宋潼潼 惠文婷 顧逸雯 杜文靖 陳 霞（吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，長(zhǎng)春 130012）

心肌梗死（myocardial infarction，MI）是冠狀動(dòng)脈急性、持續(xù)性缺血缺氧所引起的心肌壞死，常常危及生命。炎癥反應(yīng)在MI 后的左心室重塑中起關(guān)鍵作用。研究表明，在MI 之后，樹(shù)突狀細(xì)胞（dendritic cells，DCs）從骨髓遷移到缺血區(qū)，在MI和邊界區(qū)域積累，參與調(diào)控?fù)p傷部位的炎癥反應(yīng)［1-2］。因此，基于DCs調(diào)控MI后的炎癥反應(yīng)是改善心梗損傷的可行策略。

堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）是調(diào)節(jié)多種生物學(xué)功能的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的成員。近年研究表明，bFGF治療可以通過(guò)減少體內(nèi)和體外的氧化應(yīng)激來(lái)保護(hù)心臟，緩解MI 損傷和心肌細(xì)胞凋亡［3］。然而，由于bFGF的半衰期短，高劑量bFGF 的不當(dāng)給藥伴有各類副作用，包括視網(wǎng)膜病變、低血壓、血管瘤、水腫和血小板減少癥等，因此bFGF 的治療給藥目前僅限于實(shí)驗(yàn)室和臨床試驗(yàn)［4］。為克服這一問(wèn)題，人們嘗試開(kāi)發(fā)多種藥物遞送系統(tǒng)負(fù)載bFGF 進(jìn)行靶向治療，其中水凝膠載藥系統(tǒng)是最受關(guān)注的方式之一。

水凝膠在組成和機(jī)械性能方面與細(xì)胞外基質(zhì)相似。它們能夠在組織再生過(guò)程中作為細(xì)胞的支持材料，并允許營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、代謝物和生長(zhǎng)因子的擴(kuò)散，目前常用于組織工程［5］。本項(xiàng)目中制備的水凝膠緩釋貼片采用的原料是由膠原蛋白衍生而來(lái)的明膠，具有豐富度高、成本低、生物相容性好、可降解、抗原性低等優(yōu)點(diǎn)。水凝膠包含親水性三維交聯(lián)結(jié)構(gòu)，能夠吸收大量水分，為了確保其穩(wěn)定性和機(jī)械性能，課題組以戊二醛為交聯(lián)劑，通過(guò)交聯(lián)反應(yīng)合成水凝膠［6］。

目前，已明確bFGF 可靶向包括內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞，發(fā)揮組織損傷修復(fù)作用，但其對(duì)DCs 的調(diào)控作用尚不明確。本研究在體外模擬MI 條件建立DC2.4 細(xì)胞氧糖剝奪（oxygen-glucose deprivation，OGD）模型，初步探究負(fù)載bFGF的緩釋水凝膠貼片對(duì)OGD 條件下DC2.4細(xì)胞的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系 細(xì)胞采用DC2.4 小鼠樹(shù)突狀細(xì)胞購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司（貨號(hào)：CL-0545）。

1.1.2 主要試劑 明膠（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；戊二醛（福晨化學(xué)試劑有限公司）；CCK-8（上海Bimake生物科技有限公司）；高糖DMEM 培養(yǎng)基、無(wú)糖DMEM 培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清（Gibco 公司）；TNF-α ELISA 試劑盒（聯(lián)科生物）；LDH 含量檢測(cè)試劑盒、MDA 含量檢測(cè)試劑盒、SOD 活力檢測(cè)試劑盒（北京索萊寶）。

1.1.3 主要儀器 MCO-170AICUVL-PC CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱；GC-C0626GC-C03 缺氧小室；D3024R 臺(tái)式高速冷凍型微量離心機(jī)；Tanon-4200SF顯影儀；Multiskan FC型酶標(biāo)儀。

1.2 方法

1.2.1 明膠水凝膠貼片的制備 使用超純水在60 ℃水浴加熱條件下制備不同濃度的明膠水凝膠（10%和20%），待明膠顆粒完全溶解并攪拌均勻后，將液體迅速轉(zhuǎn)入直徑為2 mm，厚度為2 mm 的圓形模具中，在4 ℃條件下進(jìn)行冷凝。凝固后的水凝膠貼片置于常溫下用戊二醛熏蒸不同時(shí)長(zhǎng)（24 h、48 h）后，將凝膠在-56 ℃下真空冷凍干燥24 h。

1.2.2 bFGF 裝載 將10 ng/μl bFGF 的PBS 溶 液通過(guò)0.22 μm 膜過(guò)濾，并在無(wú)菌條件下取100 μl 注入水凝膠貼片進(jìn)行藥物吸附，24 h 左右完成吸附。將凝膠在-56 ℃下真空冷凍干燥24 h。

1.2.3 不同濃度水凝膠貼片溶脹性能檢測(cè) 將重量為W0的完全干燥水凝膠樣品浸入pH7.4 的2 ml PBS溶液中，在不同時(shí)間點(diǎn)，用濾紙擦干膨脹水凝膠的表面，并稱量其重量Ws。按照公式：溶脹率（SR）%=［（Ws-W0）/W0］×100%，計(jì)算水凝膠溶脹性能。

1.2.4 水凝膠細(xì)胞毒性檢測(cè) 將水凝膠貼片浸入DMEM 培養(yǎng)基中，于24 h后收集浸出液，采用CCK-8法評(píng)價(jià)水凝膠浸出液對(duì)正常生長(zhǎng)的DC2.4 細(xì)胞活力的影響。

1.2.5 建立DC2.4 細(xì)胞氧糖剝奪模型 造模前將DC2.4細(xì)胞用正常培養(yǎng)基（DMEM+10%胎牛血清+1%雙抗），在37 ℃、5%CO2和95%空氣條件的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至密度為80%～90%時(shí)進(jìn)行OGD造模。OGD 處理時(shí)將細(xì)胞置于無(wú)糖DMEM 培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)箱中充入94%N2和5%CO2，在37 ℃下培養(yǎng)4 h。

1.2.6 Western blot 造模完成后收集細(xì)胞，加入RIPA裂解液（含蛋白酶和磷酸酶抑制劑），于冰上裂解30 min，在4 ℃，12 000 r/min 條件下離心20 min，取上清，采用BCA 蛋白定量試劑盒檢測(cè)蛋白樣品濃度。蛋白中加入適量5×loading buffer 于金屬浴中加熱變性5 min 后迅速置于冰上。將制備完成的蛋白樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，使用Image J軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.7 ELISA 按照標(biāo)準(zhǔn)品濃度每孔加入50 μl 標(biāo)準(zhǔn)品。在每孔加入10 μl 樣品和40 μl 樣品稀釋液。每孔加入100 μl HRP-conjugate 溶液，37 ℃孵育60 min。吸出孔內(nèi)的液體，用400 μl清洗液清洗，重復(fù)5次。每孔加入50 μl染色劑A和50 μl染色劑B，輕輕吹打混勻，37 ℃避光孵育15 min。每孔加入50 μl終止液，孔內(nèi)顏色由藍(lán)色變?yōu)辄S色。在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，數(shù)據(jù)處理。

1.2.8 LDH 活力檢測(cè) LDH 催化NAD+氧化乳酸生成丙酮酸，丙酮酸進(jìn)一步與2，4-二硝基苯肼作用生成丙酮酸二硝基苯腙，在堿性溶液中顯棕紅色，顏色深淺與丙酮酸濃度成正比。

1.2.9 MDA 含量檢測(cè) MDA 與硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）縮合，生成紅色產(chǎn)物，在532 nm 處有最大吸收峰，進(jìn)行比色后可估測(cè)樣品中過(guò)氧化脂質(zhì)的含量；同時(shí)測(cè)定600 nm 下的吸光度，利用532 nm 與600 nm 下吸光度的差值計(jì)算MDA含量。

1.2.10 SOD 活力檢測(cè) 通過(guò)黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子（O2-.），可還原氮藍(lán)四唑生成藍(lán)色甲臜，后者在560 nm 處有吸收；SOD可清除O2-.，從而抑制了甲臜的形成；反應(yīng)液藍(lán)色越深，說(shuō)明SOD活性愈低，反之活性越高。利用560 nm下的吸光度計(jì)算SOD活力。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用表示，實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少3 次，結(jié)果采用Graphpad Prism 8.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩樣本間比較采用t檢驗(yàn)，多組樣本間的比較采用單因素方差分析，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同制備條件下水凝膠溶脹性能比較 為篩選水凝膠最適制備條件，課題組配制了濃度為10%和20%的明膠水凝膠，并在室溫下通過(guò)戊二醛熏蒸分別交聯(lián)24 h和48 h。將冷凍干燥后的水凝膠貼片置于pH7.4 的PBS 溶液中，分別在3 min、5 min、10 min、20 min后檢測(cè)其溶脹率。如圖1A所示，10%的水凝膠溶脹率過(guò)高，不適宜用作組織貼片，20%的水凝膠在不同熏蒸時(shí)長(zhǎng)下溶脹率差異不明顯，因此選擇濃度為20%，戊二醛熏蒸時(shí)長(zhǎng)24 h 的水凝膠貼片（圖1B）進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 不同制備條件下水凝膠溶脹率Fig.1 Hydrated rate of hydrogel under different preparation conditions

2.2 水凝膠細(xì)胞毒性檢測(cè) 為明確水凝膠貼片是否影響細(xì)胞正常生長(zhǎng)，課題組將20%明膠水凝膠、戊二醛交聯(lián)24 h 的20%明膠水凝膠貼片，分別浸入DMEM 培養(yǎng)基中，于24 h 后收集浸出液，加入正常培養(yǎng)的DC2.4 細(xì)胞中，采用CCK-8 檢測(cè)共培養(yǎng)6 h、12 h、24 h 后的細(xì)胞活力。結(jié)果如圖2 所示，與正常培養(yǎng)的對(duì)照組相比，20%明膠水凝膠與DC2.4 細(xì)胞共培養(yǎng)24 h 對(duì)細(xì)胞活力無(wú)明顯影響，使用戊二醛交聯(lián)24 h 的20%明膠水凝膠貼片與DC2.4 細(xì)胞共培養(yǎng)6 h 均對(duì)細(xì)胞活力無(wú)明顯影響，共培養(yǎng)12 h、24 h后對(duì)細(xì)胞活力僅有輕微抑制作用（P<0.05）。

圖2 水凝膠細(xì)胞毒性檢測(cè)Fig.2 Hydrogel cytotoxicity assays

2.3 負(fù)載bFGF 水凝膠貼片對(duì)氧糖剝奪后DC2.4細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響 為明確水凝膠負(fù)載bFGF 對(duì)氧糖剝奪后DC2.4 細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響，課題組采用Transwell 小室，建立了DC2.4 細(xì)胞和負(fù)載bFGF 的水凝膠貼片共培養(yǎng)體系。氧糖剝奪4 h 后采用Western blot 法檢測(cè)各組DC2.4 細(xì)胞炎癥因子表達(dá)情況。結(jié)果如圖3所示，與對(duì)照組相比，氧糖剝奪4 h后DC2.4細(xì)胞中IL-1β、Nlrp3蛋白表達(dá)明顯升高（P<0.05，P<0.01），bFGF 組與負(fù)載bFGF的水凝膠組顯著降低了IL-1β 表達(dá)水平（P<0.05），bFGF 組與負(fù)載bFGF 的水凝膠組顯著降低了Nlrp3表達(dá)水平（P<0.05）。以上結(jié)果提示，負(fù)載bFGF 的水凝膠貼片可以明顯抑制氧糖剝奪后DC2.4 細(xì)胞促炎因子的表達(dá)。

圖3 DC2.4細(xì)胞炎癥因子表達(dá)Fig.3 Expressions of inflammatory factors in DC2.4 cells

2.4 負(fù)載bFGF 水凝膠貼片對(duì)氧糖剝奪后DC2.4細(xì)胞TNF-α 分泌的影響 為明確水凝膠負(fù)載bFGF對(duì)氧糖剝奪后DC2.4 細(xì)胞炎癥因子分泌的影響，課題組采用Transwell 小室，建立了DC2.4 細(xì)胞和負(fù)載bFGF的水凝膠貼片共培養(yǎng)體系。氧糖剝奪4 h后采用ELISA方法檢測(cè)各組DC2.4細(xì)胞上清中炎癥因子TNF-α 含量。結(jié)果如圖4 所示，與對(duì)照組相比，氧糖剝奪4 h 后DC2.4 細(xì)胞上清中TNF-α 含量明顯增加，負(fù)載bFGF 的水凝膠組明顯減少了細(xì)胞上清中TNF-α含量。以上結(jié)果提示，負(fù)載bFGF的水凝膠貼片可以明顯抑制氧糖剝奪后DC2.4 細(xì)胞促炎因子TNF-α的分泌。

圖4 DC2.4細(xì)胞TNF-α分泌情況Fig.4 TNF-α secretion in DC2.4 cells

2.5 水凝膠負(fù)載bFGF 對(duì)OGD 后DC2.4 細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響 為明確負(fù)載bFGF 的水凝膠對(duì)OGD 后DC2.4 細(xì)胞的保護(hù)作用。課題組檢測(cè)了OGD后細(xì)胞中SOD和LDH活力，并檢測(cè)了細(xì)胞上清中MDA 含量。結(jié)果如圖5 所示，負(fù)載1 μg bFGF 的水凝膠貼片與DC2.4 細(xì)胞共培養(yǎng)，可顯著增加OGD 4 h 后細(xì)胞SOD 活力（P<0.01），并明顯減少細(xì)胞LDH 活力（P<0.05）和細(xì)胞上清中MDA 含量（P<0.01）。以上結(jié)果說(shuō)明負(fù)載bFGF 的水凝膠貼片可以減輕氧糖剝奪對(duì)DC2.4細(xì)胞的損傷。

圖5 DC2.4細(xì)胞SOD活力，細(xì)胞上清LDH活力和MDA含量Fig.5 SOD activity in DC2.4 cells，LDH activity and MDA content in cell supernatant

3 討論

MI后大量心肌細(xì)胞死亡，誘導(dǎo)心肌組織不良重塑，包括心室壁變薄、瘢痕組織形成等，最終導(dǎo)致心力衰竭。傳統(tǒng)的冠狀動(dòng)脈搭橋手術(shù)和藥理學(xué)方法，雖然可以降低心力衰竭死亡率，但難以恢復(fù)心肌功能。近年來(lái)，包括可注射生物材料和心臟貼片在內(nèi)的各種技術(shù)已被開(kāi)發(fā)出來(lái)，以重建梗死心肌的功能［7］。

早有研究指出，bFGF的心肌內(nèi)給藥可誘導(dǎo)血管新生，改善心肌功能。但bFGF 治療方法最重要的局限性是其生物學(xué)半衰期過(guò)短，因此，需要將bFGF持續(xù)性遞送到細(xì)胞靶標(biāo)以達(dá)到預(yù)期的效果。為此，緩釋蛋白遞送系統(tǒng)提供了可行策略。本研究中利用水凝膠的高溶脹能力負(fù)載治療劑量的bFGF。由于整個(gè)負(fù)載過(guò)程是在室溫下，pH7.4 的PBS 溶液中進(jìn)行的bFGF 的活性損失可以最小化。本研究采用的載藥水凝膠貼片是由明膠制成，明膠是一種天然的，可生物降解的動(dòng)物蛋白，由膠原蛋白通過(guò)酸或堿催化的水解產(chǎn)生，廣泛用于化妝品，制藥和食品配方中［8］。負(fù)載bFGF 的明膠水凝膠已被證明可以用于鼓膜再生、改善缺血皮瓣存活率、促進(jìn)傷口愈合等［9-11］。通過(guò)檢測(cè)其細(xì)胞毒性作用，明確了本研究中制備的明膠水凝膠貼片對(duì)細(xì)胞正常生長(zhǎng)無(wú)明顯影響，安全性有一定保障，適宜用于后續(xù)體外或體內(nèi)試驗(yàn)。

使用水凝膠的一個(gè)值得關(guān)注的方面是根據(jù)預(yù)期應(yīng)用適當(dāng)調(diào)整其機(jī)械性能，這是通過(guò)實(shí)施不同的策略來(lái)實(shí)現(xiàn)的，包括酶交聯(lián)、物理交聯(lián)、化學(xué)修飾和化學(xué)交聯(lián)［12］?；瘜W(xué)交聯(lián)產(chǎn)生的共價(jià)鍵的強(qiáng)度能夠提供生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用所需的機(jī)械力，包括組織工程和藥物遞送［13］。為了使明膠水凝膠具備藥物遞送所需的機(jī)械力，本課題組使用戊二醛熏蒸的方法對(duì)其進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)。戊二醛是一種有效的雙功能交聯(lián)劑，水溶性強(qiáng)，高效且經(jīng)濟(jì)［14］。本研究也驗(yàn)證了戊二醛交聯(lián)對(duì)細(xì)胞活力的影響，結(jié)果顯示戊二醛熏蒸過(guò)后的明膠水凝膠對(duì)細(xì)胞活力無(wú)明顯抑制，具有一定的安全性。

心肌梗死后梗死區(qū)域的DCs 浸潤(rùn)顯著增加［15］。DCs 在觸發(fā)自身免疫中具有核心作用。據(jù)報(bào)道，組織損傷后，骨髓和脾前體以及循環(huán)單核細(xì)胞分化為DCs，這些細(xì)胞對(duì)炎癥部位的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生各種影響，例如引發(fā)抗原特異性免疫反應(yīng)、誘導(dǎo)耐受和慢性炎癥。研究表明，在AMI之后，DCs從骨髓遷移到缺血區(qū)，在MI 和邊界區(qū)域積累（在MI 后7 d 達(dá)到峰值），DCs相關(guān)的促炎作用與AMI后更嚴(yán)重的不良左心室重塑有關(guān)［16］。因此，調(diào)控DCs 功能可對(duì)心梗損傷修復(fù)發(fā)揮有利作用。本項(xiàng)研究，為在體外模擬心肌梗死環(huán)境，建立了OGD 細(xì)胞模型，揭示了負(fù)載bFGF 的水凝膠貼片可以明顯抑制OGD 后DCs 促炎因子的表達(dá)。

越來(lái)越多的研究證實(shí)，氧化應(yīng)激參與心肌梗死的病理進(jìn)展。氧化應(yīng)激主要表現(xiàn)為含有羥基的自由基、超氧化物、NO 等的活性氧過(guò)度積累，當(dāng)以活性氧為代表的氧化物量超過(guò)SOD 等抗氧化劑的抗氧化能力時(shí)，就會(huì)引起脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA 的氧化損傷，并伴有炎癥、肌細(xì)胞凋亡和間質(zhì)纖維化等［17-18］。本研究發(fā)現(xiàn)，負(fù)載bFGF 的水凝膠貼片可以明顯增加OGD后DC2.4細(xì)胞SOD活力，減少膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物MDA 的含量及LDH 酶活力，改善了氧化應(yīng)激反應(yīng)。因此，本載藥系統(tǒng)后續(xù)有望在心梗體內(nèi)模型中發(fā)揮調(diào)控免疫反應(yīng)的作用。

本研究目前有幾個(gè)局限性。首先，本載藥系統(tǒng)的生物相容性、降解能力等需要進(jìn)一步驗(yàn)證，同時(shí)有必要添加其他生物材料來(lái)改善其溶脹性能。此外，課題組進(jìn)行了細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，以證實(shí)負(fù)載bFGF 的水凝膠貼片對(duì)DCs 表達(dá)炎癥因子的影響，但需要使用動(dòng)物模型進(jìn)行進(jìn)一步研究。例如，將負(fù)載bFGF 的水凝膠貼片遞送至心肌梗死部位，探究其對(duì)心梗后DCs 功能和免疫微環(huán)境的調(diào)控作用。總體而言，含有bFGF 的水凝膠顯示出調(diào)控心梗后炎癥反應(yīng)的巨大前景，未來(lái)課題組將進(jìn)一步改善其性能，使其在臨床應(yīng)用中發(fā)揮作用。