王 煒 郭玲慧 張 岱 任偉宏（河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，鄭州 450000）

細(xì)胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）是由細(xì)胞主動(dòng)分泌的納米級(jí)膜囊泡，根據(jù)大小、生物學(xué)特征及形成機(jī)制的不同，通常將EVs分為微囊泡、外泌體和凋亡小體。目前認(rèn)為外泌體是細(xì)胞在正?；虿±?xiàng)l件下分泌的直徑為40～180 nm 的雙層脂質(zhì)囊泡［1］。它們由晚期內(nèi)體形成，并表達(dá)內(nèi)體通路的特定標(biāo)志物，例如四跨膜蛋白（CD63、CD9、CD81），但也表達(dá)HSP70 和Rab 家族蛋白、Tsg101 和Alix，這些標(biāo)志蛋白在其他類(lèi)型的囊泡中檢測(cè)不到。四跨膜蛋白（CD63、CD81 和CD9）在過(guò)去的二十年中已被用作外泌體標(biāo)志物。最近的研究顯示，含有CD9/CD81 或CD63 標(biāo)記的EVs 產(chǎn)生方式存在差異［2］。帶有少量CD63標(biāo)記的EVs主要從質(zhì)膜出芽；而帶有大量CD63 和少量CD9 的EVs 在內(nèi)體隔室中形成并被分泌出細(xì)胞，這部分EVs稱(chēng)為外泌體。

外泌體中含有各種生物分子，如蛋白質(zhì)、RNA（mRNA、miRNA 和其他非編碼RNA）、DNA（線粒體DNA 和病毒DNA 等）、脂質(zhì)、氨基酸和代謝物［3-4］。腫瘤細(xì)胞來(lái)源的外泌體可以作為信息的傳遞者，將其攜帶的生物分子傳遞給鄰近或者遠(yuǎn)處的受體細(xì)胞，在腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮著免疫抑制作用［5-8］。目前的研究多是針對(duì)免疫細(xì)胞，是否有正常組織細(xì)胞可以攝取腫瘤細(xì)胞來(lái)源外泌體以及免疫細(xì)胞攝取腫瘤來(lái)源外泌體的比例。而分析不同組織細(xì)胞攝取腫瘤外泌體的情況可以幫助理解腫瘤分泌的外泌體對(duì)機(jī)體各組織的影響范圍。

為了觀察不同細(xì)胞系攝取外泌體的能力，使用綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）融合CD63（hCD63）分子示蹤外泌體。使用流式細(xì)胞術(shù)分析不同組織來(lái)源的細(xì)胞系對(duì)胃癌細(xì)胞來(lái)源外泌體的攝取情況。

1 材料與方法

1.1 材料 pLVX-puro質(zhì)粒、psPAX2質(zhì)粒、pMD2.G質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室保存。RPMI1640、DMEM、胰蛋白酶、青鏈霉素、嘌呤霉素購(gòu)自索萊寶公司；opti-MEM購(gòu)自Gibco 公司；胎牛血清購(gòu)自Biological Industries公司；高保真DNA 聚合酶、限制性核酸內(nèi)切酶、T4 DNA 連接酶、DNA marker 購(gòu)自TaKaRa 公司；聚乙烯亞 胺（Ethylene imine polymer，PEI）、聚凝胺和HEPES 鈉購(gòu) 自Sigma 公司；Milipure 超濾管購(gòu)自默克；NucleoBond Xtra Midi 試劑盒購(gòu)自德國(guó)MN 公司；MGC803、GES-1 細(xì)胞購(gòu)自湖南豐暉生物有限公司；HEK293T 細(xì)胞本實(shí)驗(yàn)室保存；THP-1 細(xì)胞、A549 細(xì)胞及CACO-2 細(xì)胞由河南省病毒性疾病中醫(yī)藥防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)。引物合成及基因測(cè)序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒的構(gòu)建 采用逆轉(zhuǎn)錄PCR 方法，從GES-1 細(xì)胞中克隆hCD63 分子。設(shè)計(jì)hCD63 和mNeptune 的引物，融合蛋白N 端基因的3′端引物與C 端基因的5′端引物重疊20 bp 堿基，先分別使用各引物進(jìn)行擴(kuò)增25 個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋500 倍后，使用融合基因的上游及下游引物進(jìn)行第二輪PCR合成融合基因；用限制性核酸內(nèi)切酶酶切融合基因和pLVX-Puro 慢病毒載體，瓊脂糖凝膠電泳純化酶切產(chǎn)物。T4 DNA連接酶連接融合基因和pLVX-Puro慢病毒載體。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5α 感受態(tài)細(xì)胞后挑取菌落送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行基因測(cè)序，檢測(cè)插入的基因是否完整和正確。hCD63 基因通過(guò)酶切連接入pLVX-AcGFP1 載體中，引物序列見(jiàn)表1。

表1 質(zhì)粒構(gòu)建中使用的引物Tab.1 Primers used in plasmid construction

1.2.2 不同標(biāo)記方法的比較 采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方法比較熒光蛋白與hCD63不同融合方式對(duì)熒光強(qiáng)度的影 響。pLVX-CD63/mNeptune-puro、pLVX-mNeptune/CD63-puro、pLVX-CD63-AcGFP1 質(zhì)粒使用PEI轉(zhuǎn)染HEK293T。轉(zhuǎn)染72 h 后采用倒置熒光顯微鏡觀察熒光信號(hào)并收集細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞中含有紅色熒光信號(hào)細(xì)胞的比例及平均熒光強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次，結(jié)果采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析。

1.2.3 慢病毒包裝濃縮 目前有兩種方式標(biāo)記hCD63 分子，一種是在hCD63 分子的氨基端標(biāo)記熒光蛋白，另一種是在hCD63 分子的羧基端標(biāo)記熒光蛋白［9-10］。為比較兩種方法的優(yōu)劣，使用mNeptune紅色熒光蛋白基因分別融合在hCD63 基因的氨基端和羧基端，構(gòu)建了兩種慢病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒。此外使用AcGFP1 綠色熒光蛋白對(duì)hCD63 分子進(jìn)行標(biāo)記，并與紅色熒光標(biāo)記的hCD63 進(jìn)行比較。慢病毒顆粒的包裝采用修改的方法［11］。簡(jiǎn)而言之，HEK293T細(xì)胞生長(zhǎng)到60%融合時(shí)，使用25 mmol/L氯喹處理5 h后加入基因轉(zhuǎn)移質(zhì)粒、psPAX2、pMD2.G（4∶3∶1）。轉(zhuǎn)染后分別在48 h 和72 h 收集細(xì)胞培養(yǎng)液上清。含有慢病毒顆粒的上清液結(jié)合差速離心、過(guò)濾及超濾進(jìn)行感染顆粒的濃縮。使用ELISA 檢測(cè)P24，對(duì)濃縮后的感染顆粒濃度進(jìn)行估算［12］。

1.2.4 標(biāo)記細(xì)胞的篩選及鑒定 使用pLVXCD63-AcGFP1 包裝的慢病毒顆粒感染MGC-803 細(xì)胞，感染細(xì)胞4 d 后，加終濃度為10 μg/ml 嘌呤霉素篩選穩(wěn)定表達(dá)重組hCD63-AcGFP1的MGC-803細(xì)胞系。嘌呤霉素篩選4 周后，交替使用有限稀釋法和克隆挑取法篩選穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白的MGC-803 細(xì)胞株。使用共聚焦顯微鏡觀察熒光信號(hào)的定位。

1.2.5 標(biāo)記外泌體的制備及鑒定 外泌體采用饑餓培養(yǎng)及超速離心機(jī)制備［13］。使用RPMI1640 基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)熒光標(biāo)記的MGC-803 細(xì)胞48 h 后收取上清。2 000 g 離心20 min 去除細(xì)胞，10 000 g 離心30 min除細(xì)胞碎片。并采用0.22 μm 一次性過(guò)濾器過(guò)濾，去除>200 nm 囊泡。用截留分子量為100 kD的超濾管進(jìn)行超濾，去除雜蛋白。濃縮后的外泌體使用超速離心機(jī)收集外泌體。并用透射電鏡觀察制備的外泌體形態(tài)。通過(guò)BCA 蛋白檢測(cè)試劑盒檢測(cè)外泌體濃度。將外泌體的濃度調(diào)整為4 mg/ml。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)分析標(biāo)記外泌體的攝取 終濃度為500 μg/ml的標(biāo)記外泌體和2×105個(gè)不同組織來(lái)源細(xì)胞（HEK293T 人胚腎細(xì)胞、CACO-2 結(jié)腸癌細(xì)胞、GES-1人胃黏膜細(xì)胞、A549人肺癌細(xì)胞和THP-1單核細(xì)胞系樣細(xì)胞）加入12孔板中孵育24 h后使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞熒光信號(hào)［14］?？瞻讓?duì)照組使用未標(biāo)記的外泌體進(jìn)行共孵育培養(yǎng)。

2 結(jié)果

2.1 hCD63 與熒光蛋白融合基因的構(gòu)建 使用重疊PCR 構(gòu)建融合基因，如圖1。Marker1 是DL2000；Marker2 是DL15000。圖1A 顯示在750 bp marker 旁有兩條帶，分別與hCD63 和mNeptune 基因大小近似；在1 000 bp 和2 000 bp marker 旁有一條帶與融合基因hCD63/mNeptune 大小近似。使用酶切連接方法將融合基因與pLVX-puro 連接。重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證結(jié)果如圖1B。pLVX-CD63-AcGFP1-PURO 質(zhì)粒雙酶切結(jié)果如圖1C。融合基因Sanger 測(cè)序峰如圖2，hCD63 和mNeptune 基因以正確的讀碼框連接在一起。

圖1 重組質(zhì)粒構(gòu)建結(jié)果Fig.1 Construction result of recombinant plasmid

圖2 融合基因測(cè)序結(jié)果Fig.2 Results of fusion gene sequencing

2.2 不同標(biāo)記方法的比較 質(zhì)粒pLVX-CD63/mNeptune-puro、pLVX-mNeptune/CD63-puro 轉(zhuǎn)染HEK-293T 細(xì)胞后的流式細(xì)胞儀分析結(jié)果，如圖3。圖3A顯示不同標(biāo)記方法使HEK293T 細(xì)胞攜帶熒光的細(xì)胞比例。hCD63分子羧基端標(biāo)記方法轉(zhuǎn)染細(xì)胞的熒光攜帶比率為96.8%；氨基端標(biāo)記的熒光攜帶比率為88.5%。攜帶熒光信號(hào)細(xì)胞比例在兩種標(biāo)記方法中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。不同標(biāo)記方法在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度比較，如圖3B。hCD63 羧基端標(biāo)記和氨基標(biāo)記方法在細(xì)胞中產(chǎn)生的熒光信號(hào)存在差異。hCD63分子羧基端標(biāo)記的熒光蛋白發(fā)出的熒光信號(hào)在細(xì)胞內(nèi)的平均熒光強(qiáng)度比氨基端標(biāo)記的強(qiáng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。圖4B綠色熒光蛋白標(biāo)記的細(xì)胞在顯微鏡下的顯示的亮度比圖4A 紅色熒光強(qiáng)。綠色熒光標(biāo)記的細(xì)胞可以清晰顯示出細(xì)胞膜輪廓，紅色熒光標(biāo)記的細(xì)胞輪廓較為模糊。

圖3 細(xì)胞攜熒光強(qiáng)度的比較Fig.3 Comparison of cell fluorescence intensity

圖4 不同熒光顏色標(biāo)記hCD63在HEK293T細(xì)胞的比較Fig.4 Comparison of hCD63 labeled with different fluorescent colors in HEK293T cells

2.3 熒光標(biāo)記細(xì)胞的篩選結(jié)果 選擇綠色熒光蛋白AcGFP1 對(duì)hCD63 標(biāo)記。篩選得到的細(xì)胞克隆如圖5A所示。綠色熒光信號(hào)分布于細(xì)胞表面，在細(xì)胞與細(xì)胞連接處熒光信號(hào)增強(qiáng)。提示標(biāo)記的hCD63與天然分子一樣定位于細(xì)胞膜上。為進(jìn)一步確定熒光信號(hào)在細(xì)胞內(nèi)的定位，使用共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察，結(jié)果如圖5B。綠色熒光信號(hào)主要聚集在細(xì)胞膜上，熒光蛋白的標(biāo)記沒(méi)有干擾hCD63 分子在細(xì)胞內(nèi)的點(diǎn)位。白色箭頭所示為即將從細(xì)胞膜上分離的細(xì)胞囊泡結(jié)構(gòu)。

圖5 綠色熒光標(biāo)記hCD63細(xì)胞株的篩選Fig.5 Screening of hCD63 cells labeled with green fluorescence

2.4 制備外泌體的鑒定 使用透射電鏡觀察制備的外泌體，如圖6 所示。在透射電子顯微鏡下觀察到呈典型茶托狀的外泌體，直徑大多為40～160 nm。熒光蛋白標(biāo)記不能改變外泌體的形狀。增加超濾管處理步驟后，電鏡照片背景中蛋白雜質(zhì)較少看見(jiàn)。

圖6 制備熒光標(biāo)記外泌體的電子顯微鏡觀察Fig.6 Electron microscope observation of preparation of fluorescently labeled exosomes

2.5 不同細(xì)胞株攝取外泌體分析 不同受體細(xì)胞攝取胃癌細(xì)胞來(lái)源外泌體的能力存在差異，如圖7。HEK293T 細(xì)胞攝取CD63 標(biāo)記外泌體比例為（0.038 0±0.005 6）% ；CACO-2 細(xì)胞為（0.260±0.021）%；GES-1 細(xì)胞為（0.260±0.028）%；A549 細(xì)胞為（1.10±0.11）%；THP-1 細(xì)胞為（5.76±0.66）%。CACO-2 細(xì)胞空白組與實(shí)驗(yàn)組組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），其余各細(xì)胞株空白對(duì)照組與其實(shí)驗(yàn)組組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示CACO-2 細(xì)胞株不攝取MGC-803 細(xì)胞的外泌體。人單核細(xì)胞THP-1 攜帶綠色熒光的細(xì)胞百分比最高［（5.76±0.66）%］，提示外泌體更易被THP-1細(xì)胞攝取。

圖7 不同組織來(lái)源細(xì)胞攝取胃癌細(xì)胞外泌體的分析Fig.7 Analysis of exosomes uptake by gastric cancer cells from different tissue sources

3 討論

本研究以胃癌細(xì)胞MGC803來(lái)源的外泌體為研究對(duì)象，分析各種組織來(lái)源細(xì)胞對(duì)其的攝取情況。CD63 分子是外泌體上含量最多的標(biāo)記分子。為追蹤外泌體在細(xì)胞之間的傳遞，使用熒光蛋白對(duì)CD63分子進(jìn)行了標(biāo)記，從而進(jìn)一步對(duì)外泌體進(jìn)行標(biāo)記。比較了CD63 分子不同標(biāo)記方法對(duì)熒光強(qiáng)度的影響。熒光蛋白融合在CD63 分子的羧基端會(huì)產(chǎn)生最強(qiáng)的熒光信號(hào)。標(biāo)記外泌體與細(xì)胞共孵育后的流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示，不同組織來(lái)源的細(xì)胞株攝取外泌體存在差異。結(jié)腸腺癌細(xì)胞（CACO-2）不攝取MGC803 細(xì)胞來(lái)源外泌體，人胚腎細(xì)胞（HEK293T）、肺癌細(xì)胞（A549）、人胃黏膜細(xì)胞（GES-1）和單核細(xì)胞系樣細(xì)胞（THP-1）可以攝取MGC803 細(xì)胞來(lái)源的外泌體，但不同組織細(xì)胞攝取外泌體的比例存在較大差異，THP-1 細(xì)胞攝取外泌體的比例最大。提示MGC803 細(xì)胞來(lái)源外泌體更容易與免疫細(xì)胞結(jié)合。在攝取外泌體的4 種細(xì)胞株中，HEK293T 細(xì)胞、A549 細(xì)胞、GES-1 細(xì)胞分別來(lái)源于腎組織、肺組織及胃組織，均不具有分化能力。THP-1 是單核細(xì)胞系樣細(xì)胞，是具有分化潛能的細(xì)胞，可以被細(xì)胞因子誘導(dǎo)分化成巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞。細(xì)胞的分化能力是否會(huì)影響外泌體的攝取，或者外泌體是否更傾向于被幼稚細(xì)胞攝取，還需要進(jìn)一步去證明。胃癌組織來(lái)源的外泌體更容易進(jìn)入到單核細(xì)胞樣的THP-1 細(xì)胞系，也提示胃癌細(xì)胞對(duì)免疫系統(tǒng)的影響大于對(duì)其他組織細(xì)胞的影響，與之前的報(bào)道結(jié)果一致［8］。

本研究比較了兩種CD63 標(biāo)記方法的差異，并確定了最優(yōu)的標(biāo)記方式。同時(shí)，使用示蹤技術(shù)證明了胃癌細(xì)胞來(lái)源外泌體對(duì)各種免疫細(xì)胞的影響。