南海峰 何 明 李海霞 程明菲 黃國勝

（南陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，南陽 473000）

食管癌是世界范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤，目前我國居民生活方式的改變和醫(yī)療技術(shù)的改善已經(jīng)開始對食管癌的患病率和病死率產(chǎn)生積極的影響，但由于食管癌早期癥狀不明顯，一般發(fā)現(xiàn)時患者已經(jīng)處于中晚期，往往存在不受控制的瘤體增大以及向喉返神經(jīng)、氣管、支氣管甚至肝、腦等臟器轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量與預(yù)后［1-3］。目前食管癌患者的五年生存率仍處于較低水平，這意味著在食管癌的診治方面仍存在挑戰(zhàn)［4］。STAT3 是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子家族成員，該家族在機(jī)體內(nèi)調(diào)控多種生物學(xué)進(jìn)程的信號傳遞與基因表達(dá)中發(fā)揮重要作用，并且在腫瘤的發(fā)展過程中也扮演關(guān)鍵角色［5-6］。P13K/Akt 信號通路在腫瘤中常常呈現(xiàn)異常表達(dá)，且在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲以及抑制凋亡等過程中具有正向調(diào)節(jié)作用，目前國內(nèi)尚無關(guān)于STAT3-P13K-Akt軸在食管癌中作用的相關(guān)研究［7-8］。為進(jìn)一步研究STAT3 在食管癌細(xì)胞中的功能以及其具體機(jī)制，本研究計劃利用慢病毒介導(dǎo)的shRNA和過表達(dá)質(zhì)粒在食管癌細(xì)胞系EC106 中進(jìn)行一系列實驗，為食管癌的治療和靶向藥物的開發(fā)提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人食管癌EC106 細(xì)胞株購自中國吉妮歐生物公司；RPMI1640 培養(yǎng)基購自Procell 公司（美國，PM150110）；Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染試劑購自Thermo Fisher 公司（美國）；STAT3、p-P13K、p-AKT、β-actin 引物由吉凱公司（上海）設(shè)計合成；Ki67、PCNA、E-cadherin、Vimentin 及β-actin 抗體購自西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司（上海，P6834、05-347、07-697、V6389、A5316）；細(xì)胞周期檢測試劑盒購自雅吉生物科技有限公司（上海，S0186）；STAT3 shRNA 慢病毒載體、STAT3 過表達(dá)慢病毒載體購自科瑞斯生物科技股份有限公司（南京）；總RNA 提取試劑盒及Transwell 小室購自賽默飛公司（美國，15596026、78833）；Western blot 凝膠電泳儀購自六一儀器廠（北京，DYCZ-24DH）；顯影儀購自嘉鵬科技有限公司（上海，JP-K300）；實時熒光定量PCR 儀、Transwell小室購自Thermo Fisher Scientific（美國，4453543）；流式細(xì)胞儀購自BD 公司（美國，COO446）；高速離心機(jī)購自日立公司（日本，CP100WX）；細(xì)胞孵育箱購自川宏實驗儀器有限公司（上海，CHSQ-50-Ⅲ）；恒溫孵育床購自米歐有限公司（杭州，ES-60E）。本研究經(jīng)南陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科倫理委員會批準(zhǔn)（2023-xxgnk027）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將人食管癌EC106 細(xì)胞株置于適宜的生長溫度細(xì)胞培養(yǎng)箱，隨時監(jiān)測細(xì)胞狀態(tài)以確保其正常生長。當(dāng)其處于對數(shù)生長期時進(jìn)行STAT3 shRNA 慢病毒載體與STAT3 過表達(dá)慢病毒載體感染，分為對照組、沉默組及過表達(dá)組。

1.2.2 CCK-8 檢測細(xì)胞增殖活性 各組EC106 細(xì)胞以5×103個/孔在96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板上培養(yǎng)，同時用等量的無水乙醇溶劑作為溶劑空白組。在每個樣品的孔中加入10 μl CCK-8溶液，并進(jìn)行避光處理后進(jìn)行孵育。隨后，使用雙波長（450 nm 和630 nm）的酶標(biāo)儀測量孔中的光密度（OD）。

1.2.3 細(xì)胞周期分布 收集各組細(xì)胞，PBS清洗后離心，固定過夜，第2天離心棄上清后加入細(xì)胞周期檢測試劑盒試劑，避光孵育30 min，經(jīng)濾網(wǎng)過濾后轉(zhuǎn)移至流式管中，上機(jī)檢測。

1.2.4 細(xì)胞劃痕實驗 使用無菌吸頭沿著直尺在培養(yǎng)細(xì)胞中劃出一道直線，在劃痕處用PBS 緩沖液進(jìn)行兩次洗滌。隨后，加入不含血清的培養(yǎng)基，并選擇0 h 和48 h 兩個時間點，在顯微鏡下對固定點進(jìn)行拍照。

1.2.5 Transwell 實驗 按1∶8 稀釋后的Matrigel 基質(zhì)膠40 μl 加入Transwell 小室上室，在恒溫孵育床上在37 ℃下恒溫孵育4 h，在下室中加入500 μl含有10%FBS 的培養(yǎng)基，將各組細(xì)胞濃度調(diào)整至5×105個/ml 細(xì)胞。隨后，取200 μl 細(xì)胞懸液添加到上室中。取出Transwell 小室，將培養(yǎng)基倒掉并使用PBS 緩沖液洗滌2 次。接下來，在室溫下使用甲醇進(jìn)行固定，然后使用0.1%結(jié)晶紫進(jìn)行染色。最后，再次使用PBS 輕輕清洗小孔上方的細(xì)胞層，顯微鏡下對各組細(xì)胞觀察計數(shù)以計算其侵襲情況。

1.2.6 RT-PCR 檢測各項指標(biāo)mRNA 水平 收集各組細(xì)胞通過試劑盒提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，按照SYBR∶cDNA∶各引物∶DEPC處理水=10∶2∶0.2∶7.2 的比例配制反應(yīng)體系，加入反應(yīng)管中后低速離心，隨后上機(jī)按照每個循環(huán)95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min進(jìn)行40 次循環(huán)。循環(huán)完成后做溶解曲線。分析目的mRNA的相對表達(dá)量。各基因引物序列見表1。

表1 所選基因引物序列Tab.1 Sequences of selected gene primers

1.2.7 Western blot 檢測增殖相關(guān)基因與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)基因的蛋白水平 先采集各組細(xì)胞并加入蛋白酶抑制劑和蛋白質(zhì)裂解液以提取整體蛋白。接著對蛋白濃度進(jìn)行定量，將按比例將SDS 蛋白樣品緩沖液添加到樣品中徹底混合均勻。將樣品進(jìn)行上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、孵育一抗、孵育二抗等步驟，其中Ki67、PCNA、E-cadherin 及Vimentin 一抗?jié)舛葹?∶1 000，β-actin 濃度為1∶800。二抗孵育完成后洗膜，在顯影儀上進(jìn)行顯影操作。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)分析采用SPSS22.0軟件分析，組間差異的比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 STAT3 對食管癌EC106 細(xì)胞增殖的影響 與對照組相比，沉默組細(xì)胞在48 h 及72 h 增殖水平顯著降低（P<0.05），過表達(dá)組細(xì)胞在48 h 及72 h 增殖水平升高（P<0.05），見表2、圖1。與對照組相比較，沉默組細(xì)胞被阻滯在G0/G1期，而S 期細(xì)胞數(shù)量顯著減少（P<0.05）。另一方面，過表達(dá)組細(xì)胞在G0/G1期中的分布減少，而S期細(xì)胞數(shù)量增加，見圖2。

圖1 各組細(xì)胞增殖情況Fig.1 Cell proliferation in each group

圖2 各組細(xì)胞周期分布情況Fig.2 Cell cycle distribution in each group

表2 各組細(xì)胞增殖情況（）Tab.2 Cell proliferation in each group（）

表2 各組細(xì)胞增殖情況（）Tab.2 Cell proliferation in each group（）

Note：Compared with control group，1）P<0.05.

2.2 STAT3 對食管癌EC106 細(xì)胞遷移和侵襲的影響 對照組與過表達(dá)組細(xì)胞遷移數(shù)量顯著增加，細(xì)胞遷移面積增大（P<0.05），沉默組細(xì)胞遷移情況不明顯，見圖3。Transwell 實驗數(shù)據(jù)表明，與對照組相比，沉默組細(xì)胞侵襲能力顯著降低（P<0.05），過表達(dá)組細(xì)胞侵襲能力增強(qiáng)，見表3。

圖3 各組細(xì)胞遷移情況Fig.3 Cell migration in each group

表3 各組細(xì)胞侵襲數(shù)目（）Tab.3 Cell invasion numbers in each group（）

表3 各組細(xì)胞侵襲數(shù)目（）Tab.3 Cell invasion numbers in each group（）

Note：Compared with control group，1）P<0.05.

2.3 STAT3 對食管癌EC106 細(xì)胞PI3K/Akt 的影響 RT-PCR 結(jié)果顯示，與對照組相比，沉默組細(xì)胞中STAT3、P13K、Akt mRNA 表達(dá)顯著降低，過表達(dá)組STAT3、P13K、Akt mRNA 表達(dá)增加（P<0.05），見圖4。

圖4 各組細(xì)胞中STAT3、P13K、Akt的mRNA水平Fig.4 mRNA levels of STAT3，P13K and Akt in cells of each group

圖5 各組細(xì)胞中Ki67、PCNA、E-cadherin 及Vimentin 的蛋白水平Fig.5 Protein levels of Ki67，PCNA，E-cadherin and Vimentin in each group of cells

2.4 STAT3 對食管癌EC106 細(xì)胞運動能力相關(guān)蛋白的影響 與對照組相比，沉默組細(xì)胞中Ki67、PCNA及Vimentin蛋白相對表達(dá)顯著降低，E-cadherin表達(dá)顯著升高（P<0.05），過表達(dá)組Ki67、PCNA及Vimentin蛋白相對表達(dá)增加，E-cadherin 表達(dá)顯著降低（P<0.05）。

3 討論

STAT3在細(xì)胞周期進(jìn)程、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞遷移與侵襲等方面的功能提示STAT3 的異常表達(dá)可能對癌癥的發(fā)生發(fā)展起到關(guān)鍵作用［9-10］。細(xì)胞增殖是衡量細(xì)胞生物學(xué)活性的關(guān)鍵指標(biāo)之一，與細(xì)胞異常增殖和腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。多項體外實驗研究結(jié)果顯示，STAT3 在癌癥惡化過程中具有顯著的調(diào)控作用，其通過刺激腫瘤細(xì)胞增殖、減弱免疫應(yīng)答和促進(jìn)轉(zhuǎn)移擴(kuò)散等方式促進(jìn)癌癥進(jìn)展［11］。此外，值得注意的是，STAT3在多種實體瘤中高水平表達(dá)，且其與患者不良預(yù)后之間存在顯著相關(guān)性，這種關(guān)聯(lián)性可能歸因于其在促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、抵抗治療和誘導(dǎo)轉(zhuǎn)移等方面的重要作用。如STAT3 能夠通過產(chǎn)生化學(xué)耐藥性來幫助胃癌腫瘤，在另一項研究中，STAT3能夠通過介導(dǎo)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞募集從而促進(jìn)結(jié)直腸癌進(jìn)展［12-13］。在本研究中，高表達(dá)STAT3的EC106 細(xì)胞增殖活性異常升高，而沉默EC106 后細(xì)胞增殖活性抑制提示STAT3 在食管癌細(xì)胞中仍是關(guān)鍵的促癌基因。通過以往的研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤的形成與細(xì)胞周期密切相關(guān)［14］。為了探究STAT3 基因與細(xì)胞周期之間的關(guān)系，進(jìn)行了一系列細(xì)胞周期實驗。實驗結(jié)果顯示，當(dāng)靜默STAT3基因時，EC106細(xì)胞被阻滯在G0/G1期，從而抑制了有絲分裂過程。這個結(jié)果與細(xì)胞增殖的觀察結(jié)果一致，這一結(jié)果能夠解釋STAT3影響細(xì)胞增殖的能力。

食管癌晚期生存率較低的原因主要在于其向正常器官的遷移與侵襲，本研究通過劃痕實驗及Transwell 小室實驗發(fā)現(xiàn)STAT3 基因可以促進(jìn)細(xì)胞的遷移及侵襲能力［15］。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelialmesenchymal transition,EMT）是一種復(fù)雜的細(xì)胞生物學(xué)過程，涉及通過調(diào)節(jié)上皮型基因表達(dá)和啟動間充質(zhì)型基因表達(dá)程序來實現(xiàn)的。該過程可能引起細(xì)胞形態(tài)學(xué)的顯著變化，并導(dǎo)致生物學(xué)行為特性的重新塑造。這些變化與惡性腫瘤中的腫瘤遷移、侵襲、干細(xì)胞活性、化療耐藥和免疫耐受等緊密相關(guān)［16］。為進(jìn)一步探究STAT3 對食管癌EC106 細(xì)胞的作用，通過Western blot 觀察不同表達(dá)水平的STAT3 對EMT 間質(zhì)表型分子標(biāo)志物Vimentin 與細(xì)胞上皮表型分子標(biāo)志物E-cadheirn 的調(diào)控作用。研究表明，在腫瘤細(xì)胞的浸潤與侵襲過程中，Vimentin高表達(dá)則會讓細(xì)胞失去黏附加強(qiáng)細(xì)胞的運動能力，Vimentin 正向參與了上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程［17］。Ecadherin 是一種跨膜糖蛋白，主要在細(xì)胞間發(fā)揮黏附作用。研究表明，當(dāng)E-cadherin 的表達(dá)水平異常下調(diào)時，會觸發(fā)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程的啟動，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞向周圍組織和器官進(jìn)行侵襲和轉(zhuǎn)移。換言之，E-cadherin 低表達(dá)與腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［18］。Western blot 結(jié)果顯示，STAT3 可以促進(jìn)Vimentin，并下調(diào)E-cadheirn 表達(dá)，即促進(jìn)食管癌細(xì)胞的EMT過程。

研究表明，P13K/Akt 信號通路在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中扮演重要角色，并被確認(rèn)為STAT3 的下游通路。該信號通路的異常表達(dá)與腫瘤的惡性增殖和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［19］。當(dāng)P13K/Akt 信號通路被激活時，其中的關(guān)鍵分子P13K 和Akt 會被磷酸化［20］。P13K屬于脂質(zhì)激酶家族，能夠合成磷脂酰肌醇第二信使，與其下游的Akt發(fā)生相互作用。Akt的磷酸化作用可以抑制一些促細(xì)胞凋亡的蛋白質(zhì)，同時抑制腫瘤細(xì)胞中的Akt 會明顯減弱細(xì)胞的增殖能力［21］。Akt 調(diào)節(jié)對于細(xì)胞增殖的影響與其在細(xì)胞生長和分裂循環(huán)中干擾重要蛋白質(zhì)的作用密切相關(guān)。P13K/Akt 信號通路在腫瘤發(fā)生過程中異常激活，其信號通路阻斷劑是抗腫瘤藥物研究的熱門方向［22］。在本研究中，沉默STAT3 后P13K/Akt 通路的關(guān)鍵基因P13K 與Akt 磷酸化水平受到了顯著抑制，使P13K/Akt 信號通路信號傳導(dǎo)被阻斷，而過表達(dá)STAT3 后P13K 與Akt 磷酸化水平顯著增加，提示STAT3 能夠調(diào)控P13K/Akt信號通路表達(dá)。

綜上所述，STAT3 在食管癌EC106 細(xì)胞中作為一個促癌基因，一旦受到抑制，就能夠通過阻斷P13K/Akt信號通路抑制細(xì)胞周期進(jìn)程與EMT 進(jìn)程，從而發(fā)揮抑制增殖、侵襲及遷移的功能，可能成為食管癌治療的潛在靶點。