張良，楊嘉麒，張?zhí)孛?，黃穎鵬，游濤，倪仲琳

溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 普外科，浙江 溫州 325027

胃癌是高發(fā)病率和高死亡率的惡性腫瘤疾病，嚴(yán)重危害人類健康。靶向治療可以顯著延長患者生存期，是晚期胃癌患者不可缺少的治療手段。但是，目前胃癌缺少有效的治療靶點(diǎn)，只有靶向HER2藥物成功應(yīng)用于胃癌的一線治療[1]。其他如表皮生長因子（epidermal growth factor receptor, EGFR）、 間質(zhì)表皮轉(zhuǎn)化因子（mesenchymal-epithelial transition factor, MET）、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin, mTOR）、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）等治療靶點(diǎn)在胃癌的應(yīng)用正處于臨床試驗(yàn)或大部分沒有達(dá)到預(yù)期結(jié)果[2]。尋找更高效的治療靶點(diǎn)是提高胃癌患者生存的關(guān)鍵[3]。Polo樣激酶（polo-like kinase, PLK）家族是一類絲蘇氨酸蛋白激酶，被認(rèn)為與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)有關(guān)。其中，PLK4結(jié)構(gòu)特殊，被發(fā)現(xiàn)與細(xì)胞中心粒復(fù)制有關(guān)，在眾多腫瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)，且與預(yù)后有一定相關(guān)性[4]。 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)PLK4的高表達(dá)可以促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和遷移等惡性表型[5-6]，另外，PLK4靶向治療已經(jīng)被美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)應(yīng)用于難治性或復(fù)發(fā)的急性骨髓性白血病。但是，PLK4在胃癌方面的研究甚少。有研究基于TCGA胃癌數(shù)據(jù)庫中mRNA的差異表達(dá)計(jì)算干細(xì)胞指數(shù)，提出PLK4與胃癌的細(xì)胞干性相關(guān)，高的細(xì)胞干性指數(shù)預(yù)后更好[7-9]。通過免疫組化檢測PLK4蛋白質(zhì)表達(dá)同樣提示胃癌中PLK4相對高表達(dá)，但高表達(dá)的預(yù)后更差[10]。這些報(bào)道僅僅停留在相關(guān)性分析上，缺乏PLK4抑制劑對胃癌細(xì)胞功能學(xué)上的深入研究。PLK4到底可否作為胃癌的治療靶點(diǎn)及其對胃癌細(xì)胞功能的影響和機(jī)制尚不明確，因此，本研究旨在探討PLK4抑制劑Centrinone（LCR-263）在體外對胃癌細(xì)胞的生長、遷移及凋亡的影響，評估其作為胃癌靶向治療藥物的潛在價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 主要試劑 PLK4 抑制劑Centrinone購于美國MedChemexpress生物科技公司，半胱天冬酶-3 （Caspase-3）、半胱天冬酶-3 裂解體（Cleaved-Caspase-3）、聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶（poly ADPribose polymerase, PARP）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）等抗體購于美國Proteintech Group生物技術(shù)公司，PI3K及其磷酸化抗體購于美國Abcam公司，AKT及其磷酸化抗體購于澳大利亞Affinity Biosciences公司，AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡雙染試劑盒購于美國BD公司，細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清等購于美國Gibico公司，所用細(xì)胞培養(yǎng)皿等耗材購于美國Corning生物科技有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 胃癌細(xì)胞株AGS、BGC、SGC購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。培養(yǎng)條件為10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2濃度的培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞生長實(shí)驗(yàn) 待細(xì)胞長滿至80%～90%時，棄掉培養(yǎng)基，用PBS清洗2 遍后，用胰酶消化胃癌細(xì)胞，消化后鋪板，96孔板，每孔5 000個細(xì)胞，分別加入PLK4抑制劑Centrinone（0、0.1、1、2、5、10、20、50 μmol/L），藥物溶解在無血清的1640培養(yǎng)基孵育24 h，根據(jù)CCK8試劑盒說明書加入試劑，孵育3 h后，在450 nm波長處檢測吸光度，并計(jì)算細(xì)胞相對生長情況。

1.4 Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 待細(xì)胞長滿至80%～90%時，棄掉培養(yǎng)基，用PBS清洗2遍后，用胰酶消化胃癌細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)后按照每小室20萬個細(xì)胞接種，小室上加入100 μL含Centrinone（0、1、2、5 μmol/L）的無血清培養(yǎng)基，小室下加入20% FBS的1640培養(yǎng)基600 μL，Transwell系統(tǒng)放入37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h和12 h后取出，計(jì)數(shù)方法如下，將Transwell小室取出，用PBS輕柔清洗，將小室放在室溫4%多聚甲醛內(nèi)固定30 min，之后再取出使用PBS洗兩遍，用棉花簽刮去小室內(nèi)的細(xì)胞，動作輕柔，避免小室的膜變形影響觀察。使用0.1%的結(jié)晶紫染料進(jìn)行染色，結(jié)晶紫覆蓋下層細(xì)胞，染色20 min。再用PBS清洗，室溫晾干以后在顯微鏡下觀察并拍照，每個小室取5個視野進(jìn)行拍攝，利用ImageJ軟件進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，最后做統(tǒng)計(jì)分析。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測 細(xì)胞消化后鋪到6 孔板內(nèi)，每孔20 萬細(xì)胞量，細(xì)胞在培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞貼壁后更換無血清培養(yǎng)基，并分別加入Centrinone（0、1、2、5 μmol/L），孵育24 h后收集細(xì)胞樣本，包括上清和貼壁的全部細(xì)胞，根據(jù)AnnexinV-FITC/PI試劑盒說明書進(jìn)行樣本處理后通過流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測。重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，將結(jié)果匯總進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.6 Western blot法檢測 細(xì)胞總蛋白使用RIPA裂解液提取，并使用BCA方法進(jìn)行濃度定量。使用SDS-PAGE法進(jìn)行蛋白電泳，先80 V電泳30 min，再轉(zhuǎn)120 V電泳1 h，轉(zhuǎn)膜使用PVDF膜，條件為恒流200 mA，90 min。然后使用5%脫脂牛奶的TBST進(jìn)行封閉2 h，之后進(jìn)行洗膜，然后進(jìn)行一抗在4 ℃冰箱孵育過夜。次日經(jīng)過TBST洗膜之后，進(jìn)行二抗孵育，室溫2 h。然后再次洗膜之后，使用ECL發(fā)光液進(jìn)行蛋白顯影。對蛋白條帶使用ImageJ進(jìn)行半定量分析。

1.7 生物信息學(xué)分析 PLK4 基因在TCGA數(shù)據(jù)庫中的表達(dá)量分析使用GEPIA工具（http://gepia. cancer-pku.cn/），通過GEPIA工具分析PLK4的mRNA在胃癌及癌旁組織中的差異表達(dá)。基因芯片的分析參考KMPLOT工具（http://kmplot.com/analysis），通過KMPLOT工具分析PLK4在胃癌組織中的蛋白表達(dá)量與患者生存預(yù)后的相關(guān)性。PLK4 蛋白質(zhì)在組織中的表達(dá)參考人類蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)庫（https://www.proteinatlas.org），觀察PLK4蛋白在胃癌組織中的分布及定位情況。選取的組化編號為PLK4數(shù)據(jù)集ID1042，抗體編號HPA043198。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PLK4在胃癌高表達(dá)且與預(yù)后存在相關(guān)性 在TCGA數(shù)據(jù)庫中對胃癌STAD數(shù)據(jù)集進(jìn)行分析，PLK4在胃癌組織中的RNA表達(dá)量顯著高于癌旁正常組織（P＜0.05），結(jié)合GEO的數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)PLK4的表達(dá)量與胃癌患者的生存預(yù)后存在顯著相關(guān)性（P=0.001），高表達(dá)量提示預(yù)后不良，見圖1A、圖1B。免疫組化結(jié)果表明，PLK4 蛋白主要定位于胃癌細(xì)胞質(zhì)以及細(xì)胞膜，少量細(xì)胞在細(xì)胞核內(nèi)也有染色，見圖1C。根據(jù)Human Protein Atlas數(shù)據(jù)庫的結(jié)果顯示，HPA043198檢測的組織標(biāo)本有10對，其中有3個胃癌樣本沒有檢測出PLK4表達(dá)，而其余7對為低中度表達(dá)，沒有胃癌組織檢測出強(qiáng)陽性。

圖1 PLK4在胃癌中的表達(dá)及預(yù)后分析

2.2 Centrinone對胃癌細(xì)胞具有顯著的生長抑制效應(yīng) 通過CCK8實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Centrinone對胃癌AGS、SGC和BGC均具有較強(qiáng)的生長抑制作用，當(dāng)藥物濃度達(dá)到4 μmol/L濃度時，三種細(xì)胞相對存活率都已經(jīng)在50%以下。其中，AGS對藥物的敏感性最高，IC50為1.386 μmol/L，見圖2。

2.3 PLK4抑制劑Centrinone抑制胃癌細(xì)胞的遷移 Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，同樣的條件下，藥物處理組AGS細(xì)胞穿過小室膜的細(xì)胞數(shù)量顯著少于未用藥物組，且隨著藥物濃度的增加（1、2、5 μmol/L），AGS細(xì)胞遷移數(shù)量逐漸減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖3。

圖3 PLK抑制劑Centrinone對胃癌細(xì)胞的遷移抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 PLK4 抑制劑Centrinone促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡 流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著藥物濃度的增加（1、2、5 μmol/L），細(xì)胞凋亡的比例逐漸增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖4。

圖4 PLK抑制劑Centrinone對胃癌細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5 凋亡相關(guān)蛋白PARP、Caspase-3及其裂解體的變化 Western blot檢測結(jié)果表明，當(dāng)藥物濃度為1、2、5 μmol/L時，與無藥物相比，隨著藥物濃度的增加，AGS細(xì)胞的PARP裂解體蛋白表達(dá)量逐漸顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。當(dāng)藥物濃度為1 μmol/L時，Caspase-3裂解體的蛋白表達(dá)量未增加（P＞0.05），而當(dāng)藥物濃度達(dá)到2 μmol/L、 5 μmol/L時，Caspase-3裂解體的蛋白表達(dá)量顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見圖5。

圖5 PLK抑制劑Centrinone對胃癌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白PARP、Caspase-3及其裂解體的影響

2.6 Centrinone不影響B(tài)AX蛋白表達(dá)但抑制BCL2蛋白表達(dá) 當(dāng)藥物濃度為1、2、5 μmol/L時，與無藥物相比，隨著藥物濃度的增加，AGS細(xì)胞的BCL2蛋白表達(dá)量逐漸顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），但BAX蛋白沒有顯著變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖6。

圖6 PLK抑制劑Centrinone對胃癌細(xì)胞BCL2及BAX蛋白的影響

2.7 Centrinone通過抑制PI3K/AKT通路調(diào)控胃癌細(xì)胞凋亡 當(dāng)藥物濃度為1、2、5 μmol/L時，與無藥物相比，隨著藥物濃度的增加，AGS細(xì)胞內(nèi)PI3K的磷酸化以及AKT的磷酸化被抑制得越明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖7。Centrinone可能是通過抑制PI3K/AKT信號通路調(diào)控胃癌細(xì)胞凋亡。

圖7 PLK抑制劑Centrinone對胃癌細(xì)胞PI3K/AKT信號通路的影響

3 討論

靶向治療為晚期胃癌患者的生存改善提供可能，但缺乏有效的治療靶點(diǎn)是胃癌靶向治療失敗的主要原因之一[3，11-12]。PLK蛋白激酶家族與細(xì)胞的分裂活動有關(guān)，在腫瘤組織中異常高表達(dá)，這也使其成為癌癥靶向治療的潛在靶點(diǎn)[13]。PLK4的靶向抑制劑表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗腫瘤活性[14-15]。PLK4的抑制可以出現(xiàn)細(xì)胞周期的阻斷以及細(xì)胞凋亡[16]，出現(xiàn)特征性的PARP裂解以及Caspase 3蛋白裂解[17]。本研究通過TCGA數(shù)據(jù)庫分析及不同濃度的PLK4抑制劑處理不同胃癌細(xì)胞系闡述Centrinone在胃癌的潛在治療價(jià)值。通過CCK8實(shí)驗(yàn)說明Centrinone顯著抑制胃癌細(xì)胞增殖，Transwell實(shí)驗(yàn)說明藥物抑制胃癌細(xì)胞遷移，流式凋亡細(xì)胞檢測結(jié)果說明藥物對胃癌的促凋亡作用。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞精密調(diào)控的程序性死亡，包括了外源性和內(nèi)源性的凋亡通路[18]。許多抗癌藥物通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗癌效應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)PLK4抑制劑Centrinone也是通過抑制胃癌細(xì)胞生長，顯著誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤活性。

本研究還通過Western blot方法檢測PLK4抑制劑Centrinone通過調(diào)控BCL-2以及PI3K/AKT信號通路蛋白發(fā)揮抗腫瘤作用。BCL-2蛋白家族是凋亡調(diào)控的重要成員，其中BCL-2蛋白具有抗凋亡的活性，而BAX蛋白具有促凋亡的活性，兩者共同調(diào)控線粒體應(yīng)激及相關(guān)下游通路的激活[19]。BCL-2蛋白的降解被認(rèn)為是PLK抑制劑（靶向PLK1/2/3）誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制之一[20]，但關(guān)于PLK4的靶向抑制劑對BCL-2蛋白的影響尚未見報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)Centrinone作用后，BCL-2蛋白的表達(dá)量顯著下降，但是BAX蛋白表達(dá)不顯著，說明Centrinone可能通過抑制BCL-2的表達(dá)誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡。

PI3K/AKT信號通路是重要的致癌通路，廣泛參與了細(xì)胞的遷移、增殖和耐藥性[21]。PI3K/AKT信號通路的激活增加了腫瘤的惡性表型[22]，而抑制則減弱腫瘤細(xì)胞增殖，引發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡。胃癌的發(fā)生是一個多因素多步驟的過程，包括環(huán)境因素、生活方式以及遺傳因素等，這其中PI3K/AKT信號通路可以調(diào)節(jié)胃癌的增殖與存活，是非常重要的信號通路之一[23]。有一篇文獻(xiàn)報(bào)道從1 693個小分子化合物中篩選出能促進(jìn)人類多能干細(xì)胞衍生的心肌細(xì)胞成熟的藥物，發(fā)現(xiàn)有多種PLK抑制劑能夠抑制AKT信號通路的激活[24]。也有研究發(fā)現(xiàn)PLK4抑制劑能抑制PI3K/AKT信號通路引發(fā)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞及前列腺癌細(xì)胞凋亡[25-26]，發(fā)揮抗腫瘤作用。但是，PLK4在胃癌中的效應(yīng)及調(diào)控機(jī)制未見報(bào)道。本研究結(jié)果提示PLK4抑制劑可能也是通過調(diào)控PI3K/AKT信號通路來抑制胃癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡。然而PI3K/AKT信號通路的下游分子是非常廣泛的，包括了鼠雙微體2（murine double minute 2, MDM2），叉頭框蛋白O1（forkhead box O1, FoxO1），叉頭框蛋白O3a（forkhead box O3a, FoxO3a），核因子κB（nuclear factor kappa-B, NF-κB），糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β, GSK-3β），以及哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin, mTOR）[23]。下游蛋白的確認(rèn)有助于更深入了解PLK4抑制劑在治療胃癌過中發(fā)揮的作用，還需要更多研究去確認(rèn)。

綜上所述，PLK4激酶抑制劑Centrinone可以顯著抑制胃癌細(xì)胞增殖、遷移，并誘導(dǎo)凋亡，可能通過抑制BCL-2表達(dá)及對PI3K/AKT信號通路調(diào)控發(fā)揮作用。