項益嵐,胡淵博,黃婷婷,陳謝滔,陳琛斌,盧明東
1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 放射科,浙江 溫州 325015;2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 胃腸外科,浙江 溫州 325027;3.溫州醫(yī)科大學(xué) 微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室 分子病毒與免疫研究所,浙江 溫州 325035
結(jié)腸癌是全球第三大常見的惡性腫瘤,也是腫瘤相關(guān)死亡的第二大原因[1]。流行病學(xué)統(tǒng)計顯示2020年我國結(jié)腸癌新發(fā)病例達56萬[2]。手術(shù)切除是目前結(jié)腸癌治療的最主要手段,隨著治療方式及技術(shù)不斷改進,早期結(jié)腸癌患者的生存率有所提高。但大多數(shù)結(jié)腸癌患者在被確診時已是中晚期并已發(fā)生局部轉(zhuǎn)移,無論是術(shù)后化療,或者免疫療法的效果并不理想,其五年生存率不足15%[3-5]。因此,挖掘結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的生物標(biāo)志物,并進一步探索結(jié)腸癌惡性進展的分子機制,對于結(jié)腸癌防治具有重要意義。
N6-腺苷酸甲基化(N6 adenylate methylation,m6A)修飾作為最常見的RNA表觀遺傳學(xué)修飾之一,近年來被發(fā)現(xiàn)參與多種人類疾病的進展[6-7]。而甲基轉(zhuǎn)移酶樣因子3(methyltransferase-like 3,METTL3),作為最主要的m6A甲基轉(zhuǎn)移酶,參與食管癌、胃癌、宮頸癌等多種腫瘤的進展[8-11]。一方面,METTL3通過調(diào)控m6A甲基化修飾參與腫瘤細胞的增殖、凋亡、遷移、侵襲以及耐藥等生物學(xué)過程[12]。另一方面,METTL3還能以非m6A依賴途徑結(jié)合真核細胞啟動因子(eukaryotic initiation factor 4A, eIF4A)調(diào)控mRNA翻譯效率,促進腫瘤的惡性進展[13]。然而,關(guān)于METTL3在結(jié)腸癌的表達情況及其對結(jié)腸癌細胞惡性表型的調(diào)控作用鮮有報道。本研究通過公共數(shù)據(jù)庫和溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院結(jié)腸癌臨床樣本檢測METTL3在結(jié)腸癌中的表達水平,并在細胞水平評估METTL3對結(jié)腸癌細胞生物學(xué)表型的影響,旨在為臨床結(jié)腸癌的防控提供新的指導(dǎo)。
1.1 材料
1.1.1 細胞及組織標(biāo)本:人結(jié)腸癌細胞DLD-1 和HCT-116均購自中國科學(xué)院細胞庫,分別使用含10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)的DMEM培養(yǎng)基和RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng),并置于37 ℃、含5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中。
1.1.2 試劑:胎牛血清、DEME培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司。METTL3兔多克隆抗體購自美國Proteintech公司,GAPDH兔多克隆抗體購自杭州賢至生物有限公司。Western blot相關(guān)試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司,ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific公司。CCK-8試劑購自上海翌圣生物科技股份有限公司;Transwell小室購自廣州潔特生物有限公司;基質(zhì)膠購自美國BD生物科技有限公司。靶向METTL3的小干擾RNA由廣州銳博生物技術(shù)有限公司設(shè)計合成,序列為:si-NC:5’-GGCTCTAGAAAAGCCTATGC-3’;si-METTL3-001:5’-CAAGTATGTTCACTATGAA-3’;si-METTL3-002:5’-GCAAGTATGTTCACTATGA-3’。
1.2 方法
1.2.1 標(biāo)本收集:收集2014—2018年在溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院接受結(jié)腸腺癌根治術(shù)的癌組織和癌旁正常組織(距離癌灶至少5 cm范圍的組織)。納入標(biāo)準(zhǔn):患者年齡>18周歲,接受結(jié)腸腺癌根治性手術(shù)治療,術(shù)后病理學(xué)檢查確診為結(jié)腸癌,同意參加此項研究者;排除標(biāo)準(zhǔn):患者接受新輔助化療,拒絕接受根治性手術(shù)治療,或合并其他惡性腫瘤或嚴重的器質(zhì)性疾病。最終,共納入481例結(jié)腸腺癌組織和59例癌旁組織。本研究經(jīng)溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(2021R092)。
1.2.2 生物信息學(xué)分析:使用cBioPortal數(shù)據(jù)庫(https://www.cbioportal.org/)分析METTL3在泛癌中的突變情況、三維結(jié)構(gòu)、單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNPs)以及拷貝數(shù)變異(copy number variation, CNVs)情況。下載TGCA數(shù)據(jù)庫中結(jié)腸腺癌的mRNA表達數(shù)據(jù)和臨床病理特征。使用GEOquery包從GEO數(shù)據(jù)庫下載GSE17536、GSE17537、GSE29621、GSE39582中結(jié)腸癌患者基因芯片表達數(shù)據(jù)及相應(yīng)患者對應(yīng)的臨床病理特征和預(yù)后信息。分析METTL3基因在結(jié)腸癌組織和癌旁正常組織中的表達差異,及其與患者總生存率(overall survival, OS)和無病生存期(diseasefree survival, DFS)的關(guān)系。
1.2.3 免疫組化:所有手術(shù)切除的結(jié)腸腺癌組織石蠟包埋,切片,脫蠟,水化,抗原修復(fù),封閉,使用METTL3抗體室溫孵育2 h后滴加DAKO免疫組化專用二抗,37 ℃孵育1 h。經(jīng)DAB顯色和蘇木素復(fù)染,鹽酸乙醇分化,浸入磷酸鹽緩沖液中反藍,脫水,封片。顯微鏡下觀察并拍攝目的蛋白表達情況,使用Image-Pro Plus圖像軟件進行陽性細胞半定量分析。
1.2.4 Western blot實驗:細胞轉(zhuǎn)染siRNA后48 h,使用RIPA細胞裂解液裂解細胞,提取細胞蛋白。通過SDS-PAGE凝膠電泳,將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上,用5%脫脂牛奶封閉40 min,再用相應(yīng)的一抗4 ℃孵育過夜,二抗室溫孵育1 h,最后使用顯影液于曝光機下顯色。
1.2.5 CCK-8 細胞增殖實驗:將結(jié)腸癌細胞系以 4 000個/孔的密度接種于96孔板中,12 h后進行轉(zhuǎn)染處理。待轉(zhuǎn)染1、2、3 d后,加入CCK-8試劑孵育 3 h,并使用酶標(biāo)儀檢測450 nm波長處的吸光度。在減去空白組數(shù)值調(diào)零后,比較各組增殖情況。
1.2.6 Transwell細胞遷移及侵襲實驗:將細胞按一定密度接種于六孔板內(nèi),待細胞貼壁后轉(zhuǎn)染處理,轉(zhuǎn)染24 h后將細胞消化后用無血清培養(yǎng)基重懸,按1×105/孔加入到Transwell上室,下室加入含10% FBS的完全培養(yǎng)基;其中,侵襲實驗需要在實驗開始前將基質(zhì)膠稀釋后鋪于Transwell上室內(nèi)。在細胞培養(yǎng)箱中孵育24~48 h后取出,4%多聚甲醛固定,結(jié)晶紫染色,洗凈后拭去上室內(nèi)殘余未穿過的細胞,于顯微鏡下觀察并拍攝成功穿過的細胞并計數(shù)。
1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法 使用Graphpad Prism 8.0和R4.0.2進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以表示,兩組比較采用獨立樣本t檢驗,多組比較采用單因素方差分析。計數(shù)資料以例和百分數(shù)表示,2組間比較采用χ2檢驗,2組間等級資料的比較采用秩和檢驗。使用pROC包繪制受試者工作特征(receiver operating characteristic, ROC)曲線以評估METTL3基因的表達對于區(qū)分結(jié)腸腺癌和癌旁組織的診斷準(zhǔn)確性。使用survminer包確定結(jié)腸腺癌組織中METTL3表達的最佳截斷值,進而將患者分成高表達組和低表達組;采用Kaplan-Meier生存曲線分析2組患者之間的生存差異,采用Log-rank檢驗評估2組患者生存時間的差異。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2.1 M E T T L 3 在結(jié)腸癌組織中的表達特征 cBioPortal數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果提示,METTL3在腫瘤組織中存在一定的SNPs或CNVs變異,整體在6%以內(nèi)(見圖1A、圖1B)。TCGA數(shù)據(jù)庫33種不同腫瘤的表達譜分析結(jié)果顯示,METTL3在絕大多數(shù)癌組織中表達顯著上調(diào)(見圖1C)。在TCGA數(shù)據(jù)庫結(jié)腸癌組織中,METTL3表達顯著上調(diào)(P<0.001,見圖2A),且其表達顯著高于配對的癌旁正常組織(P<0.001,見圖2B);同時,其表達狀態(tài)能有效區(qū)分結(jié)腸癌和正常組織(AUC=0.921,見圖2C)。為了進一步驗證這一現(xiàn)象,我們通過免疫組化法檢測了396例結(jié)腸癌組織和48例癌旁正常組織(剔除染色后脫片面積>50%的組織)中METTL3的表達情況(見圖2D)。與上述結(jié)果一致,METTL3在結(jié)腸癌組織中表達上調(diào)(P<0.001,見圖2E;P=0.040,見圖2F)。
圖1 METTL3基因在不同腫瘤中的表達特征
圖2 METTL3在結(jié)腸癌組織中mRNA和蛋白表達顯著升高
2.2 METTL3 高表達提示結(jié)腸癌患者的不良臨床結(jié)局 我們進一步綜合分析了TCGA-COAD數(shù)據(jù)庫和GEO數(shù)據(jù)庫(GSE17563、GSE17537、GSE29621、GSE39582)中共計1 278例結(jié)腸癌患者的表達譜數(shù)據(jù)及其臨床信息,其中表達數(shù)據(jù)經(jīng)去除批次效應(yīng)后合并?;贛ETTL3的表達水平將結(jié)腸癌患者分為高表達組和低表達組;2組患者的生存狀態(tài)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.019),而性別和TNM分期差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見表1。Kaplan-Meier生存分析進一步顯示了METTL3高表達提示結(jié)腸癌患者較差的OS(Log-rankP=0.028)和DFS(Log-rankP= 0.035),見圖3。同時,單因素和多因素Cox回歸分析結(jié)果顯示,結(jié)腸癌TNM分期的II期(HR=1.913,P=0.022),III期(HR=2.903,P<0.001),IV期(HR= 11.206,P<0.001),以及METTL3的高表達(HR= 1.335,P=0.030)是患者不良臨床結(jié)局的獨立危險因素(見表2)。
表2 公共數(shù)據(jù)庫1 278例結(jié)腸癌患者生存預(yù)后的單因素和多因素Cox回歸分析
圖3 Kaplan-Meier曲線展示TCGA數(shù)據(jù)庫合并GEO數(shù)據(jù)庫中結(jié)腸癌患者總生存期(A)和無病生存期(B)與METTL3表達的相關(guān)性
2.5 敲低METTL3表達顯著抑制結(jié)腸癌細胞增殖能力 Western blot結(jié)果顯示,si-METTL3-1 和si-METTL3-2可顯著敲低結(jié)腸癌細胞內(nèi)METTL3的表達水平。CCK-8細胞增殖實驗結(jié)果顯示,METTL3敲低后的HCT-116細胞增殖能力顯著低于si-NC組(P<0.001)。同樣的,此現(xiàn)象在DLD-1 細胞中也得到驗證(P<0.001)。見圖4。以上結(jié)果證實了METTL3的表達水平對于結(jié)腸癌細胞增殖能力具有重要作用,METTL3能促進結(jié)腸癌細胞的增殖能力。
圖4 CCK8實驗評估下調(diào)METTL3的表達對結(jié)腸癌細胞增殖能力的影響
2.6 敲低METTL3表達顯著抑制結(jié)腸癌細胞遷移與侵襲能力 Transwell細胞遷移和侵襲實驗結(jié)果表明,在METTL3敲低后,HCT-116和DLD-1細胞遷移與侵襲能力顯著低于si-NC組(P<0.05),見圖5。
圖5 Transwell實驗評估敲低METTL3對結(jié)腸癌細胞DLD-1和HCT-116遷移和侵襲能力的影響
結(jié)腸癌是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一,目前尚缺少有效預(yù)測結(jié)腸癌患者生存的分子標(biāo)志物及治療靶點。因此,亟需尋找影響結(jié)腸癌惡性進展及患者預(yù)后的關(guān)鍵調(diào)控基因,對于結(jié)腸癌的防治具有重要意義。m6A修飾普遍存在于真核生物mRNA中,其最早于40年前首次報道,但其在人類疾病,尤其是惡性腫瘤中的生物學(xué)功能直到最近才成為研究的焦點[14-15]。METTL3作為m6A修飾主要的甲基轉(zhuǎn)移酶,介導(dǎo)了諸多m6A修飾的生物學(xué)功能。本研究旨在明確METTL3在結(jié)腸癌中的表達情況及臨床意義,并初步探索METTL3對結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的生物學(xué)功能。
通過大樣本量公共數(shù)據(jù)庫生物信息學(xué)分析和本中心臨床組織免疫組織化學(xué)法驗證,本研究證實了METTL3在結(jié)腸癌組織中表達顯著上調(diào)。與本研究結(jié)果相似,LI等[16]通過qRT-PCR和Western blot技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌組織標(biāo)本中METTL3的mRNA和蛋白水平要高于癌旁正常組織。此外,本研究分析發(fā)現(xiàn)METTL3高表達與結(jié)腸癌患者較差的OS和DFS密切相關(guān);單因素和多因素Cox回歸分析進一步證實METTL3可以作為預(yù)測結(jié)腸癌患者預(yù)后的獨立危險因素。這些結(jié)果提示了METTL3可能在結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展在發(fā)揮了重要作用。然而,METTL3對結(jié)腸癌細胞生物學(xué)功能的影響尚不清楚。
本研究中我們通過siRNA靶向敲低結(jié)腸癌細胞中METTL3的表達水平,發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌細胞系DLD-1和HCT-116的增殖能力得到顯著抑制。上述結(jié)果與HAN等[17]研究結(jié)果相似,其研究發(fā)現(xiàn)METTL3以m6A依賴的途徑調(diào)控pri-miR21/222成熟,并促進細胞增殖。WANG等[12]也同樣證實了過表達METTL3能夠促進胃癌細胞增殖,而敲低METTL3表達能夠抑制胃癌細胞增殖。
此外,Transwell實驗結(jié)果證實了敲低METTL3的表達能夠顯著抑制結(jié)腸癌細胞的遷移和侵襲實驗。YUE等[18]發(fā)現(xiàn)METTL3通過調(diào)節(jié)胃癌細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換并促進胃癌轉(zhuǎn)移。同時,HE等[19]研究結(jié)果進一步發(fā)現(xiàn)敲低METTL3的表達后能顯著抑制甲狀腺乳頭狀癌細胞的轉(zhuǎn)移能力。以上結(jié)果充分證實了METTL3作為重要的致癌基因,參與了結(jié)腸癌的惡性進展及惡性細胞表型,但具體機制有待進一步的研究。
本研究的局限在于,缺乏動物水平實驗證METTL3對結(jié)腸癌細胞生物學(xué)表型的影響,同時沒有進一步挖掘METTL3促進結(jié)腸癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移等惡性表型的深層分子機制。此外,本研究還需進一步收集結(jié)腸癌臨床組織樣本對應(yīng)的臨床信息,并從本中心水平探究METTL3表達與結(jié)腸癌患者臨床病理特征和預(yù)后的相關(guān)性。
總而言之,本研究通過大樣本量結(jié)腸癌公共數(shù)據(jù)庫及臨床組織標(biāo)本證實METTL3在結(jié)腸癌組織中表達上調(diào),并可以作為獨立危險因素預(yù)測結(jié)腸癌患者的不良預(yù)后。此外,細胞功能學(xué)實驗進一步證實METTL3能夠促進結(jié)腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力。本研究初步揭示了METTL3在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用,為結(jié)腸癌的治療和靶點挖掘提供一定的理論支持。