張麗蓉，肖紫芬，謝宋陽，毛林芳，王 慧，陳 碩*

（1.福建省食品藥品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院，福建 福州 350001；2.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050）

喹諾酮類、林可酰胺類、硝基咪唑類等抗感染類藥物，大多屬于臨床使用的處方藥，可用于治療皮膚?。ǔ?、祛痘等）。而長期使用這些藥物可能刺激皮膚，引起接觸性皮炎，甚至對人體臟器造成一定傷害［1-2］。我國化妝品監(jiān)管現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》2015年版（簡稱《規(guī)范》）［3］及歐盟化妝品法規(guī)均明確將此類藥物列為化妝品禁用原料。受經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使，部分生產(chǎn)企業(yè)非法添加《規(guī)范》檢驗(yàn)方法監(jiān)測范圍外的其他抗感染類藥物，以規(guī)避化妝品技術(shù)規(guī)范及法律法規(guī)的監(jiān)管。為保障消費(fèi)者安全用妝，建立涵蓋藥物種類更齊全、操作更便捷高效的檢測方法尤為重要。

現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道化妝品中抗感染類藥物的檢測方法有高效液相色譜法［4-5］、高效液相色譜-質(zhì)譜法［2，6-11］、超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間高分辨質(zhì)譜法［12-13］、化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫法［14］和氣相色譜-質(zhì)譜法［15］。目前《規(guī)范》中抗感染類藥物的檢測方法有3種，包括氟康唑等9種組分檢測方法、依諾沙星等10種組分檢測方法以及化妝品中抗感染類藥物檢測方法，共涵蓋40種抗感染類藥物。檢測方法的相對分散性致使檢驗(yàn)工作重復(fù)、方法耗時(shí)、成本高，故開發(fā)一種同時(shí)測定化妝品中更多種抗感染類藥物的方法具有重要意義。本文考慮將《規(guī)范》中上述3 個(gè)方法合并，同時(shí)將臨床中常用的抗感染類藥物，如莫匹羅星、紅霉素、喹諾酮類（加替沙星、那氟沙星、司帕沙星、洛美沙星）、磺胺類（磺胺甲嘧啶、磺胺噻唑、磺胺苯酰、磺胺二甲嘧啶）、硝基呋喃類（奧硝唑、替硝唑）抗菌藥物以及近兩年國家藥監(jiān)局發(fā)布的不合格化妝品通告［16］中祛痘類產(chǎn)品檢出的西咪替丁并入篩查，以期加大監(jiān)測范圍。此外，《規(guī)范》中抗感染類藥物檢測方法存在以下問題：①磺胺類藥物經(jīng)0.5%甲酸乙腈溶液提取后，穩(wěn)定時(shí)間較短，可能導(dǎo)致定量結(jié)果不準(zhǔn)確；②克林霉素磷酸酯經(jīng)飽和氯化鈉溶液分散后提取不完全，可能造成添加量不高的樣品出現(xiàn)假陰性結(jié)果。

本文建立了測定化妝品中52 種抗感染類藥物的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）方法，針對《規(guī)范》存在的上述兩個(gè)問題進(jìn)行優(yōu)化改進(jìn)，同時(shí)增加莫匹羅星等13種有違禁添加風(fēng)險(xiǎn)的抗感染類藥物，擴(kuò)大了檢測范圍，可為化妝品中抗感染類藥物違禁添加的質(zhì)量安全監(jiān)管提供技術(shù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

UPLC-I-Class Plus 超高效液相色譜儀、Xevo TQ-S 三重四極桿質(zhì)譜儀（美國沃特世公司）；電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；超聲波清洗儀（美國IKA 公司）；高速冷凍離心機(jī)（日立Hitach 公司）；Arium Combort超純水儀（德國賽多利斯公司）。

磺胺吡啶、莫匹羅星、甲硝唑、磺胺甲二唑、鹽酸萘替芬、磺胺甲氧嗪、西咪替丁、螺內(nèi)酯、咪康唑、磺胺氯噠嗪、克拉霉素、磺胺嘧啶、酮康唑、羅紅霉素、磺胺二甲嘧啶、替硝唑、氯霉素、磺胺噻唑、磺胺苯酰均購于中國食品藥品檢定研究院，純度均大于96.0%；氧氟沙星、氟羅沙星、環(huán)丙沙星、磺胺甲唑、依諾沙星、鹽酸沙拉沙星、鹽酸雙氟沙星、鹽酸四環(huán)素、恩諾沙星、米諾環(huán)素、呋喃它酮、氟康唑、奧硝唑、土霉素、鹽酸金霉素、阿奇霉素、灰黃霉素均購于Dr.Ehrenstorfer 公司，純度均大于95.0%；磺胺甲嘧啶、聯(lián)苯芐唑、益康唑、紅霉素均購于Bepure 公司，純度均大于98.0%；鹽酸多西環(huán)素、克霉唑、林可霉素、克林霉素、克林霉素磷酸酯、培氟沙星、諾氟沙星、加替沙星、那氟沙星、司帕沙星、洛美沙星均購于CATO 公司，純度均大于97.0%；莫西沙星購于EP 公司，純度為100.0%；乙腈、甲醇（色譜純，德國默克公司）；甲酸（色譜純，阿拉?。?；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備精密稱取52種抗感染類藥物標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg，分別置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容（部分標(biāo)準(zhǔn)品用水先溶解），配制成質(zhì)量濃度約為1 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。分別精密移取各標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液適量，置于同一量瓶中，用甲醇稀釋并定容，配制成質(zhì)量濃度約為1 μg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2 基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備準(zhǔn)確稱取基質(zhì)空白樣品7份（0.2 g/份），置于15 mL離心管中，分別加入混合標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，按供試品溶液制備步驟處理，配制成質(zhì)量濃度為1～50 ng/mL的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.3 供試品溶液的制備準(zhǔn)確稱取0.2 g 樣品，置于15 mL 離心管中，加入乙腈5 mL，渦旋30 s，超聲提取30 min，搖勻，以10 000 r/min 于0 ℃冷凍離心10 min，溶液轉(zhuǎn)移至10 mL 量瓶中，加水稀釋定容，搖勻，過濾，即得。

1.2.4 色譜條件色譜柱：Waters HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相：A 相為0.1%甲酸乙腈，B 相為0.1%甲酸水；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：2 μL；流速：0.3 mL/min。梯度洗脫程序：0～3 min，2% ～15% A；3～9 min，15%～50% A；9～14 min，50%～99% A；14～17 min，99% A；17～17.5 min，99%～2% A；17.5～22 min，2% A。

1.2.5 質(zhì)譜條件離子源：電噴霧電離源（ESI），檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；毛細(xì)管電壓：3.0 kV；離子源溫度：150 ℃；脫溶劑氣溫度：500 ℃，脫溶劑氣流量：1 000 L/h；質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 52種抗感染類藥物的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS parameters of 52 anti-infective drugs

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜柱的選擇

本研究的抗感染類藥物成分多、極性差異大，因此選擇通用型反相色譜柱進(jìn)行分離，以獲得較好的色譜保留和峰形。對比了Waters HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）及Waters BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）2 款色譜柱的分離效果，發(fā)現(xiàn)兩者響應(yīng)基本一致，且均能實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)分析物的較好分離，但HSS T3 柱對極性較強(qiáng)化合物有更好的色譜保留，更適合分離極性差異大的化合物。進(jìn)一步比較了Waters HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）、Agilent ZORBAX SB-Aq（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）和CAPCELL PAK C18（2.0 mm×150 mm，2.7 μm） 3 款色譜柱的分離效果，結(jié)果顯示HSS T3 柱與CAPCELL PAK C18柱的響應(yīng)強(qiáng)于Agilent ZORBAX SB-Aq 柱，但HSS T3 柱和Agilent ZORBAX SB-Aq 柱的峰形較優(yōu)。綜合比較，最終選擇Waters HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）進(jìn)行分離測定。

2.2 流動(dòng)相的選擇

考察了常用的流動(dòng)相體系甲醇水、乙腈水對待測組分的分離情況，結(jié)果顯示乙腈水對待測組分的適用性高于甲醇水。因乙酸銨能屏蔽硅醇基，起到改善峰形的作用，且與質(zhì)譜的兼容性較好，本研究擬采用乙酸銨改善個(gè)別成分的峰形。但實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其對化合物離子化具有抑制作用，尤其對四環(huán)素類成分的離子化抑制作用較明顯，綜合考慮后選擇不加乙酸銨。在ESI+模式下，加入少量甲酸能促進(jìn)化合物電離后加氫從而增強(qiáng)響應(yīng)，因此考察了流動(dòng)相中加入不同體積分?jǐn)?shù)甲酸（0.05%、0.1%、0.2%、0.5%）時(shí)目標(biāo)分析物的分離效果。結(jié)果顯示，氯霉素的響應(yīng)在加甲酸的流動(dòng)相體系中基本不受影響，其余待測組分的響應(yīng)隨著流動(dòng)相中甲酸體積分?jǐn)?shù)的增大而增強(qiáng)，由于高濃度甲酸會損傷儀器，最終選用0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈作為流動(dòng)相。52 種抗感染類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（10 ng/mL）的總離子流圖見圖1A～E，陽性樣品的典型離子流圖見圖1F。

圖1 52種抗感染類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（A～E）及陽性樣品（F）的總離子流圖Fig.1 Total ion current chromatograms of 52 anti-infective drugs（A-E） and a positive sample（F）the peak numbers denoted were the same as those in Table 1

2.3 前處理方法的優(yōu)化

考察了分別以甲醇和乙腈作為提取溶劑時(shí)的效果，結(jié)果顯示，甲醇作為提取溶劑時(shí)起泡及乳化現(xiàn)象較明顯，而乙腈作為提取溶劑時(shí)不存在上述現(xiàn)象，且流動(dòng)相為乙腈，故選擇乙腈作為提取溶劑以降低溶劑效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，采用《規(guī)范》中的前處理方法（樣品經(jīng)飽和氯化鈉溶液渦旋后用0.5%甲酸乙腈溶液進(jìn)行提取）存在以下問題：①供試品溶液中的磺胺類藥物在酸性條件中不穩(wěn)定，6 h 后響應(yīng)值顯著下降；②克林霉素磷酸酯受脂水分配系數(shù)的影響，只有約10%進(jìn)入乙腈層，其余在飽和氯化鈉層。針對上述問題，本研究不使用飽和氯化鈉溶液分散樣品，直接使用乙腈進(jìn)行樣品提取，磺胺類藥物及克林霉素磷酸酯的回收率均能達(dá)到90%以上。

為降低基質(zhì)效應(yīng)，考察了Waters、艾杰爾等品牌的HLB固相萃取小柱（60 mg、200 mg規(guī)格）的凈化效果，發(fā)現(xiàn)西咪替丁等強(qiáng)極性成分無法保留；采用島津SHIMSEN Q 小柱進(jìn)行凈化處理時(shí)，克林霉素磷酸酯和四環(huán)素類成分損失較多，回收率低。實(shí)驗(yàn)最終采用乙腈對樣品進(jìn)行超聲提取，并在0 ℃冷凍離心后取上清液加水稀釋的前處理方法，既能沉淀蛋白和去除油脂類雜質(zhì)，又不影響回收率。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

化妝品的基質(zhì)復(fù)雜，采用乙腈進(jìn)行提取后，基質(zhì)共提取物競爭電離，從而影響待測組分的離子化程度，形成基質(zhì)效應(yīng)（ME），影響定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。ME按下式計(jì)算：ME（%）=（基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率/溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率-1）×100%［17］，當(dāng)ME為負(fù)值，說明存在基質(zhì)抑制效應(yīng)，正值為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。當(dāng)|ME|≤20%，表示存在較弱的基質(zhì)效應(yīng)；當(dāng)20%＜|ME|≤50%，表示存在中等的基質(zhì)效應(yīng)；當(dāng)|ME|＞50%，表示存在較強(qiáng)的基質(zhì)效應(yīng)。52種抗感染類藥物的ME值見表2。結(jié)合前處理考察的情況，采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線進(jìn)行定量分析以減弱基質(zhì)效應(yīng)的影響。

表2 52種抗感染類藥物的線性關(guān)系、檢出限、定量下限與基質(zhì)效應(yīng)Table 2 Linear relations，limits of detection，limits of quantitation and matrix effects of 52 anti-infective drugs

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1 線性、檢出限與定量下限按“1.2.2”方法配制3 個(gè)基質(zhì)（水劑、乳液、膏霜）標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，采用本方法進(jìn)行測定，以各藥物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行擬合。由表2 可知，52種抗感染類藥物在1～50 ng/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r）均大于0.99。取基質(zhì)效應(yīng)最大的膏霜類基質(zhì)陰性樣品，添加適量混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按供試品溶液制備同法操作，以3 倍信噪比計(jì)算檢出限（LOD），10倍信噪比計(jì)算定量下限（LOQ），得到52種抗感染類藥物的檢出限和定量下限分別為1～10 μg/kg和3～35 μg/kg。

（續(xù)表2）

2.5.2 加標(biāo)回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差取水劑、乳液、膏霜3 類基質(zhì)陰性樣品，按0.04、0.08、0.4 mg/kg 3個(gè)水平添加52種抗感染類藥物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，與供試品溶液制備同法操作，每個(gè)濃度平行實(shí)驗(yàn)3 次。52 種抗感染類藥物在水劑中的平均回收率為86.5%～116%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.2%～7.6%；乳液中的平均回收率為81.5%～116%，RSD為0.94%～9.2%；膏霜中的平均回收率為81.2%～116%，RSD為1.2%～8.9%。

2.6 樣品測定

應(yīng)用本方法對市售的50批祛痘類化妝品及50批兒童護(hù)膚類產(chǎn)品進(jìn)行測定，結(jié)果顯示1批兒童護(hù)膚類產(chǎn)品檢出咪康唑，含量為0.68 mg/kg，陽性樣品的總離子流圖見圖1F。

3 結(jié) 論

本文將《規(guī)范》中3 個(gè)抗感染類藥物測定的標(biāo)準(zhǔn)方法合并，并在此基礎(chǔ)上增加莫匹羅星等13 種臨床常用外用藥，提高了工作效率，節(jié)約了資源成本，擴(kuò)大了檢測范圍。相較于《規(guī)范》中抗感染類藥物的現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)，本方法在保證結(jié)果準(zhǔn)確的前提下，通過對前處理過程進(jìn)行優(yōu)化，有效避免了磺胺類藥物降解和克林霉素磷酸酯提取不完全的問題，同時(shí)檢出限和定量下限均低于《規(guī)范》的現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)，提高了方法靈敏度。本方法高效便捷，靈敏度高，分析范圍廣，具有良好的選擇性，可為化妝品中抗感染類藥物違禁添加的質(zhì)量安全監(jiān)管提供較好的技術(shù)支持。