免疫微環(huán)境的影響都是存在的。結(jié)合既往研究分析[7，20]，其可能的原因如下：首先，MAGEA3可能影響腫瘤細胞的免疫原性，高水平表達的MAGEA3會導致抗原提示細胞與T細胞相互作用的抗原呈遞分子的表達下降，產(chǎn)生抗原逃逸。其次，MAGEA3可能對免疫細胞的數(shù)量和功能產(chǎn)生負面影響。最后，MAGEA3與腫瘤微環(huán)境中免疫相關信號通路的調(diào)節(jié)也有關聯(lián)。

綜上所述，本研究通過對ACRG胃癌數(shù)據(jù)的挖掘分析聯(lián)合臨床胃癌患者血清樣本的檢測，提示MAGEA3表達影響胃癌免疫微環(huán)境的變化，特別是影響了CD8+T細胞的浸潤。雖然臨床樣本數(shù)有限，且尚未進行進一步機制研究，但結(jié)合既往研究結(jié)果，MAGEA3可能作為潛在的免疫調(diào)節(jié)基因參與胃癌的發(fā)生發(fā)展，并通過影響免疫微環(huán)境及免疫反應調(diào)控胃癌的進展。