毛劍琴 袁德培 張譽(yù)丹 曾楚華（湖北中醫(yī)藥大學(xué)，武漢 430000）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer′s disease，AD）俗稱老年癡呆癥，其發(fā)病癥狀呈持續(xù)性腦部神經(jīng)系統(tǒng)衰退，患者逐步出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙、記憶功能障礙及行為功能障礙，屬于癡呆癥的一種，統(tǒng)計(jì)顯示，AD患者人數(shù)占全球癡呆癥患者人數(shù)的50%～75%，且發(fā)病人數(shù)持續(xù)增長［1-2］。AD 發(fā)病隱匿、不可逆，目前臨床缺乏有效的治療方法，因此尋找具有防治AD 效果的藥物十分必要。AD 發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，一方面已知其發(fā)病與遺傳有關(guān)，另一方面睡眠障礙可能是導(dǎo)致AD 的原因之一。研究發(fā)現(xiàn)，不同程度的晝夜節(jié)律紊亂多發(fā)生于AD 患者或動(dòng)物，國外學(xué)者也指出AD 病情發(fā)展進(jìn)程與睡眠障礙相關(guān)，推測睡眠障礙可能是導(dǎo)致AD的重要病因［3-6］。中醫(yī)將AD歸于“癡呆”“善忘”一類，主治以“固本健腦”為原則［7-8］。固本健腦液是代表方劑，具有補(bǔ)腎健脾、健腦安神功效，能夠通過多靶點(diǎn)保護(hù)AD 小鼠神經(jīng)元不受損傷［9］。本實(shí)驗(yàn)以APP/PS1 雙轉(zhuǎn)基因癡呆小鼠為研究對(duì)象，觀察固本健腦液對(duì)其睡眠障礙的干預(yù)效果，并分析可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 30 只雄性SPF 級(jí)6 月齡APP/PS1 小鼠及10 只雄性SPF 級(jí)6 月齡正常小鼠均由南京生物醫(yī)藥研究院提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（蘇）2015-0001，小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，APP/PS1小鼠隨機(jī)分為模型組及實(shí)驗(yàn)組（固本健腦液低、高劑量組）。本研究經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)（HUCMS202011010），實(shí)驗(yàn)操作均符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)要求。

1.1.2 藥物及試劑 固本健腦液方劑為15 g 板橋黨參、15 g枸杞、15 g茯苓、12 g酸棗仁、12 g山楂，加入藥材6 倍量冷水浸泡30 min 后武火煎煮30 min，轉(zhuǎn)文火煎煮30 min，濾出藥液（該過程重復(fù)2 次）。將2 次濾出的藥液混勻，高溫加熱濃縮制成0.625、2.5 g/ml 藥液，低溫保存?zhèn)溆茫?0］。HE 染液（貨號(hào)：G1120，北京索萊寶科技有限公司）；尼氏染液（貨號(hào)：E607316-0100，上海生工生物工程股份有限公司）；TNF-α、IL-1β、β 樣淀粉蛋白1-42（Aβ1-42，貨號(hào)：AD20104、AD20079、AD21893）ELISA 試劑盒（武漢艾迪抗生物科技有限公司）。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 GS-15R 型離心機(jī)（美國Beckman 公司）；BIOBASE-EL10A 型酶標(biāo)儀（山東博科再生醫(yī)學(xué)有限公司）；CX23 型生物顯微鏡（日本Olympus 公司）；CytoFLEX 流式細(xì)胞儀（美國Beckman Coulter公司）。

1.2 方法

1.2.1 建模及給藥 采用多平臺(tái)水環(huán)境法建立小鼠模型，用自制睡眠剝奪箱對(duì)除對(duì)照組外的其他組進(jìn)行睡眠剝奪，剝奪時(shí)間為每天12 h，連續(xù)剝奪4 周［11］。模型組及實(shí)驗(yàn)組（固本健腦液低、高劑量組）均為APP/PS1 雙轉(zhuǎn)基因小鼠，對(duì)照組為正常小鼠。實(shí)驗(yàn)組（固本健腦液低、高劑量組）分別灌胃0.625、2.5 g/ml 固本健腦液，劑量為10 ml/（kg·d），對(duì)照組及模型組灌胃等量生理鹽水。

1.2.2 小鼠行為學(xué)檢測 采用Morris 水迷宮檢測小鼠行為，使用虛線將水迷宮水池分為4 個(gè)象限，第三象限內(nèi)放置1 個(gè)有機(jī)玻璃平臺(tái)，加水至水面超過平臺(tái)2 cm，滴加牛奶將水池染白。提起小鼠尾部將其面朝4 個(gè)象限固定位置的池壁放入水池，記錄其找到平臺(tái)所用時(shí)間（即逃避潛伏期），時(shí)間越短表示小鼠學(xué)習(xí)記憶能力越強(qiáng)（實(shí)驗(yàn)前持續(xù)訓(xùn)練小鼠5 d，第6天開始實(shí)驗(yàn)）。

1.2.3 小鼠晝夜節(jié)律檢測 觀察小鼠自主活動(dòng)時(shí)間，將小鼠置于12 h/12 h 光暗循環(huán)條件下培養(yǎng)（光照時(shí)間為早8：00 至晚8：00，黑暗時(shí)間為晚8：00 到第2 天早8：00），每3 h 記錄1 次小鼠自由活動(dòng)時(shí)間（記錄時(shí)間為3 min），記錄各組小鼠光照活動(dòng)時(shí)間、黑暗活動(dòng)時(shí)間及總自由活動(dòng)時(shí)間。

1.2.4 小鼠血清TNF-α、IL-1β 水平檢測 取小鼠尾靜脈血5 ml，3 000 r/min 離心10 min，取上清，采用ELISA 試劑盒檢測小鼠血清炎癥因子TNF-α、IL-1β水平。

1.2.5 小鼠海馬組織Aβ1-42水平檢測 處死小鼠，取出完整腦組織，分離得到海馬組織，使用PBS緩沖液制成海馬組織混懸液，4 ℃、3 000 r/min離心10 min，取上清，采用ELISA 試劑盒檢測小鼠海馬組織Aβ1-42水平。

1.2.6 小鼠海馬組織細(xì)胞凋亡水平檢測 取部分海馬組織加入胰蛋白酶消化，反復(fù)吹打制成單層細(xì)胞懸液，3 000 r/min離心10 min，棄上清，PBS緩沖液清洗2 次，Annexin X 染色，流式細(xì)胞儀、flowcytometry軟件檢測分析。

1.2.7 小鼠海馬組織病理學(xué)特征檢測 取小鼠腦部海馬組織，4%多聚甲醛固定，脫水后石蠟包埋，切5 μm片，脫蠟，HE、Nissl染色觀察病理學(xué)情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以xˉ±s 表示，單因素方差分析用于多組間比較，LSD 分析用于組間兩兩比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠逃避潛伏期時(shí)間比較 相較于對(duì)照組，模型組小鼠逃避潛伏期時(shí)間明顯延長（P<0.05）；相較于模型組，固本健腦液各劑量組小鼠逃避潛伏期時(shí)間均不同程度縮短（P<0.05，表1）。

表1 各組小鼠逃避潛伏期時(shí)間比較（，n=10）Tab.1 Comparison of latency time of escape of mice in each group（，n=10）

表1 各組小鼠逃避潛伏期時(shí)間比較（，n=10）Tab.1 Comparison of latency time of escape of mice in each group（，n=10）

Note：Compared with control group，1）P<0.05；compared with model group，2）P<0.05.

2.2 各組小鼠自由活動(dòng)時(shí)間比較 相較于對(duì)照組，模型組小鼠光照活動(dòng)時(shí)間、黑暗活動(dòng)時(shí)間及總活動(dòng)時(shí)間均明顯延長（P<0.05）；相較于模型組，固本健腦液各劑量組小鼠光照活動(dòng)時(shí)間、黑暗活動(dòng)時(shí)間及總活動(dòng)時(shí)間均不同程度縮短（P<0.05，表2）。

表2 各組小鼠自由活動(dòng)時(shí)間比較（，n=10）Tab.2 Comparison of free movement time of mice in each group（，n=10）

表2 各組小鼠自由活動(dòng)時(shí)間比較（，n=10）Tab.2 Comparison of free movement time of mice in each group（，n=10）

Note：Compared with control group，1）P<0.05；compared with model group，2）P<0.05.

2.3 各組小鼠血清TNF-α、IL-1β 水平比較 相較于對(duì)照組，模型組小鼠血清TNF-α、IL-1β 水平均明顯升高（P<0.05）；相較于模型組，固本健腦液各劑量組小鼠血清TNF-α、IL-1β 水平均不同程度降低（P<0.05，表3）。

表3 各組小鼠海馬組織TNF-α、IL-1β 水平比較（，n=10，pg/L）Tab.3 Comparison of TNF-α and IL-1β levels in hippocampal tissues of mice in each group（，n=10，pg/L）

表3 各組小鼠海馬組織TNF-α、IL-1β 水平比較（，n=10，pg/L）Tab.3 Comparison of TNF-α and IL-1β levels in hippocampal tissues of mice in each group（，n=10，pg/L）

Note：Compared with control group，1）P<0.05；compared with model group，2）P<0.05.

2.4 各組小鼠海馬組織Aβ1-42水平比較 相較于對(duì)照組，模型組小鼠海馬組織Aβ1-42水平明顯升高（P<0.05）；相較于模型組，固本健腦液各劑量組小鼠海馬組織Aβ1-42水平均不同程度降低（P<0.05，表4）。

表4 各組小鼠海馬組織Aβ1-42水平比較（，n=10）Tab.4 Comparison of Aβ1-42 level in hippocampal tissues of mice in each group（，n=10）

表4 各組小鼠海馬組織Aβ1-42水平比較（，n=10）Tab.4 Comparison of Aβ1-42 level in hippocampal tissues of mice in each group（，n=10）

Note：Compared with control group，1）P<0.05；compared with model group，2）P<0.05.

2.5 各組小鼠海馬組織細(xì)胞凋亡率比較 相較于對(duì)照組，模型組小鼠海馬組織細(xì)胞凋亡率明顯升高（P<0.05）；相較于模型組，固本健腦液各劑量組小鼠海馬組織細(xì)胞凋亡率均出現(xiàn)不同程度降低（P<0.05，表5、圖1）。

圖1 各組小鼠海馬組織細(xì)胞凋亡率比較Fig.1 Comparison of apoptosis rate in hippocampal tissues of mice in each group

表5 各組小鼠海馬組織細(xì)胞凋亡率比較（，n=10）Tab.5 Comparison of apoptosis rate in hippocampal tissues of mice in each group（，n=10）

表5 各組小鼠海馬組織細(xì)胞凋亡率比較（，n=10）Tab.5 Comparison of apoptosis rate in hippocampal tissues of mice in each group（，n=10）

Note：Compared with control group，1）P<0.05；compared with model group，2）P<0.05.

2.6 各組小鼠海馬組織病理學(xué)特征比較 對(duì)照組小鼠海馬組織神經(jīng)細(xì)胞排列整齊，形狀完整且數(shù)量較多，細(xì)胞內(nèi)尼氏體數(shù)量密集豐富；模型組小鼠海馬組織神經(jīng)細(xì)胞排列混亂，細(xì)胞體積皺縮且數(shù)量減少，細(xì)胞內(nèi)尼氏體數(shù)量減少；相較于模型組，固本健腦液各劑量組小鼠海馬組織神經(jīng)細(xì)胞及尼氏小體均明顯改善（圖2）。

圖2 各組小鼠海馬組織病理學(xué)特征比較（×400）Fig.2 Comparison of histopathological characteristics of hippocampus in each group of mice（×400）

3 討論

隨著社會(huì)老齡人口不斷增加，AD 患病率也逐漸升高，目前仍普遍認(rèn)為其發(fā)病機(jī)制為腦組織Aβ異常沉積，因此臨床可通過調(diào)節(jié)Aβ 沉積影響AD 發(fā)病進(jìn)程［10-11］。另有研究表明，睡眠是調(diào)節(jié)學(xué)習(xí)記憶和情緒的重要腦部活動(dòng)，而睡眠障礙會(huì)導(dǎo)致記憶功能減退、認(rèn)知能力降低，從而增加患AD 的可能性，且大部分AD 患者均存在不同程度的睡眠節(jié)律紊亂［12-14］。固本健腦液是具有健腦安神功效的一種方劑，早期研究提示其湯劑能夠明顯改善AD 模型小鼠睡眠障礙及學(xué)習(xí)記憶能力［15］。本研究在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步分析其作用機(jī)制。

腦組織Aβ 沉積是目前已知的AD 主要發(fā)病機(jī)制之一，研究表明通過慢性睡眠剝奪能夠促進(jìn)AD模型小鼠腦組織Aβ 沉積，進(jìn)一步損害AD 小鼠記憶功能，推測睡眠節(jié)律紊亂可能造成腦組織內(nèi)Aβ 異常沉積，促發(fā)AD［16］。AD 患者腦組織內(nèi)存在大量炎癥反應(yīng)，腦組織炎癥反應(yīng)能夠抑制神經(jīng)元新生、加速神經(jīng)元丟失，進(jìn)一步加重腦組織損傷［17］；AD 腦組織炎癥反應(yīng)主要由神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞在病理?xiàng)l件下過度激活引發(fā)［18］。以上兩種細(xì)胞被腦組織內(nèi)Aβ 等毒性物質(zhì)過度激活促進(jìn)炎癥因子表達(dá)，包括TNF-α、IL-1β 等，TNF-α、IL-1β 一方面加速神經(jīng)細(xì)胞凋亡，另一方面降低神經(jīng)細(xì)胞增殖分化能力，兩方面作用共同造成腦神經(jīng)損傷［19］。

本研究表明，與正常小鼠相比，AD 模型小鼠逃避潛伏時(shí)間、光照活動(dòng)時(shí)間、黑暗活動(dòng)時(shí)間及總活動(dòng)時(shí)間、血清TNF-α、IL-1β 水平、海馬組織Aβ1-42水平及細(xì)胞凋亡率均明顯升高，通過HE、Nissl 染色觀察其海馬組織病理情況，對(duì)照組小鼠海馬組織神經(jīng)細(xì)胞排列整齊，形狀完整且數(shù)量較多，細(xì)胞內(nèi)尼氏體數(shù)量密集豐富，而模型組小鼠海馬組織神經(jīng)細(xì)胞排列混亂，細(xì)胞體積皺縮且數(shù)量減少，細(xì)胞內(nèi)尼氏體數(shù)量減少。提示相較于正常小鼠，AD 模型小鼠睡眠節(jié)律紊亂、學(xué)習(xí)記憶能力下降、炎癥反應(yīng)加劇、海馬組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡增加且Aβ1-42含量增多，與既往研究結(jié)果相符。與AD 模型小鼠相比，固本健腦液灌胃給藥后小鼠睡眠障礙、學(xué)習(xí)記憶能力、炎癥反應(yīng)、海馬組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡水平及病理情況均明顯改善，海馬組織Aβ1-42含量比較發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組小鼠Aβ1-42含量明顯降低，推測可能由于固本健腦液抑制了AD 腦組織Aβ1-42沉積，在一定程度對(duì)AD 小鼠發(fā)揮了治療作用。

綜上，固本健腦液對(duì)APP/PS1 睡眠障礙小鼠的神經(jīng)功能具有一定保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與抑制AD 腦組織Aβ 沉積、進(jìn)一步抑制腦組織炎癥反應(yīng)及神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān)。固本健腦液對(duì)AD 患者的臨床治療作用未來還需進(jìn)一步驗(yàn)證。