張良，楊嘉麒，張?zhí)孛鳎S穎鵬，游濤，倪仲琳

溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 普外科，浙江 溫州 325027

胃癌是高發(fā)病率和高死亡率的惡性腫瘤疾病，嚴重危害人類健康。靶向治療可以顯著延長患者生存期，是晚期胃癌患者不可缺少的治療手段。但是，目前胃癌缺少有效的治療靶點，只有靶向HER2藥物成功應用于胃癌的一線治療[1]。其他如表皮生長因子（epidermal growth factor receptor, EGFR）、 間質(zhì)表皮轉(zhuǎn)化因子（mesenchymal-epithelial transition factor, MET）、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin, mTOR）、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）等治療靶點在胃癌的應用正處于臨床試驗或大部分沒有達到預期結(jié)果[2]。尋找更高效的治療靶點是提高胃癌患者生存的關(guān)鍵[3]。Polo樣激酶（polo-like kinase, PLK）家族是一類絲蘇氨酸蛋白激酶，被認為與細胞周期調(diào)節(jié)有關(guān)。其中，PLK4結(jié)構(gòu)特殊，被發(fā)現(xiàn)與細胞中心粒復制有關(guān)，在眾多腫瘤中呈現(xiàn)高表達，且與預后有一定相關(guān)性[4]。 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)PLK4的高表達可以促進結(jié)腸癌細胞增殖和遷移等惡性表型[5-6]，另外，PLK4靶向治療已經(jīng)被美國食品藥品監(jiān)督管理局批準應用于難治性或復發(fā)的急性骨髓性白血病。但是，PLK4在胃癌方面的研究甚少。有研究基于TCGA胃癌數(shù)據(jù)庫中mRNA的差異表達計算干細胞指數(shù)，提出PLK4與胃癌的細胞干性相關(guān)，高的細胞干性指數(shù)預后更好[7-9]。通過免疫組化檢測PLK4蛋白質(zhì)表達同樣提示胃癌中PLK4相對高表達，但高表達的預后更差[10]。這些報道僅僅停留在相關(guān)性分析上，缺乏PLK4抑制劑對胃癌細胞功能學上的深入研究。PLK4到底可否作為胃癌的治療靶點及其對胃癌細胞功能的影響和機制尚不明確，因此，本研究旨在探討PLK4抑制劑Centrinone（LCR-263）在體外對胃癌細胞的生長、遷移及凋亡的影響，評估其作為胃癌靶向治療藥物的潛在價值。

1 材料和方法

1.1 主要試劑 PLK4 抑制劑Centrinone購于美國MedChemexpress生物科技公司，半胱天冬酶-3 （Caspase-3）、半胱天冬酶-3 裂解體（Cleaved-Caspase-3）、聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶（poly ADPribose polymerase, PARP）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）等抗體購于美國Proteintech Group生物技術(shù)公司，PI3K及其磷酸化抗體購于美國Abcam公司，AKT及其磷酸化抗體購于澳大利亞Affinity Biosciences公司，AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡雙染試劑盒購于美國BD公司，細胞培養(yǎng)基、胎牛血清等購于美國Gibico公司，所用細胞培養(yǎng)皿等耗材購于美國Corning生物科技有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng) 胃癌細胞株AGS、BGC、SGC購于中國科學院上海細胞庫。培養(yǎng)條件為10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2濃度的培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)。

1.3 細胞生長實驗 待細胞長滿至80%～90%時，棄掉培養(yǎng)基，用PBS清洗2 遍后，用胰酶消化胃癌細胞，消化后鋪板，96孔板，每孔5 000個細胞，分別加入PLK4抑制劑Centrinone（0、0.1、1、2、5、10、20、50 μmol/L），藥物溶解在無血清的1640培養(yǎng)基孵育24 h，根據(jù)CCK8試劑盒說明書加入試劑，孵育3 h后，在450 nm波長處檢測吸光度，并計算細胞相對生長情況。

1.4 Transwell細胞遷移實驗 待細胞長滿至80%～90%時，棄掉培養(yǎng)基，用PBS清洗2遍后，用胰酶消化胃癌細胞，細胞計數(shù)后按照每小室20萬個細胞接種，小室上加入100 μL含Centrinone（0、1、2、5 μmol/L）的無血清培養(yǎng)基，小室下加入20% FBS的1640培養(yǎng)基600 μL，Transwell系統(tǒng)放入37 ℃細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h和12 h后取出，計數(shù)方法如下，將Transwell小室取出，用PBS輕柔清洗，將小室放在室溫4%多聚甲醛內(nèi)固定30 min，之后再取出使用PBS洗兩遍，用棉花簽刮去小室內(nèi)的細胞，動作輕柔，避免小室的膜變形影響觀察。使用0.1%的結(jié)晶紫染料進行染色，結(jié)晶紫覆蓋下層細胞，染色20 min。再用PBS清洗，室溫晾干以后在顯微鏡下觀察并拍照，每個小室取5個視野進行拍攝，利用ImageJ軟件進行細胞計數(shù)，最后做統(tǒng)計分析。

1.5 流式細胞術(shù)檢測 細胞消化后鋪到6 孔板內(nèi)，每孔20 萬細胞量，細胞在培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)過夜，待細胞貼壁后更換無血清培養(yǎng)基，并分別加入Centrinone（0、1、2、5 μmol/L），孵育24 h后收集細胞樣本，包括上清和貼壁的全部細胞，根據(jù)AnnexinV-FITC/PI試劑盒說明書進行樣本處理后通過流式細胞計數(shù)儀檢測。重復3次實驗，將結(jié)果匯總進行統(tǒng)計分析。

1.6 Western blot法檢測 細胞總蛋白使用RIPA裂解液提取，并使用BCA方法進行濃度定量。使用SDS-PAGE法進行蛋白電泳，先80 V電泳30 min，再轉(zhuǎn)120 V電泳1 h，轉(zhuǎn)膜使用PVDF膜，條件為恒流200 mA，90 min。然后使用5%脫脂牛奶的TBST進行封閉2 h，之后進行洗膜，然后進行一抗在4 ℃冰箱孵育過夜。次日經(jīng)過TBST洗膜之后，進行二抗孵育，室溫2 h。然后再次洗膜之后，使用ECL發(fā)光液進行蛋白顯影。對蛋白條帶使用ImageJ進行半定量分析。

1.7 生物信息學分析 PLK4 基因在TCGA數(shù)據(jù)庫中的表達量分析使用GEPIA工具（http://gepia. cancer-pku.cn/），通過GEPIA工具分析PLK4的mRNA在胃癌及癌旁組織中的差異表達?；蛐酒姆治鰠⒖糑MPLOT工具（http://kmplot.com/analysis），通過KMPLOT工具分析PLK4在胃癌組織中的蛋白表達量與患者生存預后的相關(guān)性。PLK4 蛋白質(zhì)在組織中的表達參考人類蛋白質(zhì)組學數(shù)據(jù)庫（https://www.proteinatlas.org），觀察PLK4蛋白在胃癌組織中的分布及定位情況。選取的組化編號為PLK4數(shù)據(jù)集ID1042，抗體編號HPA043198。

1.8 統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS19.0進行統(tǒng)計分析，計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 PLK4在胃癌高表達且與預后存在相關(guān)性 在TCGA數(shù)據(jù)庫中對胃癌STAD數(shù)據(jù)集進行分析，PLK4在胃癌組織中的RNA表達量顯著高于癌旁正常組織（P＜0.05），結(jié)合GEO的數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)PLK4的表達量與胃癌患者的生存預后存在顯著相關(guān)性（P=0.001），高表達量提示預后不良，見圖1A、圖1B。免疫組化結(jié)果表明，PLK4 蛋白主要定位于胃癌細胞質(zhì)以及細胞膜，少量細胞在細胞核內(nèi)也有染色，見圖1C。根據(jù)Human Protein Atlas數(shù)據(jù)庫的結(jié)果顯示，HPA043198檢測的組織標本有10對，其中有3個胃癌樣本沒有檢測出PLK4表達，而其余7對為低中度表達，沒有胃癌組織檢測出強陽性。

圖1 PLK4在胃癌中的表達及預后分析

2.2 Centrinone對胃癌細胞具有顯著的生長抑制效應 通過CCK8實驗發(fā)現(xiàn)，Centrinone對胃癌AGS、SGC和BGC均具有較強的生長抑制作用，當藥物濃度達到4 μmol/L濃度時，三種細胞相對存活率都已經(jīng)在50%以下。其中，AGS對藥物的敏感性最高，IC50為1.386 μmol/L，見圖2。

2.3 PLK4抑制劑Centrinone抑制胃癌細胞的遷移 Transwell實驗結(jié)果顯示，同樣的條件下，藥物處理組AGS細胞穿過小室膜的細胞數(shù)量顯著少于未用藥物組，且隨著藥物濃度的增加（1、2、5 μmol/L），AGS細胞遷移數(shù)量逐漸減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖3。

圖3 PLK抑制劑Centrinone對胃癌細胞的遷移抑制實驗結(jié)果

2.4 PLK4 抑制劑Centrinone促進胃癌細胞凋亡 流式細胞術(shù)實驗結(jié)果表明，隨著藥物濃度的增加（1、2、5 μmol/L），細胞凋亡的比例逐漸增多，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見圖4。

圖4 PLK抑制劑Centrinone對胃癌細胞的流式細胞術(shù)實驗結(jié)果

2.5 凋亡相關(guān)蛋白PARP、Caspase-3及其裂解體的變化 Western blot檢測結(jié)果表明，當藥物濃度為1、2、5 μmol/L時，與無藥物相比，隨著藥物濃度的增加，AGS細胞的PARP裂解體蛋白表達量逐漸顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。當藥物濃度為1 μmol/L時，Caspase-3裂解體的蛋白表達量未增加（P＞0.05），而當藥物濃度達到2 μmol/L、 5 μmol/L時，Caspase-3裂解體的蛋白表達量顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見圖5。

圖5 PLK抑制劑Centrinone對胃癌細胞凋亡相關(guān)蛋白PARP、Caspase-3及其裂解體的影響

2.6 Centrinone不影響B(tài)AX蛋白表達但抑制BCL2蛋白表達 當藥物濃度為1、2、5 μmol/L時，與無藥物相比，隨著藥物濃度的增加，AGS細胞的BCL2蛋白表達量逐漸顯著減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），但BAX蛋白沒有顯著變化，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖6。

圖6 PLK抑制劑Centrinone對胃癌細胞BCL2及BAX蛋白的影響

2.7 Centrinone通過抑制PI3K/AKT通路調(diào)控胃癌細胞凋亡 當藥物濃度為1、2、5 μmol/L時，與無藥物相比，隨著藥物濃度的增加，AGS細胞內(nèi)PI3K的磷酸化以及AKT的磷酸化被抑制得越明顯，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見圖7。Centrinone可能是通過抑制PI3K/AKT信號通路調(diào)控胃癌細胞凋亡。

圖7 PLK抑制劑Centrinone對胃癌細胞PI3K/AKT信號通路的影響

3 討論

靶向治療為晚期胃癌患者的生存改善提供可能，但缺乏有效的治療靶點是胃癌靶向治療失敗的主要原因之一[3，11-12]。PLK蛋白激酶家族與細胞的分裂活動有關(guān)，在腫瘤組織中異常高表達，這也使其成為癌癥靶向治療的潛在靶點[13]。PLK4的靶向抑制劑表現(xiàn)出較強的抗腫瘤活性[14-15]。PLK4的抑制可以出現(xiàn)細胞周期的阻斷以及細胞凋亡[16]，出現(xiàn)特征性的PARP裂解以及Caspase 3蛋白裂解[17]。本研究通過TCGA數(shù)據(jù)庫分析及不同濃度的PLK4抑制劑處理不同胃癌細胞系闡述Centrinone在胃癌的潛在治療價值。通過CCK8實驗說明Centrinone顯著抑制胃癌細胞增殖，Transwell實驗說明藥物抑制胃癌細胞遷移，流式凋亡細胞檢測結(jié)果說明藥物對胃癌的促凋亡作用。細胞凋亡是細胞精密調(diào)控的程序性死亡，包括了外源性和內(nèi)源性的凋亡通路[18]。許多抗癌藥物通過誘導腫瘤細胞凋亡發(fā)揮抗癌效應。本研究發(fā)現(xiàn)PLK4抑制劑Centrinone也是通過抑制胃癌細胞生長，顯著誘導胃癌細胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤活性。

本研究還通過Western blot方法檢測PLK4抑制劑Centrinone通過調(diào)控BCL-2以及PI3K/AKT信號通路蛋白發(fā)揮抗腫瘤作用。BCL-2蛋白家族是凋亡調(diào)控的重要成員，其中BCL-2蛋白具有抗凋亡的活性，而BAX蛋白具有促凋亡的活性，兩者共同調(diào)控線粒體應激及相關(guān)下游通路的激活[19]。BCL-2蛋白的降解被認為是PLK抑制劑（靶向PLK1/2/3）誘導凋亡的機制之一[20]，但關(guān)于PLK4的靶向抑制劑對BCL-2蛋白的影響尚未見報道。本研究發(fā)現(xiàn)Centrinone作用后，BCL-2蛋白的表達量顯著下降，但是BAX蛋白表達不顯著，說明Centrinone可能通過抑制BCL-2的表達誘導胃癌細胞凋亡。

PI3K/AKT信號通路是重要的致癌通路，廣泛參與了細胞的遷移、增殖和耐藥性[21]。PI3K/AKT信號通路的激活增加了腫瘤的惡性表型[22]，而抑制則減弱腫瘤細胞增殖，引發(fā)腫瘤細胞凋亡。胃癌的發(fā)生是一個多因素多步驟的過程，包括環(huán)境因素、生活方式以及遺傳因素等，這其中PI3K/AKT信號通路可以調(diào)節(jié)胃癌的增殖與存活，是非常重要的信號通路之一[23]。有一篇文獻報道從1 693個小分子化合物中篩選出能促進人類多能干細胞衍生的心肌細胞成熟的藥物，發(fā)現(xiàn)有多種PLK抑制劑能夠抑制AKT信號通路的激活[24]。也有研究發(fā)現(xiàn)PLK4抑制劑能抑制PI3K/AKT信號通路引發(fā)多發(fā)性骨髓瘤細胞及前列腺癌細胞凋亡[25-26]，發(fā)揮抗腫瘤作用。但是，PLK4在胃癌中的效應及調(diào)控機制未見報道。本研究結(jié)果提示PLK4抑制劑可能也是通過調(diào)控PI3K/AKT信號通路來抑制胃癌細胞增殖和誘導胃癌細胞凋亡。然而PI3K/AKT信號通路的下游分子是非常廣泛的，包括了鼠雙微體2（murine double minute 2, MDM2），叉頭框蛋白O1（forkhead box O1, FoxO1），叉頭框蛋白O3a（forkhead box O3a, FoxO3a），核因子κB（nuclear factor kappa-B, NF-κB），糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β, GSK-3β），以及哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin, mTOR）[23]。下游蛋白的確認有助于更深入了解PLK4抑制劑在治療胃癌過中發(fā)揮的作用，還需要更多研究去確認。

綜上所述，PLK4激酶抑制劑Centrinone可以顯著抑制胃癌細胞增殖、遷移，并誘導凋亡，可能通過抑制BCL-2表達及對PI3K/AKT信號通路調(diào)控發(fā)揮作用。