李 珍 王 蕊 陸小凡 粟 斌 張 欣 張 彤 吳 昊 黃曉婕

（首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院，感染性疾病臨床研究中心，艾滋病研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100069）

雙陰性（double-negative，DN）T 細(xì)胞是一種獨(dú)特的T 細(xì)胞亞群，僅占外周血總T 細(xì)胞的1%～3%，其表面表達(dá)TCRαβ 或TCRγδ，但不表達(dá)CD4 和CD8［1］。越來(lái)越多的研究認(rèn)為，DN T 細(xì)胞在調(diào)節(jié)固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。

研究發(fā)現(xiàn)，猴免疫缺陷病毒（simian immunodeficiency virus，SIV）感染、CD4+T 細(xì)胞減少的白眉猴中，DN T 細(xì)胞可補(bǔ)償輔助T 細(xì)胞的功能，維持正常的免疫功能［2-3］。而在HIV急性感染者中，DN T細(xì)胞的比例與疾病進(jìn)展相關(guān)，并可預(yù)測(cè)免疫活化的調(diào)定點(diǎn)［4-5］。早期ART 有效抑制HIV 復(fù)制，降低T 細(xì)胞免疫活化，促進(jìn)CD4+T細(xì)胞數(shù)量恢復(fù)。然而，早期ART后HIV 感染者DN T 細(xì)胞數(shù)量和表型的變化尚不清楚。DN T 細(xì)胞是多克隆的細(xì)胞群，70%以上為γδ T細(xì)胞［6-7］。外周血γδ T細(xì)胞主要分為Vδ1和Vδ2 T細(xì)胞兩個(gè)亞群，參與抗HIV 感染免疫應(yīng)答及疾病進(jìn)展［8-9］。因此，本研究將DN T 細(xì)胞分為Vδ1、Vδ2 和Vδ1/2negT 細(xì)胞三個(gè)亞群，闡明早期ART 后HIV 感染者DN T細(xì)胞各亞群數(shù)量和表型的變化。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 研究對(duì)象 入組HIV 急性期感染者39 例，來(lái)源于北京佑安醫(yī)院HIV 急性期感染者臨床研究隊(duì)列［8］。入組標(biāo)準(zhǔn)：①男男性行為接觸者人群（MSM）；②HIV 急性期感染：HIV-1 抗體陰性或抗體不確定，HIV RNA 陽(yáng)性［10］；③接受早期ART，并完成96 周隨訪。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并乙肝、丙肝或結(jié)核感染者和合并機(jī)會(huì)性感染者。年齡和性別相匹配的HIV陰性者為健康對(duì)照組（n=21）。所有參與者均簽署知情同意書(shū)，本研究已通過(guò)首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院倫理委員會(huì)的審批（批準(zhǔn)編號(hào)：2020-147；2021-371）。

1.1.2 流式抗體 PE 標(biāo)記的抗人Vδ2TCR mAb（IMMU389，Beckman Coulter 公司，美國(guó)）；FITC 標(biāo)記的抗人Vδ1TCR mAb（TS8.2，Pierce 公司，美國(guó)）；APC 標(biāo)記的抗人HLA-DR mAb（L243）、Percp-cy5.5標(biāo)記的抗人CD38 mAb（HIT2）、PE-cy7 標(biāo)記的抗人CD3 mAb（UCHT1）、APC-cy7 標(biāo)記的抗人CD8 mAb（SK1）、BV421 標(biāo)記的抗人CD4 mAb（RPA-T4）和對(duì)應(yīng)的同型抗體（Biolegend公司，美國(guó)）。

1.1.3 其他材料 RPMI1640 培養(yǎng)基（Hyclone 公司，美國(guó)）；牛血清白蛋白（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所，中國(guó)）；1×PBS（pH=7.2～7.4）（Gibco公司，美國(guó)）；FACS Calibur TruCount計(jì)數(shù)管和Canto Ⅱ流式細(xì)胞儀（BD公司，美國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 T 淋巴細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù) 采用FACS Calibur TruCount 計(jì)數(shù)管和多色標(biāo)記抗體（CD3/CD4/CD8/CD45）標(biāo)記細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD3+、CD4+和CD8+T細(xì)胞的百分比和絕對(duì)數(shù)。

1.2.2 病毒載量檢測(cè) 血漿病毒載量采用雅培Real-time HIV-1 M2000 系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，最低檢測(cè)限為40拷貝/ml。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù) 取分離的PBMCs，流式洗液（PBS+1%BSA）洗滌后，1 500 r/min 離心5 min；熒光抗體標(biāo)記細(xì)胞，同時(shí)設(shè)定單陽(yáng)對(duì)照和同型對(duì)照管，室溫避光孵育20 min。洗滌細(xì)胞后，加入300 μl 2%多聚甲醛固定液。流式細(xì)胞儀采集數(shù)據(jù)，F(xiàn)lowJo（V10.8）分析數(shù)據(jù)（圖1）。

圖1 流式細(xì)胞數(shù)據(jù)分析流程圖Fig.1 Flow chart diagram of flow cytometry data analysis

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS21.0 和GraphPad Prism 9.3 統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)和作圖。數(shù)據(jù)以表示。計(jì)量資料比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，兩組間各參數(shù)的比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，ART 治療前后各參數(shù)的比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，Spearman 秩和相關(guān)法分析變量之間的相關(guān)性，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料分析 HIV 急性期感染者平均感染時(shí)間為（58.40±18.50）d，年齡與健康對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。ART 96 周后，CD4+T 細(xì)胞數(shù)量較基線顯著增加（P<0.000 1，表1）。

表1 健康對(duì)照組和HIV急性期感染者的基礎(chǔ)資料（）Tab.1 Basic characteristics of HCs and AHIs（）

表1 健康對(duì)照組和HIV急性期感染者的基礎(chǔ)資料（）Tab.1 Basic characteristics of HCs and AHIs（）

Note：Comparison of CD4+T cell counts at baseline and 96 weeks after ART，1）P<0.000 1.NA.Not applied；HCs.Healthy controls；AHIs.Acute HIV-infected individuals.

2.2 DN T細(xì)胞數(shù)量的比較 HIV急性感染者DN T細(xì)胞的比例顯著低于健康對(duì)照組。ART 96 周后HIV 感染者DN T 細(xì)胞的比例較基線時(shí)增加，但仍低于健康對(duì)照組（圖2A）。此外，HIV 感染者DN T 細(xì)胞的比例與基線CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)和病毒載量無(wú)相關(guān)性，而與ART 96 周后CD4+T 細(xì)胞的數(shù)量呈顯著正相關(guān)（圖2B～D）。

圖2 健康對(duì)照組、HIV 急性期感染者0 周和ART 96 周后DN T細(xì)胞數(shù)量的比較Fig.2 Comparisons of frequencies of DN T cells among HCs，AHIs at 0 week and 96 weeks after ART

2.3 早期ART 對(duì)HIV 感染者DN T 細(xì)胞亞群比例的影響 與健康對(duì)照組相比較，HIV 急性期感染者0 周和ART 96 周后，Vδ1 T 細(xì)胞的比例均顯著升高，Vδ2 T 細(xì)胞的比例顯著降低，而三組間Vδ1/2negT 細(xì)胞的比例差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05，圖3A～C）。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，ART 96周后感染者CD4+T細(xì)胞的數(shù)量與Vδ1 T細(xì)胞和Vδ2 T細(xì)胞的比例無(wú)相關(guān)性，而與Vδ1/2negT細(xì)胞的比例呈負(fù)相關(guān)趨勢(shì)（圖3D～E）。

圖3 早期ART對(duì)HIV感染者DN T細(xì)胞亞群比例的影響Fig.3 Effects of early ART on frequencies of DN T cell subsets in AHIs

2.4 DN T 細(xì)胞亞群活化水平的比較 HIV 急性期感染者Vδ1、Vδ2 和Vδ1/2negT 細(xì)胞的活化水平均顯著高于健康對(duì)照組。早期ART 96周后Vδ1和Vδ2 T細(xì)胞的活化水平降低，與健康對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。然而，ART 96 周后Vδ1/2negT細(xì)胞的活化水平仍顯著高于健康對(duì)照組（圖4）。

圖4 健康對(duì)照組、HIV 急性期感染者0 周和ART 96 周后DN T細(xì)胞亞群活化水平的比較Fig.4 Comparison of activation of DN T cell subsets among HCs，AHIs at 0 week and 96 weeks after ART

2.5 HIV 感染者DN T 細(xì)胞亞群活化與病毒載量和CD4+T 細(xì)胞計(jì)數(shù)的相關(guān)性 如圖5 所示，Vδ2 T 細(xì)胞的活化與病毒載量呈正相關(guān)，Vδ1 和Vδ1/2negT 細(xì)胞的活化與病毒載量無(wú)相關(guān)性（圖5A～C）?；€（0周）時(shí)，Vδ1和Vδ2 T細(xì)胞的活化與CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)，而Vδ1/2negT 細(xì)胞的活化與CD4+T 細(xì)胞計(jì)數(shù)無(wú)相關(guān)性（圖5D～F）。ART 96 周后，Vδ1/2negT 細(xì)胞的活化與CD4+T 細(xì)胞計(jì)數(shù)呈負(fù)相關(guān)趨勢(shì)，而Vδ1 和Vδ2 T 細(xì)胞的活化CD4+T 細(xì)胞計(jì)數(shù)無(wú)相關(guān)性（圖5G～I(xiàn)）。

圖5 DN T 細(xì)胞亞群活化與病毒載量和CD4+T 細(xì)胞數(shù)量的相關(guān)性Fig.5 Correlations between activation of DN T cell subsets and plasma viral load or CD4+T cell counts

3 討論

DN T細(xì)胞兼有輔助T細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的功能，在炎癥、免疫性疾病和癌癥中起重要作用［7］。而DN T 細(xì)胞在HIV 急性期感染中的研究相對(duì)較少。本研究發(fā)現(xiàn)HIV 急性感染者DN T 細(xì)胞的比例顯著降低，盡管早期ART 使DN T 細(xì)胞的數(shù)量增加，但仍低于健康對(duì)照組。ART 后，DN T 細(xì)胞的比例與CD4+T 細(xì)胞計(jì)數(shù)呈正相關(guān)。該結(jié)果表明，即使在HIV 感染急性期開(kāi)始啟動(dòng)ART，DN T 細(xì)胞的數(shù)量仍不能完全恢復(fù)，進(jìn)而影響CD4+T細(xì)胞的恢復(fù)，引起免疫重建不良。免疫重建不良者DN T 細(xì)胞的比例低于免疫重建良好者［11］。

DN T細(xì)胞是一種多克隆細(xì)胞群，但目前尚無(wú)特定的表型來(lái)進(jìn)行亞群分類［6-7］。由于DN T 細(xì)胞大部分是γδ T 細(xì)胞，本研究將DN T 細(xì)胞分為Vδ1、Vδ2和Vδ1/2negT 細(xì)胞三個(gè)細(xì)胞亞群，發(fā)現(xiàn)HIV 急性期感染者Vδ1 T細(xì)胞的比例顯著增加，Vδ2 T細(xì)胞的比例顯著降低。早期ART 不能降低Vδ1 T 細(xì)胞的比例，也不能使Vδ2 T 細(xì)胞的比例完全恢復(fù)。Vδ1 T 細(xì)胞是IL-17分泌的主要來(lái)源，HIV 感染者疾病快速進(jìn)展IL-17+γδ T 細(xì)胞比例的增加，與免疫活化顯著相關(guān)［9，12］。因此，Vδ1 T 細(xì)胞數(shù)量的增加可能與免疫活化及炎癥的持續(xù)存在有關(guān)。此外，HIV 感染者Vδ1/2negT 細(xì)胞的比例與健康對(duì)照組無(wú)顯著差異，并與ART 96 周后CD4+T 細(xì)胞的數(shù)量呈負(fù)相關(guān)趨勢(shì)，提示Vδ1/2negT細(xì)胞可能抑制CD4+T細(xì)胞的增殖。

免疫活化是HIV 感染的主要特征，也是影響ART 后HIV 感染者免疫重建的主要因素之一［13］。與既往研究結(jié)果一致［9，14］，本研究發(fā)現(xiàn)HIV 急性期感染者Vδ1 和Vδ2 T 細(xì)胞的活化水平顯著升高，與疾病進(jìn)展密切相關(guān)。早期ART使Vδ1和Vδ2 T細(xì)胞的活化水平正?；獳RT后Vδ1/2negT細(xì)胞的活化水平仍高于健康對(duì)照組，與CD4+T 細(xì)胞計(jì)數(shù)呈負(fù)相關(guān)趨勢(shì)。該結(jié)果提示，ART 后Vδ1/2negT 細(xì)胞持續(xù)活化可能與CD4+T 細(xì)胞恢復(fù)不良有關(guān)。有研究報(bào)道，免疫重建不良者TGF-β+DN T 細(xì)胞的比例低于免疫重建良好者［11］。TGF-β 是一種抗炎因子，ART 后HIV 感染者TGF-β 分泌持續(xù)減少，而促炎因子IFN-γ、TNF-α 等分泌增加，使Vδ1/2negT 細(xì)胞持續(xù)活化［15-16］。

此外，ART 后Vδ1/2negT 細(xì)胞持續(xù)高水平活化，可能與低水平HIV復(fù)制有關(guān)。TCRα/β+DN T細(xì)胞和γδ T 細(xì)胞中可檢測(cè)到HIV DNA，靜止的CD4-T 細(xì)胞中存在少量HIV gag 蛋白表達(dá)［17-19］。而CHENEY等［20］認(rèn)為，DN T 細(xì)胞中HIV DNA 的存在，是ART 后病毒學(xué)抑制失敗引起的，并不是真正有效的病毒庫(kù)。本研究尚未檢測(cè)HIV 感染者DN T 細(xì)胞亞群中HIV-DNA 的含量及其功能，需在今后的研究中完善。