時(shí) 謹(jǐn) 代德柱 宋旭東 郭霞梅 封紫玉 陶國(guó)全

（南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院胃腸外科，淮安 223300）

胃癌是第五大常見(jiàn)癌癥之一，同時(shí)也是全球第二大癌癥相關(guān)死亡原因，流行性及危害性巨大［1-2］。胃作為一種囊狀器官，早期腫瘤不易導(dǎo)致管腔阻塞引起癥狀，因此大部分患者確診時(shí)已處于晚期［3］。目前胃癌主要治療方法包括手術(shù)、放化療和靶向治療等?；瘜W(xué)療法和靶向治療在改善晚期胃癌患者預(yù)后方面作用有限，急需新的治療手段［4-5］。探索胃癌患者預(yù)后相關(guān)生物標(biāo)志物對(duì)改善晚期胃癌患者預(yù)后至關(guān)重要［6］。

纖溶酶原激活物抑制劑1 型（plasminogen activator inhibitor type 1，SERPINE1）是絲氨酸蛋白酶的重要抑制劑，在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞黏附和細(xì)胞遷移中發(fā)揮重要作用［7-8］。已有研究表明SERPINE1在多種癌癥中異常表達(dá)，促進(jìn)癌癥發(fā)生發(fā)展［9-10］。但SERPINE1在胃癌中的作用鮮有報(bào)道。

本研究首先對(duì)SERPINE1 在多種類(lèi)型人類(lèi)癌癥中進(jìn)行了表達(dá)分析和生存分析，運(yùn)用多維分析評(píng)價(jià)目標(biāo)基因在胃癌中的表達(dá)及相關(guān)基因和功能網(wǎng)絡(luò)，探討其表達(dá)差異與腫瘤免疫的聯(lián)系，為發(fā)現(xiàn)可能存在的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供理論依據(jù)，在胃癌隊(duì)列中進(jìn)行了基因共表達(dá)分析、免疫細(xì)胞浸潤(rùn)和免疫檢查點(diǎn)相關(guān)性分析，探索了SERPINE1 的非編碼RNA 網(wǎng)絡(luò)（ncRNA 相關(guān)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，包括miRNA 及l(fā)ncRNA），最終確定了SERPINE1 表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)、免疫細(xì)胞生物標(biāo)志物或胃癌免疫檢查點(diǎn)的相關(guān)性，結(jié)果表明ncRNA 介導(dǎo)的SERPINE1 上調(diào)與STAD 患者不良預(yù)后及腫瘤免疫浸潤(rùn)相關(guān)。

1 資料與方法

1.1 SERPINE1 表達(dá)譜數(shù)據(jù)提取 分析來(lái)自癌癥基因組圖譜（TCGA）的正常組織數(shù)據(jù)與泛癌（BLCA、BRCA、CHOL、COAD、ESCA、GBM、HNSC、KICH、KIRC、KIRP、LIHC、LUAD、LUSC、PRAD、READ、STAD、THCA 和UCEC）數(shù)據(jù)，研究各類(lèi)型癌癥和正常組織間的SERPINE1 表達(dá)失調(diào)。在UCSC Xena 網(wǎng)站（https：//xena.ucsc.edu/）下載STAD（胃癌）的癌癥相關(guān)RNA 序列、臨床病理特征及生存數(shù)據(jù)。比較來(lái)自GTEx 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//commonfund.nih.gov/GTEx/）的正常組織樣本以及來(lái)自TCGA 的腫瘤樣本中SERPINE1的差異表達(dá)［11］。

1.2 GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)分析SERPINE1 在胃癌中的表達(dá) GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)中，以SERPINE1 為目標(biāo)基因，癌癥類(lèi)型選擇STAD（胃癌），匹配TCGA 正常組織表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化分析［12］。

1.3 Kaplan Meier-Plotter生存分析 采用R 軟件包分析胃癌患者SERPINE1 高/低表達(dá)組與生存預(yù)后的相關(guān)性，使用Kaplan-Meier 曲線對(duì)胃癌中的 SERPINE1 表達(dá)與患者總生存期（OS）、疾病特異性生存期（DSS）、無(wú)病期（DFS）和無(wú)進(jìn)展期（PFS）的相關(guān)性進(jìn)行繪圖分析，并使用單變量生存分析計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)比（HR）及95%置信區(qū)間。

1.4 免疫浸潤(rùn)分析 TIMER 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//cistrome.shinyapps.io/timer/）用于分析STAD（胃癌）中SERPINE1 表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)和免疫檢查點(diǎn)的相關(guān)性。此外，使用R 語(yǔ)言基于TCGA 的ggplot2 包評(píng)估SERPINE1表達(dá)與胃癌免疫檢查點(diǎn)的相關(guān)性。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。使用ssGSEA 方法分析24 種免疫細(xì)胞在腫瘤中的浸潤(rùn)情況。采用Spearman 相關(guān)法分析SERPINE1 與上述24 種免疫細(xì)胞的相關(guān)程度及SERPINE1 高/低表達(dá)組免疫細(xì)胞浸潤(rùn)情況［13］。

1.5 胃癌中SERPINE1 共表達(dá)分析和通路富集分析 使用R 語(yǔ)言的ClusterProfiler 包分析SERPINE1的GO 功能和KEGG 通路富集。使用ggplot2 軟件包可視化分析數(shù)據(jù)。

1.6 SERPINE1 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 STRINGS（www.string-db.org）是一個(gè)在線分析網(wǎng)站，包含所有公開(kāi)可用的蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）數(shù)據(jù)［14］。使用STRING 對(duì)SERPINE1進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析。

1.7 miRNA 預(yù)測(cè)利用starBase2.0（www.starbase.sysu.edu.cn）在線網(wǎng)站預(yù)測(cè)SERPINE1 的目標(biāo)miRNA，通過(guò)PITA、miRanda 和TargetScan 對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析［15］。進(jìn)一步分析靶miRNA 表達(dá)與SERPINE1表達(dá)的相關(guān)性，篩選出更符合ceRNA條件的miRNA。使用TargetScan（http：//www.targetscan.org/vert）在線工具預(yù)測(cè)目標(biāo)miRNA 和SERPINE1 的潛在結(jié)合位點(diǎn)。

1.8 lncRNA 和ceRNA 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建預(yù)測(cè) 通過(guò)上述方法篩選出has-miR-19a-3p、has-miR-148a-3p和hasmiR-19b-3p，使用miRNet1.0（www.mirnet.ca/miRNet/home.xhtml）、miRNet2.0（www.mirnet.ca/miRNet/home.xhtml）和starBase 對(duì)上述3 種miRNA 進(jìn)行靶l(wèi)ncRNA 預(yù)測(cè)［16］。進(jìn)一步分析靶miRNA 表達(dá)與lncRNA 表達(dá)的相關(guān)性，篩選出更符合ceRNA 條件的lncRNA。綜合分析“miRNA-mRNA”和“miRNAlncRNA”，建立胃癌關(guān)鍵“l(fā)ncRNA-miRNA-mRNA”的ceRNA網(wǎng)絡(luò)。

1.9 蛋白印跡實(shí)驗(yàn) 取2021 年6 月至2022 年9 月南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院（倫理批號(hào)：KY-2022-090-01）的胃癌組織和癌旁標(biāo)本各3份，細(xì)胞裂解緩沖液裂解組織，提取總蛋白，10%SDS-PAGE 凝膠分離30 μg總蛋白，轉(zhuǎn)至PVDF 膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，按照一抗說(shuō)明書(shū)將PVDF 膜分別置入抗SERPINE1抗體（Abcam 公司產(chǎn)品，ab222754，1∶1 000稀釋）及抗GAPDH 抗體（GTX100118，1∶5 000 稀釋），4 ℃過(guò)夜。洗膜，置入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗（Abcam 公司產(chǎn)品，ab7090，1∶10 000 稀釋）稀釋液室溫孵育1 h，化學(xué)發(fā)光底物顯影。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有統(tǒng)計(jì)分析均在R語(yǔ)言中進(jìn)行。采用ROC曲線分析SERPINE1可否作為診斷標(biāo)志物。采用T檢驗(yàn)分析臨床病理特征與SERPINE1表達(dá)的關(guān)系。由于TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中臨床信息并不完整，患者年齡、TNM 分期等臨床信息部分缺失，無(wú)法完成完整分析，且部分結(jié)果中的樣本總數(shù)與不同臨床類(lèi)別樣本數(shù)也存在差異。

2 結(jié)果

2.1 SERPINE1 在泛癌中的表達(dá) 為確定腫瘤和正常組織中SERPINE1表達(dá)差異，通過(guò)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析目標(biāo)基因在21 種人類(lèi)癌癥中的表達(dá)（圖1），與相應(yīng)正常組織相比，SERPINE1 在12 種癌癥類(lèi)型中表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，9 種高表達(dá)，包括乳腺浸潤(rùn)性癌（BRCA）、結(jié)腸腺癌（COAD）、食管癌（ESCA）、多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）、頭頸鱗狀細(xì)胞癌（HNSC）、腎透明細(xì)胞癌（KIRC）、直腸腺癌（READ）、胃癌（STAD）、甲狀腺癌（THCA）；低表達(dá)的為腎嫌色細(xì)胞（KICH）、腎乳頭狀細(xì)胞癌（KIRP）、肝細(xì)胞癌（LIHC）；在膀胱尿路上皮癌（BLCA）、宮頸鱗癌和腺癌（CESC）、膽管癌（CHOL）、肺腺癌（LUAD）、肺鱗癌（LUSC）、胰腺癌（PAAD）、嗜鉻細(xì)胞瘤和副神經(jīng)節(jié)瘤（PCPG）、前列腺癌（PRAD）、子宮內(nèi)膜癌（UCEC）中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 SERPINE1在21種人類(lèi)腫瘤中的表達(dá)Fig.1 SERPINE1 expression in 21 types of human cancer

2.2 胃癌患者SERPINE1 表達(dá) 為評(píng)估胃癌和正常組織中SERPINE1 表達(dá)，使用R 語(yǔ)言軟件分析從TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得的RNA 測(cè)序數(shù)據(jù)，F(xiàn)PKM（Fregments Per Kilobase per Million）格式的RNAseq 數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為T(mén)PM（transcripts per million reads）格式并進(jìn)行l(wèi)og2轉(zhuǎn)化，得到mRNA表達(dá)的TCGA譜（包括375個(gè)胃癌和32 個(gè)正常組織樣本）。由于TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)胃癌的癌旁組織樣本較少（圖2A），從GTEx 數(shù)據(jù)庫(kù)下載359 個(gè)正常樣本（圖2B），發(fā)現(xiàn)與正常組織相比，SERPINE1 在胃癌組織中過(guò)表達(dá)（P<0.001）。通過(guò)GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)一步驗(yàn)證胃癌組織中SERPINE1 呈高表達(dá)（圖2C）?；赥CGA 數(shù)據(jù)集分析27 個(gè)胃癌組織及其相鄰正常胃組織提示SERPINE1 在胃癌中的表達(dá)較高（P<0.001，圖2D）。ROC 曲線分析SERPINE1 的診斷價(jià)值，AUC 為0.871（圖2E），具有一定診斷價(jià)值。Western blot 驗(yàn)證3 對(duì)臨床組織樣本，結(jié)果表明胃癌中SERPINE1 表達(dá)顯著高于相鄰正常組織（圖2F）。表明SERPINE1可能是胃癌的一種潛在診斷生物標(biāo)志物。

2.3 SERPINE1 表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 為更好地了解SERPINE1在胃癌中的作用，使用TCGA隊(duì)列分析其與某些臨床特征的關(guān)聯(lián)。獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)顯示，T2&T3&T4 高于T1 平均水平，White 高于Asian 平均水平，Tumor 高于Normal 平均水平，G3 高于G2 平均水平（P<0.05）。癌癥晚期患者SERPINE1 表達(dá)較高。提示SERPINE1 高表達(dá)與較晚的T 分期（P<0.001，圖3A）、種族（P=0.003，圖3B）、臨床狀況（P<0.001，圖3C）和較低級(jí)別的組織病理分級(jí)（P=0.009，圖3D）相關(guān)。表明SERPINE1 表達(dá)與臨床特征有關(guān)。

2.4 SERPINE1 表達(dá)與患者預(yù)后相關(guān) 通過(guò)OS、DFS、DSS 和PFS 分析進(jìn)一步驗(yàn)證SERPINE1 表達(dá)與胃癌預(yù)后的相關(guān)性，K-M結(jié)果顯示，SERPINE1高表達(dá)患者OS較短（P=0.000 030 2，圖4A）。SERPINE1高表達(dá)胃癌患者DFS、DSS 及PFS 均較差（P=0.033 6、0.011 6、0.004 0，圖4B～D）。提示SERPINE1 高表達(dá)與患者不良預(yù)后相關(guān)。

圖4 SERPINE1 mRNA水平在STAD患者中的預(yù)后價(jià)值Fig.4 Prognostic value of SERPINE1 mRNA level in STAD patients

2.5 SERPINE1 與胃癌組織免疫細(xì)胞浸潤(rùn)相關(guān)腫瘤微環(huán)境中的免疫浸潤(rùn)在腫瘤預(yù)后中起關(guān)鍵作用，腫瘤免疫治療作為一種創(chuàng)新治療方式也逐漸被人們熟知［17］。通過(guò)TIMER 數(shù)據(jù)庫(kù)評(píng)估SERPINE1與胃癌組織免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的相關(guān)性（圖5A），SERPINE1與胃癌免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平顯著相關(guān)（P<0.05）。獨(dú)立免疫細(xì)胞浸潤(rùn)相關(guān)性分析可為研究SERPINE1 功能和機(jī)制提供關(guān)鍵線索。進(jìn)一步評(píng)估SERPINE1 表達(dá)與各種免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的相關(guān)性（圖5B），SERPINE1 表達(dá)與大部分免疫細(xì)胞呈正相關(guān)，包括胃癌組織中的CD8+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞（P<0.05），與B 細(xì)胞則呈負(fù)相關(guān)（P<0.05）。根據(jù)SERPINE1表達(dá)將375個(gè)腫瘤樣本分為兩組，其中高表達(dá)組188 個(gè)樣本，低表達(dá)組187 個(gè)樣本，分析24個(gè)免疫細(xì)胞在不同SERPINE1表達(dá)組的差異表達(dá)以確定胃癌中 SERPINE1高表達(dá)和低表達(dá)的腫瘤免疫微環(huán)境是否存在差異（圖5C），結(jié)果表明，SERPINE1高/低表達(dá)組CD4+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、NK 細(xì)胞、效應(yīng)記憶型T細(xì)胞表達(dá)差異大、相關(guān)性強(qiáng)。表明胃癌組織中SERPINE1 表達(dá)以不同方式參與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)。

圖5 STAD組織免疫浸潤(rùn)與SERPINE1表達(dá)的關(guān)系Fig.5 Relationship between immune infiltration and expression of SERPINE1 in STAD

2.6 胃癌中SERPINE1 表達(dá)與免疫檢查點(diǎn)的聯(lián)系 PDCD1、TIGIT 和HAVCR2 是腫瘤免疫逃逸的重要免疫檢查點(diǎn)。考慮到SERPINE1 在胃癌中的潛在致 癌作 用，評(píng)估SERPINE1 與PDCD1、TIGIT 和HAVCR2 的關(guān)系（圖6A、C、E），SERPINE1 表達(dá)與胃癌中PDCD1、TIGIT 和HAVCR2 表達(dá)呈正相關(guān)（純度調(diào)整）。通過(guò)GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)再次對(duì)SERPINE1 與胃癌中PDCD1、TIGIT 和HAVCR2 的相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果與TIMER 數(shù)據(jù)分析一致（圖6B、D、F）。表明腫瘤免疫逃逸可能參與SERPINE1介導(dǎo)的胃癌進(jìn)展。

圖6 STAD 中SERPINE1表達(dá)與PDCD1、TIGIT、HAVCR2表達(dá)的關(guān)系Fig.6 Relationship between SERPINE1 expression and PDCD1，TIGIT and HAVCR2 expressions in STAD

2.7 與SERPINE1 共表達(dá)基因的功能富集分析為探索SERPINE1 在胃癌中的生物學(xué)功能，進(jìn)行SERPINE1 共表達(dá)分析。繪制胃癌中基于SERPINE1 共表達(dá)狀態(tài)的差異表達(dá)火山圖［|log2Fold-Change（log2FC）|≥1，圖7A］以及胃癌中與SERPINE1正/負(fù)相關(guān)的熱圖（共27個(gè)基因，圖7B），共表達(dá)閾值為P<0.05。針對(duì)共表達(dá)基因進(jìn)行GO 和KEGG 分析。氣泡圖顯示前12 條關(guān)于GO 和KEGG 的信息，包括BP（生物學(xué)過(guò)程）、CC（細(xì)胞成分）、MF（分子功能）和KEGG。GO 功能注釋顯示SERPINE1 共表達(dá)主要參與胰腺分泌。KEGG 通路分析顯示SERPINE1 共表達(dá)主要與表皮生長(zhǎng)、表皮細(xì)胞分化和角質(zhì)形成細(xì)胞分化通路有關(guān)（圖7C）。

圖7 SERPINE1在STAD中的功能富集分析Fig.7 Functional enrichment analysis of SERPINE1 in STAD

2.8 通路富集分析 為進(jìn)一步闡明SERPINE1在胃癌發(fā)生發(fā)展中的潛在機(jī)制，使用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建SERPINE1的PPI網(wǎng)絡(luò)。前10個(gè)功能伴侶基因（LRP1、PLAUR、PLAT、PLAU、VTN、PLG、VLDLR、SMAD2、SMAD3和SMAD7）具有高度連接性（圖8A、B），通過(guò)R 語(yǔ)言clusterProfiler 包對(duì)SERPINE1 及相關(guān)基因進(jìn)行GO 和KEGG 富集分析（P<0.05，圖8C）。BP 主要包括“傷口愈合負(fù)調(diào)節(jié)”“對(duì)傷害反應(yīng)的調(diào)節(jié)”和“傷害反應(yīng)的負(fù)性調(diào)節(jié)”。CC 主要包括膜的外在成分、血小板α 顆粒管腔和網(wǎng)格蛋白涂層坑。MF 主要包括轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子受體、胞質(zhì)介質(zhì)活性、載脂蛋白結(jié)合和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子受體結(jié)合。KEGG 主要包括補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)、組織Apelin 信號(hào)通路和Hippo 信號(hào)通路。具體分析上述伴侶基因與SERPINE1 表達(dá)在胃癌患者中的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)目標(biāo)基因與PLAT 水平呈正相關(guān)（r=0.476，P<0.001，圖8D）。同時(shí)PLAT 高表達(dá)也與胃癌較差的預(yù)后相關(guān)（P<0.001，圖8E）。

圖8 信號(hào)通路功能標(biāo)注與預(yù)測(cè)Fig.8 Functional annotation and prediction of signaling pathways

2.9 胃癌中SERPINE1 相關(guān)miRNA 越來(lái)越多的證據(jù)表明“l(fā)ncRNA-miRNA-mRNA” ceRNA 網(wǎng)絡(luò)在多種人類(lèi)癌癥中發(fā)揮關(guān)鍵作用，因此本研究利用在線工具分析和構(gòu)建胃癌中涉及SERPINE1的ceRNA 網(wǎng)絡(luò)。使用PITA、miRmap 和miRanda 數(shù)據(jù)庫(kù)分別分析和預(yù)測(cè)142、45 和38 個(gè)SERPINE1 目標(biāo)miRNAs。Venn 圖顯示了預(yù)測(cè)結(jié)果，被3 個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)共同預(yù)測(cè)的靶miRNA 共21 個(gè)，包括hsa-miR-19a-3p、hsa-miR-19b-3p、hsa-miR-22-3p、hsa-miR-196a-5p、hsa-miR-148a-3p、hsa-miR-10a-5p、hsa-miR-10b-5p、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-181b-5p、hsa-miR-181c-5p、hsamiR-130a-3p、hsa-miR-145-5p、hsa-miR-150-5p、hsamiR-193a-3p、hsa-miR-301a-3p、hsa-miR-130b-3p、hsa-miR-148b-3p、hsa-miR-196b-5p、hsa-miR-193b-3p、hsa-miR-181d-5p、hsa-miR-301b-3p（圖9A）。分析靶miRNA 表達(dá)與SERPINE1表達(dá)的相關(guān)性以篩選更符合ceRNA 條件的miRNA（圖9B），相關(guān)性分析證明有3個(gè)靶miRNA表達(dá)與SERPINE1呈負(fù)相關(guān)，即hsamiR-19a-3p（r=-0.187，P<0.001）、hsa-miR-148a-3p（r=-0.202，P<0.001）和hsa-miR-19b-3p（r=-0.145，P<0.001）。TargetScan 預(yù)測(cè)SERPINE1 與靶miRNA存在潛在結(jié)合位點(diǎn)（圖9C）。

圖9 胃癌中SERPINE1靶向miRNAs預(yù)測(cè)Fig.9 Prediction of miRNAs targeting SERPINE1 in gastric cancer

2.10 胃癌中SERPINE1相關(guān)ceRNA 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 使用miRNet、starBase 和starBase2.0 在線數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)一步預(yù)測(cè)可能與3 種靶miRNA（hsa-miR-19a-3p、hsamiR-148a-3p 和hsa-miR-19b-3p）結(jié)合的lncRNA（圖10A～C）?；赾eRNA 網(wǎng)絡(luò)假設(shè)，lncRNA 與miRNA 呈負(fù)相關(guān)。因此使用starBase 數(shù)據(jù)庫(kù)分析胃癌中靶l(wèi)ncRNA 表達(dá)與miRNA 的相關(guān)性（圖10D），有5 個(gè)靶l(wèi)ncRNAs 表達(dá)與hsa-miR-148a-3p 呈負(fù)相關(guān)，分別為H19、HOTAIRM1、KIF9-AS1、NUTM2AAS1 和OIP5-AS1。僅有FGD5-AS1 和SLC26A4-AS1表達(dá)與hsa-miR-19a-3p 呈負(fù)相關(guān)（圖10E），F(xiàn)GD5-AS1 和SLC26A4-AS1 表達(dá)與hsa-miR-19b-3p 呈負(fù)相關(guān)（圖10F）?；赾eRNA假設(shè)，miRNA與lncRNA或mRNA 呈負(fù)相關(guān)，因此基于相關(guān)性分析結(jié)果可構(gòu)建9 對(duì)ceRNA 網(wǎng)絡(luò)（H19-miR-148a-3p-SERPINE1、HOTAIRM1-miR-148a-3p-SERPINE1、KIF9-AS1-miR-148a-3p-SERPINE1、NUTM2A-AS1-miR-148a-3p-SERPINE1、OIP5-AS1-miR-148a-3p-SERPINE1、FGD5-AS1-miR-19a-3p-SERPINE1、SLC26A4-AS1-miR-19a-3p-SERPINE1、FGD5-AS1-miR-19b-3p-SERPINE1 和FGD5-AS1-miR-19b-3p-SERPINE1，圖10G）。

圖10 lncRNA和ceRNA網(wǎng)絡(luò)在胃癌中的構(gòu)建預(yù)測(cè)Fig.10 Prediction of lncRNA and ceRNA network construction in gastric cancer

3 討論

胃癌是一種具有高度侵襲性的惡性腫瘤，作為公共衛(wèi)生危機(jī)持續(xù)存在［18-19］。SERPINE1 是一種從肝細(xì)胞組成型釋放的蛋白酶抑制劑，可作為細(xì)胞遷移的調(diào)節(jié)劑，參與細(xì)胞黏附和擴(kuò)散調(diào)節(jié)，從而參與腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程［20］。研究表明SERPINE1 在多種癌癥中過(guò)表達(dá)，尤其是胃癌，其高表達(dá)預(yù)示較差的總生存期［21］。本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了SERPINE1在胃癌中的差異表達(dá)。

通過(guò)TCGA 數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)SERPINE1 在9 種癌癥中高表達(dá)。通過(guò)對(duì)TCGA 胃癌隊(duì)列分析發(fā)現(xiàn)，與正常組織相比，胃癌組織中SERPINE1 表達(dá)明顯升高，與GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果一致。SERPINE1 表達(dá)與T分期、種族、腫瘤狀態(tài)、組織學(xué)分級(jí)顯著相關(guān)。SERPINE1 高表達(dá)提示更晚的癌癥階段和較差預(yù)后。

為探索胃癌中SERPINE1 與免疫浸潤(rùn)的關(guān)系，使用TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)揭示胃癌中SERPINE1表達(dá)與免疫浸潤(rùn)水平的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)SERPINE1 表達(dá)與大部分免疫細(xì)胞包括CD8+T 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞呈顯著正相關(guān)，但與B細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)。另外，在24 種免疫細(xì)胞中還發(fā)現(xiàn)SERPINE1 高/低表達(dá)組間CD4+T 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、NK 細(xì)胞、效應(yīng)記憶型T細(xì)胞表達(dá)差異較大，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［22］。近年免疫檢查點(diǎn)抑制劑在腫瘤免疫治療方面取得了突破性成果［23］。在抑制性免疫檢查點(diǎn)分子中，PDCD1、TIGIT 和HAVCR2 抗體阻斷在癌癥免疫治療中的功效正在廣泛研究中［24-25］。本研究發(fā)現(xiàn)SERPINE1與胃癌中的PDCD1、TIGIT和HAVCR2 表達(dá)呈顯著正相關(guān)，表明腫瘤免疫逃逸可能參與SERPINE1 介導(dǎo)的胃癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程。因此認(rèn)為SERPINE1在胃癌免疫調(diào)節(jié)中起重要作用。

ceRNA間的串?dāng)_通過(guò)lncRNA或環(huán)狀RNA（circ-RNA）競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNA 影響mRNA 表達(dá)實(shí)現(xiàn)［26］。lncRNA 和circRNA 起miRNA 海綿 作用，降 低體 內(nèi)miRNA豐度，從而干擾miRNA對(duì)下游靶基因的抑制作用［27-28］。本研究首先預(yù)測(cè)了SERPINE1 的一些上游miRNA，PITA、miRmap 和miRanda 數(shù)據(jù)庫(kù)共同預(yù)測(cè)了21 個(gè)潛在的上游miRNA，進(jìn)一步篩選僅有3 個(gè)miRNA（hsa-miR-19a-3p、hsa-miR-148a-3p、hsa-miR-19b-3p）表達(dá)與胃癌SERPINE1 顯著負(fù)相關(guān)。LI等［29］報(bào)道胃癌中miR-19a-3p 過(guò)表達(dá)可促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。BAO 等［30］發(fā)現(xiàn)miR-148-3p 在胃癌中低表達(dá)，上調(diào)miR-148a-3p 可抑制胃癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移及腫瘤干細(xì)胞樣特性。WEI 等［31］報(bào)道m(xù)iR-19b-3p 在胃癌中低表達(dá)，可通過(guò)負(fù)調(diào)控Neuropilin-1 抑制胃癌發(fā)展。lncRNA 可直接與miRNA 結(jié)合發(fā)揮阻礙miRNA的作用，促進(jìn)mRNA 表達(dá)。進(jìn)一步預(yù)測(cè)了這些關(guān)鍵miRNA 的上游lncRNA，通過(guò)相關(guān)性分析，9 個(gè)lnc-RNA（H19、HOTAIRM1、KIF9-AS1、NUTM2A-AS1、OIP5-AS1、FGD5-AS1、SLC26A4-AS1、FGD5-AS1、SLC26A4-AS1）被定義為關(guān)鍵lncRNA，進(jìn)一步提示分析的可行性。SERPINE1 的ceRNA 網(wǎng)絡(luò)是通過(guò)生物信息學(xué)分析得到的，還需更多實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

綜上，本研究全面分析了胃癌中SERPINE1 表達(dá)與腫瘤免疫浸潤(rùn)和ceRNA 網(wǎng)絡(luò)的關(guān)系，通過(guò)多種生物信息學(xué)分析提取并分析了來(lái)自TCGA、GTEx、GEPIA、TIMER 等的數(shù)據(jù)集，研究SERPINE1 參與胃癌的潛在致癌機(jī)制，包括SERPINE1 與診斷、預(yù)后、免疫檢查點(diǎn)、腫瘤微環(huán)境、免疫細(xì)胞浸潤(rùn)及其可能的作用機(jī)制。進(jìn)一步GO 和KEGG 研究SERPINE1在胃癌中的潛在作用，發(fā)現(xiàn)與正常組織相比，胃癌組織中SERPINE1 mRNA 水平較高，SERPINE1 表達(dá)在中低分化胃癌組織中較高。此外，發(fā)現(xiàn)SERPINE1 可能是胃癌的獨(dú)立預(yù)后因素，且SERPINE1高表達(dá)與胃癌不良預(yù)后相關(guān)。SERPINE1 表達(dá)與多種免疫細(xì)胞相關(guān)，可能通過(guò)抑制免疫細(xì)胞浸潤(rùn)影響胃癌發(fā)生發(fā)展。SERPINE1 也被證實(shí)與免疫相關(guān)基因及免疫檢查點(diǎn)共表達(dá)。SERPINE1 可能通過(guò)胰腺分泌、表皮生長(zhǎng)、表皮細(xì)胞分化和角質(zhì)形成細(xì)胞分化通路調(diào)節(jié)胃癌發(fā)病機(jī)制；PPI 分析結(jié)果提示SERPINE1可能通過(guò)PLAT參與胃癌進(jìn)展。SERPINE1的ceRNA 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建表明SERPINE1 可能參與胃癌多種分子調(diào)控機(jī)制。SERPINE1 可作為胃癌診斷和治療的有效生物標(biāo)志物，且是免疫治療的潛在靶點(diǎn)。