金勁激，蔡一奇，楊佳欣，程駿，王鵬飛

溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 胃腸外科，浙江 溫州 325015

胃癌在全球癌癥相關(guān)死亡原因中排名第四，也是排名第五的常見癌種[1]，其發(fā)病率有明顯的地域差異，近60%的胃癌發(fā)生在東亞[2]，而東亞也是全球胃癌相關(guān)病死率最高的地區(qū)。此外，研究表明，亞裔美國人的胃癌發(fā)病率高于非西班牙裔白人[3-4]，這表明亞裔胃癌不僅與生活方式和文化有關(guān)，還與遺傳有關(guān)。但亞洲胃癌患者較其他地區(qū)的胃癌患者有更好的預(yù)后，這可能得益于胃癌的早期篩查工作和積極的治療[5]。由于胃癌的預(yù)后不僅取決于腫瘤分期，還取決于腫瘤的異質(zhì)性和表觀遺傳分子特征[6]，而胃癌不同種族群體之間存活差異的可能原因尚未闡明，因此探索亞洲胃癌患者的發(fā)病機(jī)制將為胃癌患者的預(yù)后預(yù)測(cè)和治療提供新的思路。

MAGEA3（melanoma-associated antigen A3）是最常見也是研究最多的腫瘤睪丸抗原（cancertestis antigen, CTA）之一。它在正常組織中不表達(dá)，但在許多腫瘤中特異性高表達(dá)[7]。我們的前期研究通過分析TCGA（the Cancer Genome Atlas）數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)MAGEA3可以顯著影響胃癌患者的免疫調(diào)控，并促進(jìn)胃癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[8]。但TCGA是美國國立衛(wèi)生研究院發(fā)起的一個(gè)針對(duì)全球的癌癥基因組研究項(xiàng)目，患者構(gòu)成以美國人群為主，故TCGA的分析結(jié)果不一定適用亞洲人群。而亞洲腫瘤研究組（the Asian Cancer Research Group, ACRG）是由亞洲地區(qū)的實(shí)驗(yàn)室和研究人員組成的一個(gè)合作組織，主要致力于研究亞洲地區(qū)的癌癥發(fā)生、發(fā)展和治療，通過對(duì)該數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)分析可反映MAGEA3對(duì)亞洲胃癌患者的免疫調(diào)控影響。因此，本研究通過分析ACRG中的GSE52254數(shù)據(jù)集，探討MAGEA3對(duì)亞洲胃癌患者免疫微環(huán)境及免疫調(diào)節(jié)的影響，并進(jìn)一步通過收集臨床胃癌患者血清進(jìn)行了驗(yàn)證。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)準(zhǔn)備 從GEO數(shù)據(jù)庫（GEO:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中下載GSE52254/ACRG數(shù)據(jù)集，其中共有300例亞洲胃癌患者基因信息及臨床信息。根據(jù)MAGEA3基因表達(dá)值的中位數(shù)（1.012），將胃癌患者分為MAGEA3 高表達(dá)組（150 例）和MAGEA3低表達(dá)組（150例）。從TCGA數(shù)據(jù)庫（https://genome-cancer.ucsc.edu/）中下載375例胃癌患者信息，同樣根據(jù)MAGEA3表達(dá)值的中位數(shù)將患者分為MAGEA3高表達(dá)組（188例）和MAGEA3低表達(dá)組（187例）。

1.2 MAGEA3 與腫瘤免疫微環(huán)境的關(guān)系 采用ESTIMATE算法對(duì)不同組間的RNA表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行基質(zhì)評(píng)分和免疫評(píng)分。比較2組的基質(zhì)評(píng)分，免疫評(píng)分以及ESTIMATE評(píng)分的差異，并用Spearman相關(guān)進(jìn)行相關(guān)性分析。

1.3 數(shù)據(jù)庫使用 B E S T 數(shù)據(jù)庫（h t t p s://rookieutopia.com/app_direct/BEST/）是可對(duì)生物標(biāo)志物進(jìn)行多隊(duì)列以及多層面的綜合分析的網(wǎng)站，其中包含17個(gè)胃癌數(shù)據(jù)集，3 126個(gè)胃癌患者。本研究通過該網(wǎng)站，完成了GSEA分析，并進(jìn)一步對(duì)胃癌患者的免疫微環(huán)境進(jìn)行驗(yàn)證。

STRING數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/）是目前數(shù)據(jù)量最豐富、應(yīng)用最廣泛的研究蛋白質(zhì)相互作用的數(shù)據(jù)庫之一。收錄了超過14 000個(gè)物種、 6 000多萬種蛋白、200多億個(gè)相互作用的信息。本研究通過STRING數(shù)據(jù)庫完成了蛋白互作分析。

1.4 腫瘤浸潤免疫細(xì)胞分析 CIBERSORT是基于線性支持向量回歸（linear support vector regression）原理對(duì)人類免疫細(xì)胞亞型的表達(dá)矩陣進(jìn)行去卷積的工具。用于芯片表達(dá)矩陣和測(cè)序表達(dá)矩陣，對(duì)未知混合物和含有相近細(xì)胞類型表達(dá)矩陣的去卷積分析優(yōu)于其他方法[5]。通過CIBESORT軟件從GSE52254數(shù)據(jù)集中預(yù)測(cè)每個(gè)組織中22種浸潤免疫細(xì)胞類型的比例，對(duì)于每個(gè)樣品，所有評(píng)估的免疫細(xì)胞類型部分的總和等于1。為了結(jié)果準(zhǔn)確，設(shè)定模擬次數(shù)為1 000次，并通過過濾對(duì)P＜0.05的樣本進(jìn)行后續(xù)分析。

1.5 胃癌患者血清及臨床信息收集 收集2022年1月至2022年4月在溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院胃腸外科住院的86例胃癌患者的血清樣本，于手術(shù)前留取。入選標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理診斷為胃惡性腫瘤，并行胃癌根治手術(shù)（開放或腹腔鏡）或行探查術(shù)（開放或腹腔鏡）明確病理分級(jí)的胃癌患者。②術(shù)前有完整的臨床資料，包括血常規(guī)、血生化、凝血功能指標(biāo)，淋巴細(xì)胞亞群（流式細(xì)胞儀檢測(cè)）包括T細(xì)胞絕對(duì)數(shù)（CD4+T細(xì)胞絕對(duì)數(shù)、CD8+T細(xì)胞絕對(duì)數(shù)）、B細(xì)胞絕對(duì)數(shù)、NK細(xì)胞絕對(duì)數(shù)。③術(shù)后有完整的組織病理分期，包括腫瘤大小、位置、分級(jí)、病理類型。排除標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前接受新輔助治療患者；②拒絕我院治療或未明確分期患者。本項(xiàng)研究已通過我院倫理委員會(huì)備案（KY2022-R042），所有入組患者均簽署知情同意書。

1.6 MAGEA3血清ELISA檢測(cè) MAGEA3 ELISA檢測(cè)試劑盒購于長春晶美生物工程有限公司，通過雙抗體夾心法測(cè)定血清標(biāo)本中MAGEA3水平。具體步驟根據(jù)操作說明書進(jìn)行：①標(biāo)準(zhǔn)品的加樣：設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔及樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔內(nèi)各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品 50 μL。②加樣：設(shè)空白孔、樣本孔，空白孔除不加樣本及酶標(biāo)試劑，其余步驟相同。在待測(cè)樣本孔中先加樣品稀釋液40 μL，然后再加待測(cè)樣本10 μL，輕輕晃動(dòng)使均勻混合。③每孔加入酶標(biāo)試劑100 μL。 ④用封板膜封板后37 ℃溫育1 h。⑤將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水稀釋20倍后備用。⑥小心揭開封板 膜，棄去液體，甩干，每孔加入洗滌液靜置0.5 min后棄去，共重復(fù)5次后再拍干。⑦每孔加入顯色劑A 50 μL，再加入顯色劑B 50 μL，震蕩均勻，37 ℃避光顯色15 min。⑧每孔加入終止液50 μL，終止反 應(yīng)。⑨進(jìn)行測(cè)定，以空白孔調(diào)零，測(cè)各孔OD值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中MAGEA3含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 應(yīng)用R（v.3.6.3）軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布的計(jì)量資料以M（P25，P75）表示，2組間比較采用秩和檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)和百分比表示，2組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。應(yīng)用Spearman相關(guān)檢驗(yàn)分析兩因素相關(guān)性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MAGEA3與腫瘤免疫微環(huán)境的關(guān)系 ESTIMATE結(jié)果可見MAGEA3低表達(dá)組的免疫評(píng)分、基質(zhì)評(píng)分以及ESTIMATE評(píng)分均顯著高于MAGEA3高表達(dá)組（P＜0.001），見圖1。通過Spearman相關(guān)分析進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，MAGEA3表達(dá)與腫瘤免疫微環(huán)境中的免疫評(píng)分（r= -0.244，P＜0.001）、基質(zhì)評(píng)分（r=-0.266，P＜ 0.001）以及ESTIMATE評(píng)分（r=-0.277，P＜0.001）呈顯著負(fù)相關(guān)性（見圖2）。而GSEA分析表明在MAGEA3低表達(dá)組中主要富集的相關(guān)通路為：T細(xì)胞分化、T細(xì)胞活化、T細(xì)胞擴(kuò)增、巨噬細(xì)胞活化以及免疫細(xì)胞調(diào)節(jié)的相關(guān)通路，見表1。

表1 基因集富集分析

圖1 MAGEA3高低表達(dá)組間ESTIMATE評(píng)分、免疫評(píng)分以及基質(zhì)評(píng)分的比較

圖2 MAGEA3表達(dá)與ESTIMATE評(píng)分、免疫評(píng)分以及基質(zhì)評(píng)分的Spearman相關(guān)性分析

2.2 MAGEA3與腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞的關(guān)系 為了進(jìn)一步驗(yàn)證MAGEA3表達(dá)影響胃癌免疫微環(huán)境，使用CIBERSORT算法計(jì)算分析了腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞的比例，并構(gòu)建了22種免疫細(xì)胞譜。與MAGEA3高表達(dá)組相比，小提琴圖提示，在MAGEA3低表達(dá)組中，幼稚B細(xì)胞、漿細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、γδT細(xì)胞、激活的NK細(xì)胞浸潤更多，而巨噬細(xì)胞M0浸潤更少（見圖3A）。圖3B的關(guān)聯(lián)熱圖展示了過濾后的基因表達(dá)矩陣以及22個(gè)免疫細(xì)胞的相對(duì)百分比，圖3C表明巨噬細(xì)胞M1與活化的CD4+記憶T細(xì)胞呈正相關(guān)（r=0.580），而巨噬細(xì)胞M1與主細(xì)胞的負(fù)相關(guān)最顯著（r=-0.570）。

圖3 使用CIBERSORT方法分析MAGEA3高低表達(dá)組之間的免疫浸潤淋巴細(xì)胞

2.3 血清MAGEA3蛋白表達(dá)與免疫細(xì)胞亞群的關(guān)系 使用ACRG數(shù)據(jù)分析MAGEA3基因表達(dá)與各免疫細(xì)胞亞群的相關(guān)性，通過Spearman相關(guān)性分析可見MAGEA3表達(dá)與CD8+T細(xì)胞（r=-0.160，P=0.006）及B細(xì)胞（r=-0.140，P=0.010）呈顯著負(fù)相關(guān)，與NK細(xì)胞（r=0.130，P=0.020）呈正相關(guān)。為進(jìn)一步驗(yàn)證上述結(jié)果，我們通過ELISA法檢測(cè)了本研究中心胃癌患者血清中的MAGEA3蛋白表達(dá)量，并在術(shù)前通過流式細(xì)胞分析技術(shù)計(jì)數(shù)了患者的各淋巴細(xì)胞亞群的數(shù)量，通過Spearman分析發(fā)現(xiàn)MAGEA3表達(dá)量與CD8+T細(xì)胞數(shù)量呈顯著負(fù)相關(guān)，這結(jié)果與ACRG數(shù)據(jù)結(jié)果一致（r=-0.310，P=0.004）。見圖4。

圖4 ACRG（A）以及臨床胃癌血清（B）中各淋巴細(xì)胞數(shù)與MAGEA3表達(dá)的Spearman相關(guān)性分析

2.4 血清MAGEA3蛋白表達(dá)與臨床病理資料相關(guān)性分析 患者基線資料表見表2，根據(jù)血清MAGEA3 ELISA檢測(cè)中位數(shù)14.160，將86例胃癌患者分為高M(jìn)AGEA3表達(dá)組及低表達(dá)組。通過對(duì)兩組之間臨床病理資料的分析表明，MAGEA3高表達(dá)組的淋巴轉(zhuǎn)移數(shù)更多（P=0.020），而在性別、年齡、病理類型、分期等方面，兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

表2 胃癌患者基線資料（n=86）

表3 MAGEA3高低表達(dá)組與臨床病理資料相關(guān)分析（每組n=43）

2.5 MAGEA3表達(dá)與CD8+T細(xì)胞相關(guān)基因的關(guān)系 我們從既往文獻(xiàn)及研究中獲取CD8+T細(xì)胞相關(guān)基因共27個(gè)[9]，發(fā)現(xiàn)在MAGEA3高低表達(dá)組中有17個(gè)基因存在顯著性表達(dá)差異（見圖5A），而在獲取的TCGA數(shù)據(jù)庫中，同樣發(fā)現(xiàn)有17個(gè)差異表達(dá)基因（見圖5B）。對(duì)兩組表達(dá)差異的基因，取維恩圖后獲取共同表達(dá)差異基因14個(gè)（見圖5C），分別為：ADRM1、CD37、CD3D、CD3E、CD8A、CSE1L、GZMA、GZMH、GZMK、IL2RB、LCK、NKG7、PIK3IP1、ZAP70。通過STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建蛋白互作相互網(wǎng)絡(luò)（見圖5D）可發(fā)現(xiàn)MAGEA3與CD8A存在直接相互作用。并進(jìn)一步將MAGEA3與14個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行功能及通路富集分析（見圖5E、圖5F），發(fā)現(xiàn)這些基因與免疫功能及相關(guān)通路存在密切相關(guān)性。

圖5 CD8+ T細(xì)胞相關(guān)基因與MAGEA3相關(guān)性

3 討論

在臨床工作中，我們發(fā)現(xiàn)胃癌患者存在非常顯著的個(gè)體差異性，生存時(shí)間可為數(shù)月至數(shù)十年[10]。即使相同的TNM分期和接受相同治療的患者，生存結(jié)局也大相徑庭[11]。而在亞洲和西方國家之間，胃癌發(fā)病率和總體生存時(shí)間也存在著顯著的種族差異。因此，在胃癌發(fā)病機(jī)制的研究中也應(yīng)關(guān)注到研究樣本的種族差異。本研究特意選取了亞洲人群的胃癌數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步分析，使研究結(jié)果更適用于我們中國人群。

在過去的十年中，免疫治療，特別是免疫檢查點(diǎn)抑制劑的使用，成為一種有效的癌癥治療策略[12-13]。 TAKEI等[14]證明，抗PD-1、抗PD-L1和抗CTLA-4可改善晚期胃癌的總生存時(shí)間，提示免疫治療方法具有長期和持久緩解胃癌的前景，但現(xiàn)有的胃癌免疫治療仍存在整體有效率低，個(gè)體差異大，獲益人群受限等缺點(diǎn)，這促使了研究者們不斷地進(jìn)行免疫相關(guān)基因的篩選以及靶向藥物的研發(fā)。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤微環(huán)境，包括細(xì)胞外基質(zhì)、基質(zhì)細(xì)胞和免疫浸潤細(xì)胞，在多種腫瘤的進(jìn)展、轉(zhuǎn)移和治療反應(yīng)中起重要作用[15-16]。BAGAEV等[17]研究認(rèn)為腫瘤微環(huán)境可以預(yù)測(cè)并影響免疫治療反應(yīng)。我們通過ESTIMATE評(píng)分計(jì)算亞洲人群腫瘤中的免疫評(píng)分和基質(zhì)評(píng)分，發(fā)現(xiàn)在胃癌中MAGEA3的表達(dá)與兩者評(píng)分呈顯著負(fù)相關(guān)，提示MAGEA3的表達(dá)可能抑制了腫瘤微環(huán)境的免疫狀態(tài)，而通過后續(xù)的GSEA分析證實(shí)了MAGEA3的低表達(dá)患者中存在多條免疫相關(guān)通路的激活。其中，免疫細(xì)胞是免疫微環(huán)境的重要組成部分，我們使用CIBERSORT算法評(píng)估了胃癌樣品中22種免疫細(xì)胞的浸潤比例，發(fā)現(xiàn)MAGEA3低表達(dá)組中，幼稚B細(xì)胞，漿細(xì)胞，CD8+T細(xì)胞，γδT細(xì)胞，激活的NK細(xì)胞浸潤更多。同時(shí)，本研究在臨床樣本中，通過ELISA實(shí)驗(yàn)以及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)進(jìn)一步驗(yàn)證上述結(jié)果。通過血清ELISA分析胃癌患者M(jìn)AGEA3蛋白與外周血淋巴細(xì)胞亞群相關(guān)性，同樣觀察到MAGEA3與CD8+T細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)，而CD8+T細(xì)胞是持續(xù)性免疫活動(dòng)的關(guān)鍵因素[18]。JIN等[19]檢索了EMBASE、PubMed和Web of Science數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)具有高水平的CD8+T細(xì)胞的腫瘤患者在接受免疫治療后，可以有更好的無進(jìn)展生存期和總生存期。因此，低表達(dá)MAGEA3的胃癌患者因較高的CD8+T細(xì)胞比例，可能對(duì)免疫治療的應(yīng)答更佳，這也需要后續(xù)大規(guī)模臨床研究分析證實(shí)。而蛋白互作分析提示MAGEA3與CD8A可能存在直接相互作用，這需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

本研究提示了MAGEA3的高表達(dá)影響胃癌的免疫微環(huán)境，從而可能影響腫瘤的進(jìn)展和治療效果，與我們前期的研究[8]具有一致性，即，不管在亞洲人群還是西方人群，MAGEA3對(duì)于胃癌免疫微環(huán)境的影響都是存在的。結(jié)合既往研究分析[7，20]，其可能的原因如下：首先，MAGEA3可能影響腫瘤細(xì)胞的免疫原性，高水平表達(dá)的MAGEA3會(huì)導(dǎo)致抗原提示細(xì)胞與T細(xì)胞相互作用的抗原呈遞分子的表達(dá)下降，產(chǎn)生抗原逃逸。其次，MAGEA3可能對(duì)免疫細(xì)胞的數(shù)量和功能產(chǎn)生負(fù)面影響。最后，MAGEA3與腫瘤微環(huán)境中免疫相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)節(jié)也有關(guān)聯(lián)。

綜上所述，本研究通過對(duì)ACRG胃癌數(shù)據(jù)的挖掘分析聯(lián)合臨床胃癌患者血清樣本的檢測(cè)，提示MAGEA3表達(dá)影響胃癌免疫微環(huán)境的變化，特別是影響了CD8+T細(xì)胞的浸潤。雖然臨床樣本數(shù)有限，且尚未進(jìn)行進(jìn)一步機(jī)制研究，但結(jié)合既往研究結(jié)果，MAGEA3可能作為潛在的免疫調(diào)節(jié)基因參與胃癌的發(fā)生發(fā)展，并通過影響免疫微環(huán)境及免疫反應(yīng)調(diào)控胃癌的進(jìn)展。