徐 睿，鐘品菲，周昌園，胡雪黎，袁小鹿，胡澤華，張淇淞，楊 寶*

（1.風(fēng)濕性疾病發(fā)生與干預(yù)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（湖北民族大學(xué)），湖北 恩施 445000；2.湖北民族大學(xué) 武陵山中藥材檢驗(yàn)檢測中心，湖北 恩施 445000；3.湖北民族大學(xué) 醫(yī)學(xué)部，湖北 恩施 445000；4.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006；5.廣西大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，廣西 南寧 530004）

細(xì)胞是生物體結(jié)構(gòu)和功能的基本單位，在生命活動(dòng)中扮演了重要角色。細(xì)胞代謝組學(xué)能夠針對性地研究藥物對單細(xì)胞或單細(xì)胞株的代謝調(diào)控過程，直觀反映藥物刺激后的影響，與藥物作用機(jī)制研究更加契合，且與機(jī)體整體水平的代謝組學(xué)相比受干擾更小。應(yīng)用代謝組學(xué)技術(shù)研究藥物作用于細(xì)胞后代謝譜的變化，對于體外研究藥物的作用機(jī)制具有重要意義。竹節(jié)參來源于五加科植物竹節(jié)參Panax japonicusC.A.Mey.的根莖，能夠散瘀止血、祛痰止咳、補(bǔ)虛強(qiáng)壯、消腫止痛［1］。竹節(jié)參收載于《中國藥典》，恩施地區(qū)的資源豐富，土家族民間醫(yī)生常用其治療心腦血管疾病，療效顯著［2-3］。竹節(jié)參富含三萜皂苷，總皂苷是其改善糖脂代謝的活性物質(zhì)［4］。肝臟是機(jī)體脂質(zhì)代謝的場所，HepG2 細(xì)胞與正常肝細(xì)胞的代謝功能較為接近，目前HepG2細(xì)胞脂質(zhì)沉積模型廣泛應(yīng)用于降脂藥物的體外活性篩選及分子機(jī)制研究，并為后續(xù)的體內(nèi)研究提供參考依據(jù)。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，竹節(jié)參總皂苷可以顯著抑制HepG2細(xì)胞脂質(zhì)沉積模型的甘油三酯合成，減少細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)累積，表現(xiàn)出較好的體外降脂活性［5］。目前未有文獻(xiàn)從細(xì)胞代謝角度研究竹節(jié)參總皂苷改善HepG2細(xì)胞脂質(zhì)代謝的作用機(jī)制。

本研究采用改良的Bligh-Dyer法提取HepG2細(xì)胞內(nèi)源性代謝物，基于超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLC-Q/TOF MS）技術(shù)和多元統(tǒng)計(jì)分析篩選差異代謝物，并結(jié)合通路分析初步闡明了竹節(jié)參總皂苷改善HepG2細(xì)胞脂質(zhì)代謝的機(jī)制。本研究有望在細(xì)胞代謝水平上更加深入地闡述竹節(jié)參總皂苷的降脂作用機(jī)制，為后續(xù)的體內(nèi)降脂作用機(jī)制研究和新藥開發(fā)提供參考資料，同時(shí)也為其他降脂中藥的研究提供思路。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 藥品與試劑

甘油三酯（TG）試劑盒（南京建成生物制品研究所）；胎牛血清、高糖DMEM 培養(yǎng)基、磷酸鹽（PBS）緩沖液、牛血清白蛋白、0.25%胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素（Gibco 公司）；油酸鈉、棕櫚酸鈉（生工生物工程有限公司）；油紅O染色液（Sigma公司）；甲醇、乙腈、異丙醇、二氯甲烷（質(zhì)譜級，默克公司）。竹節(jié)參總皂苷為自制，采用紫外-可見分光光度法測得其皂苷含量為84.1%。HepG2 細(xì)胞購自ATCC 細(xì)胞庫。

1.2 儀 器

ACQUITY UPLC I-Class 色譜儀、Xevo G2-XS Q-TOF 高分辨質(zhì)譜儀、Progenesis QI 軟件（沃特世公司）；Eppendorf 真空離心濃縮儀（德國艾本德公司）；多功能酶標(biāo)儀（賽默飛世爾科技公司）；熒光倒置顯微鏡（麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)公司）。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)、分組及處理

HepG2 細(xì)胞用含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的高糖DMEM 培養(yǎng)基，在5% CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)，生長至鋪滿瓶底80%左右時(shí)棄去培養(yǎng)液，加入0.25%的胰酶消化液消化，每3 天按1∶3 比例傳代1 次，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞混懸液接種于6 孔板，分為對照組（Control）、模型組（Model）、竹節(jié)參總皂苷組（PJTS，50 mg/L），模型組、竹節(jié)參總皂苷組另加入1 mmol/L 的油酸和棕櫚酸混合液（2∶1，體積比）刺激24 h，竹節(jié)參總皂苷組再加藥物培養(yǎng)24 h。棄去培養(yǎng)液后用4%多聚甲醛固定30 min，處理后進(jìn)行油紅O染色分析。另收集各組細(xì)胞，檢測TG含量。

1.4 樣品收集與處理

按“1.3”方法處理細(xì)胞，每組平行12份，培養(yǎng)結(jié)束時(shí)棄去培養(yǎng)液，用PBS緩沖液清洗2次，然后采用液氮迅速淬滅細(xì)胞。加入500 μL 甲醇-水（4∶1，體積比），刮下細(xì)胞并轉(zhuǎn)移至離心管中，重復(fù)2次。低溫真空濃縮干燥，殘?jiān)屑尤?00 μL甲醇-水（2∶1）和400 μL二氯甲烷，冰浴超聲5 min。13 000 r/min 離心15 min，分別吸取上層（極性部位）和下層（非極性部位）溶液，低溫真空濃縮干燥。上層加入100 μL 乙腈-水（3∶1，體積比）溶解，下層加入600 μL 異丙醇-乙腈-水（2∶1∶1，體積比）溶解，13 000 r/min離心15 min，取上清液進(jìn)樣分析。質(zhì)控樣品由各樣本吸取30 μL混合得到。

1.5 色譜與質(zhì)譜條件

Acquity HSS T3 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）。非極性部位：乙腈/水（3∶2，A）-異丙醇/乙腈（9∶1，B）（正模式：均含0.1%甲酸和10 mmol/L 甲酸銨；負(fù)模式：均含0.01%甲酸），洗脫程序?yàn)椋?.0～3.5 min，65%～57% A；3.5～3.6 min，57%～48% A；3.6～11.0 min，48%～30% A；11.0～17.5 min，30%～1% A；進(jìn)樣量為6 μL。極性部位：乙腈（A）-水（B）（正模式：均含0.1%甲酸；負(fù)模式：均含0.01%甲酸），洗脫程序?yàn)椋?.0～4.0 min，2% A；4.0～7.0 min，2%～8% A；7.0～13.0 min，8%～30% A；13.0～20.0 min，30%～100% A；進(jìn)樣量為7 μL。流速為0.4 mL?min-1，柱溫為40 ℃。

Xevo G2-XS Q-TOF 高分辨質(zhì)譜儀，配備電噴霧電離源，源溫度為110 ℃，毛細(xì)管電壓為3.0 kV（-3.0 kV），錐孔電壓為40 V（-40 V），脫溶劑氣為900 L?h-1，溫度為550 ℃，錐孔氣為50 L?h-1，掃描范圍m/z50～1 200，亮氨酸腦啡肽實(shí)時(shí)校正，全信息串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集模式。

1.6 數(shù)據(jù)處理及生物標(biāo)志物篩選

采用Progenesis QI 軟件進(jìn)行峰識別、峰提取、歸一化，然后將數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P 軟件中進(jìn)行主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA），根據(jù)差異變化倍數(shù)（≥1.50或≤0.67）、t檢驗(yàn)（P＜0.05）、變量投影重要性指標(biāo)（VIP≥1.0）篩選差異代謝物，使用MetaboAnalyst軟件進(jìn)行代謝通路分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 竹節(jié)參總皂苷對HepG2細(xì)胞脂質(zhì)沉積模型脂質(zhì)代謝的影響

如圖1所示，與對照組相比，模型組細(xì)胞內(nèi)的紅色脂滴顯著增多，出現(xiàn)脂質(zhì)沉積現(xiàn)象，TG 顯著升高（P＜0.01），提示誘導(dǎo)脂質(zhì)沉積模型成功。與模型組相比，竹節(jié)參總皂苷組細(xì)胞內(nèi)的紅色脂滴顯著減少，TG顯著降低（P＜0.01），提示竹節(jié)參總皂苷顯著改善了HepG2細(xì)胞脂質(zhì)沉積模型的脂質(zhì)代謝。

圖1 對照組（A）、模型組（B）、竹節(jié)參總皂苷組（C）細(xì)胞的油紅O染色圖及對TG水平的影響（D）Fig.1 Oil red O staining of HepG2 cells in control（A），model（B） and PJTS（C） groups，and effect of PJTS on TG level（D）

2.2 典型基峰色譜圖

質(zhì)控樣品極性和非極性部位的基峰色譜圖如圖2所示，色譜峰的數(shù)目較豐富，分離度和響應(yīng)較好。經(jīng)過降噪、峰識別、峰提取等處理后，最終導(dǎo)出的數(shù)據(jù)矩陣結(jié)果顯示，極性部位在正離子模式下檢測到7 171個(gè)色譜峰，負(fù)離子模式下檢測到3 394個(gè)色譜峰；非極性部位在正離子模式下檢測到1 959個(gè)色譜峰，負(fù)離子模式下檢測到3 747個(gè)色譜峰。本研究在Bligh-Dyer法的基礎(chǔ)上考察了不同體積比的二氯甲烷-甲醇-水作為提取溶劑、冰浴超聲5 min或凍融循環(huán)3次的提取效率，以代謝特征峰數(shù)目、峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為評價(jià)指標(biāo)，優(yōu)選最佳的樣本處理方法。結(jié)果顯示，二氯甲烷-甲醇-水（2∶2∶1）冰浴超聲5 min的提取效果最好，代謝物的種類交叉較少，特征峰數(shù)最多，重復(fù)樣本的90%以上特征峰峰面積的RSD 小于15%。針對脂質(zhì)同分異構(gòu)體較多、保留時(shí)間較接近，普通色譜條件分離難度較大的特點(diǎn)，本研究在分析包含脂質(zhì)的非極性部位時(shí)選擇乙腈/水（3∶2）-異丙醇/乙腈（9∶1）流動(dòng)相體系［6］，并優(yōu)化了梯度洗脫程序，結(jié)果顯示不同類型的脂質(zhì)依次被洗脫，分離度和響應(yīng)較好（圖2）。在經(jīng)典的脂質(zhì)分析色譜條件中，ESI 負(fù)離子模式下流動(dòng)相中會添加10 mmol/L 甲酸銨［6］。但本課題組在前期的多批次脂質(zhì)分析實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，ESI負(fù)離子模式下流動(dòng)相中添加10 mmol/L 甲酸銨會嚴(yán)重抑制部分脂質(zhì)的響應(yīng)。因此本研究最終改為添加0.01%甲酸，在保證響應(yīng)的同時(shí)兼顧了峰形和分離度。

圖2 極性（A、B）和非極性部位（C、D）質(zhì)控樣品的基峰色譜圖Fig.2 Representative base peak chromatograms for the polar（A，B） and nonpolar（C，D） fraction of QC sample A，C：positive mode；B，D：negative mode

2.3 方法可靠性評估

PCA分析得分圖（圖3）中質(zhì)控樣本（n=12）聚集良好，均在標(biāo)準(zhǔn)偏差的2倍范圍內(nèi)。經(jīng)過降噪、峰識別、峰提取等處理后，導(dǎo)出的數(shù)據(jù)矩陣結(jié)果顯示，質(zhì)控樣本極性部位在正、負(fù)離子模式下峰面積的RSD 小于15%的色譜峰分別占87%和88%，非極性部位在正、負(fù)離子模式下峰面積RSD 小于15%的色譜峰分別占86%和89%，所有變量保留時(shí)間的RSD 均小于2.0%，表明儀器和樣品的穩(wěn)定性及重復(fù)性良好，所得數(shù)據(jù)可靠。

圖3 4組極性（A、D）和非極性部位（G、J）的PCA得分圖，模型組和竹節(jié)參總皂苷組極性（B、C、E、F）和非極性部位（H、I、K、L）的OPLS-DA得分圖和200次置換檢驗(yàn)圖Fig.3 PCA score plots for the polar（A，D） and nonpolar fraction（G，J） of 4 groups，OPLS-DA score plots and 200 times permutation test for the polar（B，C，E，F(xiàn)） and nonpolar fraction（H，I，K，L） of model and PJTS groups A，B，C，G，H，I：positive mode；D，E，F(xiàn)，J，K，L：negative mode

2.4 代謝輪廓分析

采用PCA 模型進(jìn)行代謝輪廓分析，如圖3A、D、G、J 所示，3 組各自聚為一類且完全分離，所有樣本均處于95%置信區(qū)間內(nèi)。對照組和模型組分別位于得分圖兩側(cè)，提示造模較為成功。竹節(jié)參總皂苷位于對照組和模型組之間，且有向?qū)φ战M靠近的趨勢，表明竹節(jié)參總皂苷改善脂質(zhì)代謝作用顯著。

2.5 差異代謝物篩選與鑒定

為更好地獲取組間差異信息、篩選差異代謝物，在PCA分析的基礎(chǔ)上進(jìn)行OPLS-DA分析，部分結(jié)果見圖3B、E、H、K。所有模型的R2Y（cum）≥0.992、Q2（cum）≥0.971，表現(xiàn)出良好的擬合度和預(yù)測能力。200 次置換檢驗(yàn)結(jié)果（圖3C、F、I、L）顯示，所有模型R2的截距≤0.713、Q2的截距≤-0.416，表明模型未過擬合，然后輸出各變量的VIP值。根據(jù)峰面積差異變化倍數(shù)（Fold）和t檢驗(yàn)P值構(gòu)建火山圖（圖4），篩選出Fold≥1.50或≤0.67、P＜0.05的代謝物，結(jié)合VIP≥1.0確定差異代謝物?；诒Ａ魰r(shí)間、精確分子量、二級碎片鑒定差異代謝物，結(jié)果見表1 和表2。從極性部位鑒定出34 個(gè)差異代謝物，主要為脂肪酸、氨基酸類成分；從非極性部位鑒定出28 個(gè)差異代謝物，主要為磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、神經(jīng)酰胺。為了直觀比較上述差異代謝物在各組中的變化，將其相對峰面積轉(zhuǎn)化為可視化熱圖，并進(jìn)行聚類分析。結(jié)果見圖5，紅色代表高濃度，藍(lán)色代表低濃度，竹節(jié)參總皂苷顯著恢復(fù)HepG2 細(xì)胞脂質(zhì)沉積模型中紊亂代謝物的水平，且有向?qū)φ战M水平接近的趨勢。聚類分析顯示，極性部分代謝物（圖5A）被劃分為兩大類群，分別包含14 種和20 種代謝物；非極性部分代謝物（圖5B）被劃分為三大類群，分別包含3、17、8種代謝物。每個(gè)類群中的代謝物在對照組、模型組、竹節(jié)參總皂苷組中的變化趨勢基本一致，表明篩選出的代謝物具有代表性。

表1 極性部位中鑒定的差異代謝物信息Table 1 Specific informations of biomarkers in polar fraction

表2 非極性部位中鑒定的差異代謝物信息Table 2 Specific informations of biomarkers in nonpolar fraction

圖4 極性（A、B、C、D）和非極性（E、F、G、H）部位代謝物的火山圖Fig.4 Volcano plots for metabolites in polar（A，B，C，D） and nonpolar（E，F(xiàn)，G，H） fractions

圖5 極性（A）和非極性（B）部位中差異代謝物相對峰面積的熱圖及聚類分析Fig.5 Heatmap and cluster analysis of the metabolites in polar（A） and nonpolar（B） fractions

2.6 代謝通路分析

采用MetaboAnalyst 進(jìn)行通路富集分析，以通路影響值＞0.1 作為目標(biāo)。結(jié)果表明，竹節(jié)參總皂苷改善HepG2細(xì)胞脂質(zhì)沉積模型脂質(zhì)代謝的作用與調(diào)節(jié)鞘脂代謝、甘油磷脂代謝、不飽和脂肪酸合成密切相關(guān)。

鞘脂是鞘氨醇的衍生物，主要分為鞘磷脂和鞘糖脂。鞘脂代謝是肝臟細(xì)胞內(nèi)重要的脂質(zhì)代謝途徑，其代謝異常與多種慢性疾病密切相關(guān)［7］。鞘脂作為細(xì)胞器和細(xì)胞膜的基本組分，在肝臟細(xì)胞中的含量和種類豐富，在細(xì)胞膜的形成、物質(zhì)交換、信號傳導(dǎo)等方面發(fā)揮著重要作用［7-8］。神經(jīng)酰胺是鞘脂代謝的中心分子，發(fā)揮著第二信使作用，介導(dǎo)了細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)和胰島素抵抗等，參與肝臟脂質(zhì)代謝的多個(gè)環(huán)節(jié)［9-10］。神經(jīng)酰胺也是肝臟脂質(zhì)代謝異常相關(guān)疾病的重要介導(dǎo)因素［11］。鞘磷脂是神經(jīng)酰胺頭部連接一個(gè)磷酸膽堿的代謝產(chǎn)物，在維持肝臟脂質(zhì)代謝，尤其是神經(jīng)酰胺代謝平衡中發(fā)揮著重要作用。本研究中植物鞘氨醇、SM（d18∶0/16∶0）、Cer（d18∶1/18∶0）在模型組中的水平顯著升高，SM（d17∶1/16∶1）、Cer（d18∶0/26∶0）的水平顯著降低，在竹節(jié)參總皂苷干預(yù)后均有恢復(fù)至正常水平的趨勢（表2和圖5），其中Cer（d18∶1/18∶0）的變化趨勢與文獻(xiàn)［12］報(bào)道一致，提示竹節(jié)參總皂苷改善HepG2細(xì)胞脂質(zhì)沉積模型脂質(zhì)代謝的作用與調(diào)節(jié)鞘脂代謝密切相關(guān)。

甘油磷脂是細(xì)胞膜不可缺少的組成構(gòu)架，也是細(xì)胞進(jìn)行物質(zhì)交換的通道，在調(diào)節(jié)細(xì)胞功能、維持脂質(zhì)代謝平衡中扮演著重要角色［13］。本研究中篩選的甘油磷脂類代謝物主要為磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺。磷脂酰膽堿是機(jī)體內(nèi)最豐富的甘油磷脂，其特性由所含的脂肪酸種類決定，在細(xì)胞膜中起保護(hù)層作用，同時(shí)也與鞘磷脂一起形成了不同大小、密度的脂蛋白，對膽固醇的代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)起重要作用［14］。本研究中模型組PC（18∶3-OH/2∶0）、PC（17∶2/0∶0）、PC（22∶6/18∶2）、PC（20∶4/15∶0）、PC（22∶6-2OH/15∶0）的水平顯著上調(diào)，PC（14∶0/14∶0）和PC（16∶1/14∶0）的水平顯著下調(diào)，除PC（14∶0/14∶0）、PC（16∶1/14∶0）外，其余5 個(gè)在竹節(jié)參總皂苷干預(yù)后均有恢復(fù)至正常水平的趨勢（表2 和圖5）。分析上述磷脂酰膽堿的結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，在模型組中顯著上調(diào)的磷脂酰膽堿均含多不飽和脂肪酸側(cè)鏈，對細(xì)胞脂質(zhì)代謝具有較好的保護(hù)作用，推測可能是HepG2 細(xì)胞為了應(yīng)對脂質(zhì)沉積損傷的自身調(diào)節(jié)結(jié)果。溶血磷脂酰膽堿和溶血磷脂酰乙醇胺與細(xì)胞炎癥過程和免疫反應(yīng)密切相關(guān)，同時(shí)還會誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［15-16］。本研究中模型組LysoPC（18∶2/0∶0）、LysoPE（18∶2/0∶0）、LysoPE（20∶5/0∶0）的水平顯著上調(diào)，在竹節(jié)參總皂苷干預(yù)后均有恢復(fù)至正常水平的趨勢，推測竹節(jié)參總皂苷在調(diào)節(jié)HepG2細(xì)胞脂質(zhì)沉積模型脂質(zhì)代謝的同時(shí)還能改善其炎癥反應(yīng)。

本研究還篩選到11個(gè)不飽和脂肪酸、5個(gè)飽和脂肪酸（表1和2）。除十五碳二烯酸、硬脂酸、二十烷酸外，其余13個(gè)脂肪酸在模型組中的水平顯著上調(diào)，在竹節(jié)參總皂苷干預(yù)后均有恢復(fù)至正常水平的趨勢（表1和2、圖5）。模型組中16個(gè)脂肪酸的總含量較對照組顯著升高，在竹節(jié)參總皂苷干預(yù)后顯著降低。脂肪酸整體代謝水平升高是油酸和棕櫚酸誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞脂質(zhì)沉積模型的重要特點(diǎn)，提示下調(diào)脂肪酸代謝水平可能是竹節(jié)參總皂苷調(diào)節(jié)HepG2 細(xì)胞脂質(zhì)代謝的重要途徑。前列腺素A2、白三烯A4 是花生四烯酸的重要代謝產(chǎn)物，是重要的炎癥反應(yīng)介質(zhì)。本研究中模型組前列腺素A2、白三烯A4的水平顯著升高（表1），提示HepG2 細(xì)胞脂質(zhì)沉積模型存在炎癥反應(yīng)，且在竹節(jié)參總皂苷干預(yù)后均有恢復(fù)至正常水平的趨勢，再次確認(rèn)竹節(jié)參總皂苷能夠改善HepG2細(xì)胞脂質(zhì)沉積模型的炎癥反應(yīng)。

3 結(jié) 論

本研究首次基于UPLC-Q/TOF MS結(jié)合細(xì)胞代謝組學(xué)技術(shù)探討了竹節(jié)參總皂苷對HepG2細(xì)胞脂質(zhì)沉積模型脂質(zhì)代謝的改善作用，發(fā)現(xiàn)竹節(jié)參總皂苷可顯著改善HepG2細(xì)胞的脂質(zhì)代謝，并篩選了62個(gè)潛在生物標(biāo)志物，主要為脂肪酸和磷脂酰膽堿類成分，可能與調(diào)控鞘脂代謝、甘油磷脂代謝、脂肪酸代謝、炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。所得結(jié)果為后期深入研究HepG2細(xì)胞脂質(zhì)沉積模型的代謝輪廓及竹節(jié)參總皂苷的降脂作用提供了參考。