劉雅婷，郭予昕，劉振強(qiáng)，劉建平，王 歡，劉 洋，戴潔蕓，王美玲*

（1.中國(guó)檢驗(yàn)認(rèn)證集團(tuán)湖南有限公司，湖南 長(zhǎng)沙 410021；2.長(zhǎng)沙海關(guān)技術(shù)中心，湖南 長(zhǎng)沙 410004）

近年來，一些不法商家為了牟取暴利和逃脫監(jiān)管，在食品中非法添加新型那非類、拉非類等磷酸二酯酶-5（PDE-5）抑制劑的結(jié)構(gòu)類似物［1-12］。這些結(jié)構(gòu)類似物通常由磷酸二酯酶-5 抑制劑的母核結(jié)構(gòu)進(jìn)行化學(xué)修飾、改變部分官能團(tuán)而得到，由于未經(jīng)國(guó)家藥品監(jiān)督管理部門批準(zhǔn)，缺乏藥理和毒性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，服用后的不良反應(yīng)難預(yù)料，嚴(yán)重危害群眾身體健康［13-14］。為加強(qiáng)食品安全監(jiān)管，打擊食品違法犯罪，國(guó)家監(jiān)管部門陸續(xù)頒布了保健食品或食品中非法添加西地那非等PDE-5抑制劑的多個(gè)補(bǔ)充檢驗(yàn)方法［15-18］，涉及100多種化合物。但現(xiàn)有檢測(cè)方法僅針對(duì)指定的化合物檢測(cè)列表進(jìn)行靶向檢測(cè)，無法對(duì)新型PDE-5抑制劑結(jié)構(gòu)類似物進(jìn)行鑒別和準(zhǔn)確定量，易產(chǎn)生漏檢和假陰性結(jié)果。市面上新型PDE-5抑制劑結(jié)構(gòu)類似物不斷出現(xiàn)，其結(jié)構(gòu)未知且缺乏標(biāo)準(zhǔn)品，急需建立快速、準(zhǔn)確的定性鑒定和定量分析方法，為食品安全監(jiān)管提供有力的技術(shù)支持。

本研究采用液相色譜-四極桿飛行時(shí)間高分辨質(zhì)譜對(duì)壓片糖果中那非類物質(zhì)進(jìn)行篩查，發(fā)現(xiàn)一種新型的伐地那非結(jié)構(gòu)類似物，推導(dǎo)出其裂解規(guī)律，通過紅外光譜、核磁共振譜進(jìn)行定性解析，最終確定該物質(zhì)為丙氧基伐地那非，并采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行定量分析。為食品中非法添加的新型PDE-5抑制劑結(jié)構(gòu)類似物的篩查、鑒定與定量分析提供了快速、準(zhǔn)確、有效的方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與材料

LC-20ADXR 高效液相色譜儀（配PAD 檢測(cè)器，日本島津公司）；LC-8A 型制備液相色譜儀（配UV檢測(cè)器，日本島津公司）；AB Triple Quad 5500 三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國(guó)SCIEX 公司）；SCIEX X500R QTOF 超高壓液相色譜/四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（美國(guó)SCIEX 公司）；Thermo Nicolet 380N 傅里葉變換紅外光譜儀（美國(guó)Thermo 公司）；核磁共振儀（德國(guó)Bruker 公司）；XS105 電子天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；KQ-500DE 超聲波清洗儀（昆山舒美公司）；渦旋振蕩器（其林貝爾儀器制造有限公司）；H1750離心機(jī)（湖南湘儀公司）。

甲醇、乙腈為色譜純（上海安譜科學(xué)儀器有限公司），其余試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為超純水（美國(guó)Millipore超純水儀制備）；那非類快速檢測(cè)試紙條（深圳市易瑞生物技術(shù)股份有限公司）；伐地那非標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（純度大于98%，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）。90種那非類藥物混標(biāo)（10 μg/mL，天津阿爾塔科技有限公司）。壓片糖果、保健酒、蜂蜜醬等購(gòu)自網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)。樣品制備：固體試樣搗碎，混勻；液體試樣，充分混勻。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

精密稱取伐地那非10 mg 于10 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至10 mL，配制成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-18 ℃保存，有效期6個(gè)月。

1.3 樣品前處理

精密稱取1 g（精確至0.001 g）樣品置于50 mL容量瓶中，加入適量甲醇超聲提取15 min，放冷至室溫，用甲醇定容，轉(zhuǎn)移至50 mL 離心管中，5 000 r/min 離心5 min，上清液經(jīng)0.22 μm 有機(jī)微孔濾膜過濾。取濾液，根據(jù)實(shí)際濃度用50%甲醇水溶液稀釋至線性范圍內(nèi)，備用。

1.4 儀器條件

1.4.1 液相色譜條件色譜柱：安捷倫ZORBAX Eclipse XDB C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：A 為甲醇，B 為1%乙酸水溶液，采用二元等度洗脫（70% A、30% B）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm；進(jìn)樣量：10 μL，柱溫：30 ℃。PAD掃描，波長(zhǎng)范圍為200～400 nm。

1.4.2 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件色譜條件：Agilent Poroshell 120 EC- C18（3.0 mm×50 mm，2.7 μm）；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：2 μL；流動(dòng)相：A 為0.1%甲酸水溶液，B 為乙腈；流速：0.2 mL/min。梯度洗脫：0.0～3.0 min，10% B；3.0～8.0 min，10%～50% B；8.0～9.0 min，50%～70% B；9.0～9.5 min，70%～90% B；9.5～11.4 min，90% B；11.4～11.5 min，90%～10% B；11.5～15 min，10% B。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI），正離子；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；電噴霧電壓（IS）：5 000 V；氣簾氣（CUR）：137.9 kPa；霧化氣（GS1）：379.2 kPa；輔助加熱氣（GS2）：413.7 kPa；碰撞氣（CAD）：55.2 kPa；離子源溫度（TEM）：500 ℃；監(jiān)測(cè)離子對(duì)：m/z503.2/151.2（定量離子對(duì)）；m/z503.2/299.1（定性離子對(duì)）。

1.4.3 液相色譜-高分辨質(zhì)譜條件色譜條件：Hypersil GOLD C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，3 μm）；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：5 μL；流速：0.2 mL/min；流動(dòng)相：A 為0.1%甲酸水溶液，B 為甲醇；流速：0.2 mL/min。梯度洗脫：0.0～1.0 min，20% B；1.0～1.5 min，20%～95% B；1.5～5.5 min，95% B；5.5～6.0 min，95%～ 20% B；6.0～9.0 min，20% B。

質(zhì)譜條件：ESI，正離子；掃描方式：TOF-MS/MS 模式；電噴霧電壓：5 500 V；氣簾氣壓力：241.3 kPa；霧化氣壓力：379.2 kPa；輔助氣壓力：379.2 kPa；離子源溫度：500 ℃。全掃描一級(jí)質(zhì)譜（MS），質(zhì)量采集范圍為100～1 000 Da；全掃描二級(jí)質(zhì)譜（MS/MS），質(zhì)量采集范圍為50～600 Da。

2 結(jié)果與討論

2.1 定性測(cè)定

2.1.1 那非類快檢試劑盒測(cè)定按照快檢試劑盒的操作步驟對(duì)壓片糖果樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果呈陽性，表明樣品中可能含有那非類物質(zhì)。

2.1.2 液相色譜測(cè)定將壓片糖果按“1.4.1”色譜條件進(jìn)行定性分析，發(fā)現(xiàn)色譜圖中8.54 min 處出現(xiàn)1 個(gè)色譜峰（見圖1A），其保留時(shí)間與伐地那非標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)相近。在200～400 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)，該色譜峰的光譜圖與伐地那非標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的光譜圖一致，在226 nm處均有最大吸收（見圖1B）。因此推測(cè)該壓片糖果中可能含有伐地那非結(jié)構(gòu)類似物。

圖1 壓片糖果中未知化合物的色譜圖（A），以及未知化合物與伐地那非標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的光譜圖比較（B）Fig.1 Chromatogram of the unknown compound in a pressed candy（A），UV spectra of the unknown compound and vardenafil standard（B）

2.1.3 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定將樣品按照BJS 201805《食品中那非類物質(zhì)的測(cè)定》［18］進(jìn)行前處理后，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行定性測(cè)定，結(jié)果未檢出標(biāo)準(zhǔn)方法涵蓋的90種那非類物質(zhì)。但在MRM提取離子流色譜圖中新出現(xiàn)1 個(gè)色譜峰，其保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)方法中伐地那非N-氧化物和丙氧苯基艾地那非均不同，但同時(shí)具有兩者的特征監(jiān)測(cè)離子對(duì)m/z505.2/151.1（伐地那非N-氧化物）和m/z503.2/283.2（丙氧苯基艾地那非），m/z503.2 與m/z505.2 相差2 amu，可能是同位素峰，從而推測(cè)該化合物可能為那非類結(jié)構(gòu)類似物。

2.1.4 高分辨質(zhì)譜篩查按照“1.4.3”條件進(jìn)行定性篩查，在壓片糖果樣品總離子流色譜圖的6.531 min 處出現(xiàn)1 個(gè)色譜峰（見圖2A），其準(zhǔn)分子離子峰為m/z503.234 9（［M+H］+），推測(cè)該化合物的分子式為C24H34N6O4S，與伐地那非的準(zhǔn)分子離子峰m/z489.219 9（［M+H］+）相差14.015 0 amu，可能多1個(gè)CH2基團(tuán)。二級(jí)質(zhì)譜掃描中主要的特征碎片離子為m/z391.135 9、376.108 4、326.177 7、299.118 1、284.130 0、151.088 6（圖2B）。其中m/z299.118 1、m/z284.130 0、m/z151.088 6均與伐地那非的特征碎片離子相同，而m/z391.135 9、m/z326.177 7 均比伐地那非的特征碎片離子m/z377.124 8、m/z312.161 0 大14 amu，說明該化合物具有伐地那非的母核結(jié)構(gòu)，而取代基略有不同，可能多1 個(gè)CH2基團(tuán)。結(jié)合伐地那非的結(jié)構(gòu)和裂解規(guī)律［19-20］，推測(cè)該化合物可能為伐地那非苯環(huán)上的乙氧基被丙氧基代替，其裂解途徑如圖3所示。

圖2 樣品中未知化合物的色譜圖（A）和二級(jí)碎片離子質(zhì)譜圖（B）Fig.2 Chromatogram（A） and secondary fragment MS spectrum（B） of the unknown compound in a sample

圖3 未知化合物的質(zhì)譜裂解途徑Fig.3 MS fragment pathway of unknown compound

2.1.5 分離純化目標(biāo)化合物稱取約25 g 樣品于500 mL 錐形瓶中，加入100 mL 甲醇，超聲提取15 min，5 000 r/min 離心5 min，上層清液過濾。取濾液，重復(fù)提取2 次，濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至約10 mL，采用制備色譜純化，色譜條件為甲醇-1%乙酸水溶液（70∶30）；檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm，流速為10 mL/min。收集主色譜峰成分，減壓蒸發(fā)除去溶劑后冷凍干燥，即得純化目標(biāo)化合物（約100 mg）。

稱取純化后的目標(biāo)化合物20 mg 置于50 mL 容量瓶中，加甲醇超聲溶解，稀釋至刻度并混合均勻，即得測(cè)試溶液。將測(cè)試溶液按“1.4.1”條件測(cè)定，檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm，采用峰面積歸一化法進(jìn)行定量分析，得到純度為98.0%。

2.1.6 紅外光譜鑒定取“2.1.5”純化樣品進(jìn)行紅外光譜測(cè)定，光譜圖顯示含有仲氨基、苯環(huán)、甲基、亞甲基、羰基、咪唑環(huán)、碳氮雙鍵、砜基、碳氮單鍵和碳氧單鍵等官能團(tuán)的特征吸收峰。具體如下：①仲氨基的氮?dú)渖炜s振動(dòng)吸收峰（3 181、3 119 cm-1）；②苯環(huán)的碳?xì)渖炜s振動(dòng)和面外彎曲振動(dòng)吸收峰（3 076、824、772、737、729 cm-1）；③甲基和亞甲基的碳?xì)渖炜s振動(dòng)和彎曲振動(dòng)吸收峰（2 963、2 879、2 851、2 816、1 485、1 462、1 456、1 383 cm-1）；④羰基的特征吸收峰（1 692 cm-1）；⑤苯環(huán)和咪唑環(huán)的骨架伸縮振動(dòng)吸收峰、碳氮雙鍵伸縮振動(dòng)吸收峰（1 622、1 597 cm-1）；⑥砜基的特征吸收峰、碳氮單鍵和碳氧單鍵的伸縮振動(dòng)吸收峰（1 350、1 325、1 306、1 275、1 171、1 146、1 117 cm-1）。因此，樣品中的未知化合物與伐地那非具有相似的特征官能團(tuán)。

2.1.7 核磁共振譜圖及結(jié)構(gòu)確證取“2.1.5”純化樣品，以DMSO-D6為溶劑，測(cè)試核磁共振氫譜（1H NMR）、碳-13 核磁共振譜（13C NMR）、無畸變極化轉(zhuǎn)移譜（DEPT135）、同核位移相關(guān)譜（COSY）、異核單量子相關(guān)譜（HSQC）和異核多鍵相關(guān)譜（HMBC）（見圖4）。1H NMR、COSY 譜數(shù)據(jù)和13C NMR、DEPT135、HSQC、HMBC 譜數(shù)據(jù)分別見表1 和表2。1H NMR 譜顯示34 個(gè)質(zhì)子信號(hào)；其中1 個(gè)活潑氫、4 個(gè)甲基、9 個(gè)亞甲基和1 個(gè)1，2，4-三取代苯環(huán)的質(zhì)子信號(hào)。13C NMR 譜顯示22 根碳譜線，哌嗪環(huán)結(jié)構(gòu)對(duì)稱，2 對(duì)碳信號(hào)兩兩重疊，與質(zhì)譜分析所得分子式（C24H34N6O4S）一致，比較1H NMR 譜和1H NMR（+D2O）譜發(fā)現(xiàn)，活潑氫信號(hào)明顯減弱至消失，歸屬為仲氨基的質(zhì)子信號(hào)。通過1H NMR 譜、13C NMR 譜和DEPT135 譜，確定了4 個(gè)甲基、9 個(gè)亞甲基和1 個(gè)1，2，4-三取代苯環(huán)。結(jié)合HMBC 譜、HSQC 譜和COSY 譜可以確定相連的體系。綜合質(zhì)譜、紅外光譜和核磁共振譜結(jié)果，確定該化合物為丙氧基伐地那非，由伐地那非苯環(huán)上的乙氧基被丙氧基代替而得到，其結(jié)構(gòu)式見圖5。

表1 未知化合物的核磁共振1H NMR與COSY譜數(shù)據(jù)Table 1 1H NMR and COSY data of the unknown compound

表2 未知化合物的核磁共振13C NMR、DEPT135、HSQC與HMBC譜數(shù)據(jù)Table 2 13C NMR，DEPT135，HSQC and HMBC data of the unknown compound

（續(xù)表2）

圖4 未知化合物的1H NMR譜（A）與13C NMR譜（B）Fig.4 1H NMR（A） and 13C NMR（B） spectra of unknown compound

圖5 丙氧基伐地那非的結(jié)構(gòu)Fig.5 Structure of O-propylvardenafil

2.2 定量分析

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制精密稱取丙氧基伐地那非10 mg于10 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至10 mL，配制成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。準(zhǔn)確吸取丙氧基伐地那非儲(chǔ)備液適量，用50%甲醇水溶液稀釋，搖勻，配制成質(zhì)量濃度依次為1、2、4、6、8、10、20、40、60、80、100 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。

2.2.2 線性關(guān)系、檢出限與定量下限取“2.2.1”標(biāo)準(zhǔn)工作液，按照“1.3”和“1.4.2”方法分別進(jìn)行前處理和上機(jī)測(cè)定，采用外標(biāo)法定量，以目標(biāo)化合物的峰面積（y）對(duì)質(zhì)量濃度（x）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。目標(biāo)化合物在1.0～100 ng/mL 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性方程為y=12 606.33x-504.97，相關(guān)系數(shù)（r2）為0.999 2。以3 倍信噪比（S/N≥3）對(duì)應(yīng)的空白樣品添加質(zhì)量濃度作為方法的檢出限（LOD），以10倍信噪比（S/N≥10）對(duì)應(yīng)的空白樣品添加質(zhì)量濃度作為方法的定量下限（LOQ），得到丙氧基伐地那非的檢出限為0.02 mg/kg，定量下限為0.05 mg/kg。

2.2.3 基質(zhì)效應(yīng)采用提取后添加法評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)（ME）的影響，將空白樣品基質(zhì)提取液用50%甲醇水溶液稀釋不同倍數(shù)（10、20、50、100倍）后配制20 ng/mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定。按下式計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)：ME（%）=（Aae-As）/As×100%，式中Aae為樣品基質(zhì)溶液中化合物的峰面積平均值；As為標(biāo)準(zhǔn)溶液中化合物的峰面積平均值。ME 的絕對(duì)值隨著基質(zhì)效應(yīng)的增強(qiáng)而變大，ME 為正值說明存在基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，負(fù)值則為基質(zhì)抑制效應(yīng)。當(dāng)ME絕對(duì)值＜20%時(shí)表示基質(zhì)效應(yīng)較弱，ME絕對(duì)值在20%～50%范圍內(nèi)時(shí)表示具有中等強(qiáng)度基質(zhì)效應(yīng)，ME絕對(duì)值大于50%時(shí)表示基質(zhì)效應(yīng)較強(qiáng)。

結(jié)果表明，保健酒和蜂蜜醬的ME 在±20%之間，基質(zhì)效應(yīng)較小。壓片糖果有一定的基質(zhì)效應(yīng)，當(dāng)采用50%甲醇水溶液將空白基質(zhì)稀釋50倍后，基質(zhì)效應(yīng)有所減弱。因此，陽性樣品在前處理中增加稀釋過程，以降低基質(zhì)效應(yīng)的影響。根據(jù)需要可采用空白基質(zhì)提取液配制適當(dāng)濃度的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行定量。

2.2.4 回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在壓片糖果、保健酒和蜂蜜醬3種空白基質(zhì)樣品中，添加低、中、高3 個(gè)濃度水平的丙氧基伐地那非，分別制成0.05、0.1、0.5 mg/kg 的樣品，每個(gè)濃度做6 次平行實(shí)驗(yàn)，考察方法的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。表3 結(jié)果顯示，不同加標(biāo)水平下的平均回收率為76.5%～104%，RSD為1.6%～5.1%，滿足分析要求。

表3 食品中丙氧基伐地那非的平均加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Table 3 Average recoveries and relative standard deviations of O-propylvardenafil in foods（n=6）

2.3 實(shí)際樣品測(cè)定

采用本方法對(duì)網(wǎng)購(gòu)的100 批次樣品進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，有5 批次糖果（含人參牡蠣壓片糖果和人參糖）檢出丙氧基伐地那非，含量為510～3.23×104mg/kg；3批次養(yǎng)生保健酒檢出丙氧基伐地那非，含量為180～730 mg/kg。

3 結(jié) 論

本研究建立了一種快速、靈敏、準(zhǔn)確的篩查和鑒定PDE-5抑制劑新型結(jié)構(gòu)類似物的方法。通過高效液相色譜篩查、高分辨質(zhì)譜初步推測(cè)、紅外光譜和核磁共振進(jìn)一步確證，發(fā)現(xiàn)并鑒定了一種新型的非法添加物丙氧基伐地那非。該化合物在國(guó)內(nèi)未見報(bào)道，尚無相關(guān)檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，課題組目前已申請(qǐng)?jiān)摶衔锏腃AS號(hào)登記，并進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制，為打擊食品違法犯罪提供了技術(shù)支撐。