李 珍 王 蕊 陸小凡 粟 斌 張 欣 張 彤 吳 昊 黃曉婕

（首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院，感染性疾病臨床研究中心，艾滋病研究北京市重點實驗室，北京 100069）

雙陰性（double-negative，DN）T 細胞是一種獨特的T 細胞亞群，僅占外周血總T 細胞的1%～3%，其表面表達TCRαβ 或TCRγδ，但不表達CD4 和CD8［1］。越來越多的研究認為，DN T 細胞在調(diào)節(jié)固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。

研究發(fā)現(xiàn)，猴免疫缺陷病毒（simian immunodeficiency virus，SIV）感染、CD4+T 細胞減少的白眉猴中，DN T 細胞可補償輔助T 細胞的功能，維持正常的免疫功能［2-3］。而在HIV急性感染者中，DN T細胞的比例與疾病進展相關(guān)，并可預(yù)測免疫活化的調(diào)定點［4-5］。早期ART 有效抑制HIV 復(fù)制，降低T 細胞免疫活化，促進CD4+T細胞數(shù)量恢復(fù)。然而，早期ART后HIV 感染者DN T 細胞數(shù)量和表型的變化尚不清楚。DN T 細胞是多克隆的細胞群，70%以上為γδ T細胞［6-7］。外周血γδ T細胞主要分為Vδ1和Vδ2 T細胞兩個亞群，參與抗HIV 感染免疫應(yīng)答及疾病進展［8-9］。因此，本研究將DN T 細胞分為Vδ1、Vδ2 和Vδ1/2negT 細胞三個亞群，闡明早期ART 后HIV 感染者DN T細胞各亞群數(shù)量和表型的變化。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 研究對象 入組HIV 急性期感染者39 例，來源于北京佑安醫(yī)院HIV 急性期感染者臨床研究隊列［8］。入組標(biāo)準(zhǔn)：①男男性行為接觸者人群（MSM）；②HIV 急性期感染：HIV-1 抗體陰性或抗體不確定，HIV RNA 陽性［10］；③接受早期ART，并完成96 周隨訪。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并乙肝、丙肝或結(jié)核感染者和合并機會性感染者。年齡和性別相匹配的HIV陰性者為健康對照組（n=21）。所有參與者均簽署知情同意書，本研究已通過首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院倫理委員會的審批（批準(zhǔn)編號：2020-147；2021-371）。

1.1.2 流式抗體 PE 標(biāo)記的抗人Vδ2TCR mAb（IMMU389，Beckman Coulter 公司，美國）；FITC 標(biāo)記的抗人Vδ1TCR mAb（TS8.2，Pierce 公司，美國）；APC 標(biāo)記的抗人HLA-DR mAb（L243）、Percp-cy5.5標(biāo)記的抗人CD38 mAb（HIT2）、PE-cy7 標(biāo)記的抗人CD3 mAb（UCHT1）、APC-cy7 標(biāo)記的抗人CD8 mAb（SK1）、BV421 標(biāo)記的抗人CD4 mAb（RPA-T4）和對應(yīng)的同型抗體（Biolegend公司，美國）。

1.1.3 其他材料 RPMI1640 培養(yǎng)基（Hyclone 公司，美國）；牛血清白蛋白（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所，中國）；1×PBS（pH=7.2～7.4）（Gibco公司，美國）；FACS Calibur TruCount計數(shù)管和Canto Ⅱ流式細胞儀（BD公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 T 淋巴細胞絕對計數(shù) 采用FACS Calibur TruCount 計數(shù)管和多色標(biāo)記抗體（CD3/CD4/CD8/CD45）標(biāo)記細胞，流式細胞儀檢測CD3+、CD4+和CD8+T細胞的百分比和絕對數(shù)。

1.2.2 病毒載量檢測 血漿病毒載量采用雅培Real-time HIV-1 M2000 系統(tǒng)進行檢測，最低檢測限為40拷貝/ml。

1.2.3 流式細胞術(shù) 取分離的PBMCs，流式洗液（PBS+1%BSA）洗滌后，1 500 r/min 離心5 min；熒光抗體標(biāo)記細胞，同時設(shè)定單陽對照和同型對照管，室溫避光孵育20 min。洗滌細胞后，加入300 μl 2%多聚甲醛固定液。流式細胞儀采集數(shù)據(jù)，F(xiàn)lowJo（V10.8）分析數(shù)據(jù)（圖1）。

圖1 流式細胞數(shù)據(jù)分析流程圖Fig.1 Flow chart diagram of flow cytometry data analysis

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS21.0 和GraphPad Prism 9.3 統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)和作圖。數(shù)據(jù)以表示。計量資料比較采用獨立樣本t檢驗，兩組間各參數(shù)的比較采用Mann-WhitneyU檢驗，ART 治療前后各參數(shù)的比較采用配對t檢驗，Spearman 秩和相關(guān)法分析變量之間的相關(guān)性，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料分析 HIV 急性期感染者平均感染時間為（58.40±18.50）d，年齡與健康對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。ART 96 周后，CD4+T 細胞數(shù)量較基線顯著增加（P<0.000 1，表1）。

表1 健康對照組和HIV急性期感染者的基礎(chǔ)資料（）Tab.1 Basic characteristics of HCs and AHIs（）

表1 健康對照組和HIV急性期感染者的基礎(chǔ)資料（）Tab.1 Basic characteristics of HCs and AHIs（）

Note：Comparison of CD4+T cell counts at baseline and 96 weeks after ART，1）P<0.000 1.NA.Not applied；HCs.Healthy controls；AHIs.Acute HIV-infected individuals.

2.2 DN T細胞數(shù)量的比較 HIV急性感染者DN T細胞的比例顯著低于健康對照組。ART 96 周后HIV 感染者DN T 細胞的比例較基線時增加，但仍低于健康對照組（圖2A）。此外，HIV 感染者DN T 細胞的比例與基線CD4+T細胞計數(shù)和病毒載量無相關(guān)性，而與ART 96 周后CD4+T 細胞的數(shù)量呈顯著正相關(guān)（圖2B～D）。

圖2 健康對照組、HIV 急性期感染者0 周和ART 96 周后DN T細胞數(shù)量的比較Fig.2 Comparisons of frequencies of DN T cells among HCs，AHIs at 0 week and 96 weeks after ART

2.3 早期ART 對HIV 感染者DN T 細胞亞群比例的影響 與健康對照組相比較，HIV 急性期感染者0 周和ART 96 周后，Vδ1 T 細胞的比例均顯著升高，Vδ2 T 細胞的比例顯著降低，而三組間Vδ1/2negT 細胞的比例差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05，圖3A～C）。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，ART 96周后感染者CD4+T細胞的數(shù)量與Vδ1 T細胞和Vδ2 T細胞的比例無相關(guān)性，而與Vδ1/2negT細胞的比例呈負相關(guān)趨勢（圖3D～E）。

圖3 早期ART對HIV感染者DN T細胞亞群比例的影響Fig.3 Effects of early ART on frequencies of DN T cell subsets in AHIs

2.4 DN T 細胞亞群活化水平的比較 HIV 急性期感染者Vδ1、Vδ2 和Vδ1/2negT 細胞的活化水平均顯著高于健康對照組。早期ART 96周后Vδ1和Vδ2 T細胞的活化水平降低，與健康對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。然而，ART 96 周后Vδ1/2negT細胞的活化水平仍顯著高于健康對照組（圖4）。

圖4 健康對照組、HIV 急性期感染者0 周和ART 96 周后DN T細胞亞群活化水平的比較Fig.4 Comparison of activation of DN T cell subsets among HCs，AHIs at 0 week and 96 weeks after ART

2.5 HIV 感染者DN T 細胞亞群活化與病毒載量和CD4+T 細胞計數(shù)的相關(guān)性 如圖5 所示，Vδ2 T 細胞的活化與病毒載量呈正相關(guān)，Vδ1 和Vδ1/2negT 細胞的活化與病毒載量無相關(guān)性（圖5A～C）?；€（0周）時，Vδ1和Vδ2 T細胞的活化與CD4+T細胞計數(shù)呈顯著負相關(guān)，而Vδ1/2negT 細胞的活化與CD4+T 細胞計數(shù)無相關(guān)性（圖5D～F）。ART 96 周后，Vδ1/2negT 細胞的活化與CD4+T 細胞計數(shù)呈負相關(guān)趨勢，而Vδ1 和Vδ2 T 細胞的活化CD4+T 細胞計數(shù)無相關(guān)性（圖5G～I）。

圖5 DN T 細胞亞群活化與病毒載量和CD4+T 細胞數(shù)量的相關(guān)性Fig.5 Correlations between activation of DN T cell subsets and plasma viral load or CD4+T cell counts

3 討論

DN T細胞兼有輔助T細胞和調(diào)節(jié)性T細胞的功能，在炎癥、免疫性疾病和癌癥中起重要作用［7］。而DN T 細胞在HIV 急性期感染中的研究相對較少。本研究發(fā)現(xiàn)HIV 急性感染者DN T 細胞的比例顯著降低，盡管早期ART 使DN T 細胞的數(shù)量增加，但仍低于健康對照組。ART 后，DN T 細胞的比例與CD4+T 細胞計數(shù)呈正相關(guān)。該結(jié)果表明，即使在HIV 感染急性期開始啟動ART，DN T 細胞的數(shù)量仍不能完全恢復(fù)，進而影響CD4+T細胞的恢復(fù)，引起免疫重建不良。免疫重建不良者DN T 細胞的比例低于免疫重建良好者［11］。

DN T細胞是一種多克隆細胞群，但目前尚無特定的表型來進行亞群分類［6-7］。由于DN T 細胞大部分是γδ T 細胞，本研究將DN T 細胞分為Vδ1、Vδ2和Vδ1/2negT 細胞三個細胞亞群，發(fā)現(xiàn)HIV 急性期感染者Vδ1 T細胞的比例顯著增加，Vδ2 T細胞的比例顯著降低。早期ART 不能降低Vδ1 T 細胞的比例，也不能使Vδ2 T 細胞的比例完全恢復(fù)。Vδ1 T 細胞是IL-17分泌的主要來源，HIV 感染者疾病快速進展IL-17+γδ T 細胞比例的增加，與免疫活化顯著相關(guān)［9，12］。因此，Vδ1 T 細胞數(shù)量的增加可能與免疫活化及炎癥的持續(xù)存在有關(guān)。此外，HIV 感染者Vδ1/2negT 細胞的比例與健康對照組無顯著差異，并與ART 96 周后CD4+T 細胞的數(shù)量呈負相關(guān)趨勢，提示Vδ1/2negT細胞可能抑制CD4+T細胞的增殖。

免疫活化是HIV 感染的主要特征，也是影響ART 后HIV 感染者免疫重建的主要因素之一［13］。與既往研究結(jié)果一致［9，14］，本研究發(fā)現(xiàn)HIV 急性期感染者Vδ1 和Vδ2 T 細胞的活化水平顯著升高，與疾病進展密切相關(guān)。早期ART使Vδ1和Vδ2 T細胞的活化水平正常化，但ART后Vδ1/2negT細胞的活化水平仍高于健康對照組，與CD4+T 細胞計數(shù)呈負相關(guān)趨勢。該結(jié)果提示，ART 后Vδ1/2negT 細胞持續(xù)活化可能與CD4+T 細胞恢復(fù)不良有關(guān)。有研究報道，免疫重建不良者TGF-β+DN T 細胞的比例低于免疫重建良好者［11］。TGF-β 是一種抗炎因子，ART 后HIV 感染者TGF-β 分泌持續(xù)減少，而促炎因子IFN-γ、TNF-α 等分泌增加，使Vδ1/2negT 細胞持續(xù)活化［15-16］。

此外，ART 后Vδ1/2negT 細胞持續(xù)高水平活化，可能與低水平HIV復(fù)制有關(guān)。TCRα/β+DN T細胞和γδ T 細胞中可檢測到HIV DNA，靜止的CD4-T 細胞中存在少量HIV gag 蛋白表達［17-19］。而CHENEY等［20］認為，DN T 細胞中HIV DNA 的存在，是ART 后病毒學(xué)抑制失敗引起的，并不是真正有效的病毒庫。本研究尚未檢測HIV 感染者DN T 細胞亞群中HIV-DNA 的含量及其功能，需在今后的研究中完善。