施文婷 劉遠(yuǎn)俊 張?zhí)m蘭 林榮楷 劉權(quán)震 黃森 劉燎原

陳皮配方顆粒是由陳皮飲片經(jīng)水提、分離、濃縮、干燥、制粒而成,具有藥效好、免煎煮、服用方便等優(yōu)勢,臨床應(yīng)用廣泛。質(zhì)量源于設(shè)計(quality by design,QbD)是一種系統(tǒng)性研究方法,是通過試驗設(shè)計來評價關(guān)鍵質(zhì)量屬性和關(guān)鍵工藝參數(shù)間的關(guān)系模型。在多響應(yīng)變量下,通過構(gòu)建設(shè)計空間來確定最佳工藝參數(shù)范圍,從而建立穩(wěn)定可靠的生產(chǎn)工藝,最終保障產(chǎn)品質(zhì)量[1-3]。中藥制劑工藝包括飲片炮制、提取、濃縮、干燥、制劑成型等環(huán)節(jié),各工藝單元對中間體及制劑成品均會產(chǎn)生影響?；谫|(zhì)量源于設(shè)計理念對全過程進(jìn)行風(fēng)險防控,可以明確工藝參數(shù)與質(zhì)量指標(biāo)的關(guān)系,進(jìn)一步確定關(guān)鍵工藝的評價指標(biāo)。識別關(guān)鍵質(zhì)量屬性和關(guān)鍵工藝參數(shù)是建立中藥制劑設(shè)計空間的前提,在保證中間體和成品質(zhì)量的穩(wěn)定傳遞中發(fā)揮重要作用[4]。

本試驗基于質(zhì)量源于設(shè)計理念對陳皮配方顆粒噴霧干燥工藝展開研究,結(jié)合信息熵賦值法以得粉率、蕓香柚皮苷、橙皮苷、川陳皮素和橘皮素含量作為關(guān)鍵質(zhì)量屬性,通過Plackett-Burman試驗設(shè)計篩選關(guān)鍵工藝參數(shù),中心點復(fù)合設(shè)計優(yōu)化關(guān)鍵工藝參數(shù),建立陳皮配方顆粒噴霧干燥工藝的數(shù)學(xué)模型和設(shè)計空間,并進(jìn)行工藝驗證,為該制劑的生產(chǎn)及過程質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 實驗儀器

Waters H-Class型超高效液相色譜儀(美國Waters公司);XP26型百萬分之一天平、ME204E型萬分之一天平(瑞士METTLER TOLEDO公司);Milli-Q Direct型超純水系統(tǒng)(德國Merck公司);B-290型噴霧干燥儀(瑞士BUCHI有限公司);KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);JJ2000B型百分之一天平(常熟市雙杰測試儀器廠);TC-15型套式恒溫器(海寧市新華醫(yī)療器械廠);YRE-501型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司);DLSB-5/20型低溫冷卻液循環(huán)水泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司);DHG-9146A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏試驗設(shè)備有限公司)。

1.2 試藥

橙皮苷(批號:110721-202019,純度95.3%)對照品購自中國食品藥品檢定研究院;蕓香柚皮苷(批號:wkq19041908,純度≥98%)、川陳皮素(批號:wkq20031701,純度≥98%)對照品購自四川省維克奇生物科技有限公司;橘皮素(批號:151021,純度≥98%)對照品購自成都普菲德生物技術(shù)有限公司;甲醇、乙腈為色譜純(德國Merck公司),冰醋酸為色譜純(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司),水為超純水,其余試劑均為分析純。

陳皮藥材(批號:YL2103011)經(jīng)廣東一方制藥有限公司孫冬梅主任中藥師鑒定為蕓香科植物橘CitrusreticulataBlanco的干燥成熟果皮。

2 方法與結(jié)果

2.1 陳皮清膏的制備

依據(jù)《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求》的相關(guān)規(guī)定[5],確定陳皮清膏的制備方法為:取陳皮飲片適量,加水煎煮兩次,第一次加9倍量的水,浸泡30分鐘,加熱煎煮30分鐘,用350目篩趁熱過濾;第二次加6倍量的水,加熱煎煮25分鐘,用350目篩趁熱過濾,合并兩次濾液,減壓濃縮至相對密度為1.12(70℃)的清膏樣品,保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 浸膏粉得粉率計算

每組試驗取一定含固量的陳皮清膏,置于磁力攪拌器上,按各試驗組要求設(shè)定所需工藝參數(shù),在相對濕度為40%以下的環(huán)境中收集浸膏粉,計算每組試驗得粉率,計算公式為:浸膏粉得粉率(%)=浸膏粉量/清膏含固量×100%。

2.3 指標(biāo)成分含量測定

2.3.1 色譜條件[6]色譜柱:Acclaim RSLC 120 C18(100 mm×2.1 mm,2.2 μm);流動相:乙腈(A)-0.5%冰醋酸溶液(B)梯度洗脫(0～15分鐘,13%→20% A;15～25分鐘,20%→34% A;25～44分鐘,34%→42% A;44～45分鐘,42%→13% A;45～50分鐘,13% A);流速:0.40 mL/min;柱溫:25℃;檢測波長:283 nm;進(jìn)樣量:1.0 μL。

2.3.2 對照品溶液的制備 精密稱取蕓香柚皮苷、橙皮苷、川陳皮素和橘皮素對照品適量,置5 mL量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,制成質(zhì)量濃度分別為61.3520、300.1625、150.9600、100.2860 μg/mL的混合對照品溶液。

2.3.3 供試品溶液的制備 取陳皮浸膏粉約0.2 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入甲醇50 mL,稱定重量,超聲處理(功率300 W,頻率40 kHz)30分鐘,放冷,再稱定重量,用甲醇補足減失的重量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性試驗 分別精密吸取空白溶劑、混合對照品溶液及供試品溶液,照“2.3.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定,如圖1所示,供試品溶液色譜在與對照品溶液色譜相應(yīng)的保留時間處有相同的色譜峰,且空白溶劑無干擾,表明該方法專屬性良好。

注:峰1:蕓香柚皮苷;峰2:橙皮苷;峰3:川陳皮素;峰4:橘皮素;A:空白溶劑;B:混合對照品溶液;C:供試品溶液。

2.4.2 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.3.2”項下混合對照品溶液,加甲醇稀釋制成系列濃度的混合對照品溶液,按“2.3.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定,記錄色譜圖。以對照品質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)(X),以峰面積為縱坐標(biāo)(Y),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,進(jìn)行線性回歸,得到各待測組分的回歸方程及線性范圍見表1。結(jié)果表明各成分在相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)與峰面積的線性關(guān)系良好。

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果(n=7)

2.4.3 精密度試驗 精密吸取“2.3.2”項下混合對照品溶液,按“2.3.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次,計算蕓香柚皮苷、橙皮苷、川陳皮素、橘皮素色譜峰峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)均小于3%,表明儀器精密度良好。

2.4.4 重復(fù)性試驗 取同一份陳皮浸膏粉,按“2.3.3”項下方法平行制備6份供試品溶液,按“2.3.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定。計算蕓香柚皮苷、橙皮苷、川陳皮素和橘皮素含量的RSD均小于3%,表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗 精密吸取“2.3.3”項下供試品溶液,按“2.3.1”項下色譜條件分別在0、2、4、6、8、12、24小時進(jìn)樣測定,計算蕓香柚皮苷、橙皮苷、川陳皮素和橘皮素色譜峰峰面積的RSD均小于3%,表明供試品溶液在24小時內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.6 加樣回收率試驗 取已知含量的陳皮浸膏粉適量,精密稱取9份,每份約0.1 g,置具塞錐形瓶中,分為3組,每組分別按高、中、低濃度精密加入混合對照品溶液。按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液,按“2.3.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定,記錄峰面積,計算加樣回收率及RSD,見表2。結(jié)果表明蕓香柚皮苷、橙皮苷、川陳皮素、橘皮素的平均加樣回收率分別為99.80%、98.05%、98.93%、96.64%,RSD分別為2.82%、1.70%、2.89%、2.26%,均小于3%。表明該方法準(zhǔn)確度良好。

表2 加樣回收率試驗結(jié)果(n=9)

2.5 數(shù)據(jù)處理

(1)數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化[7]:針對定量指標(biāo)數(shù)據(jù),考慮到數(shù)量級不同,因此要對指標(biāo)進(jìn)行無量綱化處理。本研究采用Hassan法分別對各指標(biāo)進(jìn)行數(shù)學(xué)轉(zhuǎn)換求“歸一值”,計算公式為:

Yij=(xij-min{xij})/(max{xij}-min{xij})

(2)對標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化:即計算第j項指標(biāo)下第i項評價項目指標(biāo)值所占的比重(fij),計算公式為:

(3)計算各指標(biāo)的信息熵:根據(jù)信息論中信息熵(Ej)的定義,計算公式為:

當(dāng)fij=0,考慮到lnfij無意義,因此,對fij的計算進(jìn)行修正,將其定義為

(4)計算各指標(biāo)的熵權(quán)系數(shù):根據(jù)Ej的計算公式,計算出各個指標(biāo)的Ej為E1,E2,…,Em。通過Ej計算各指標(biāo)的權(quán)重:

2.6 陳皮配方顆粒噴霧干燥工藝優(yōu)化

2.6.1 關(guān)鍵質(zhì)量屬性和關(guān)鍵工藝參數(shù)的確定 2020年版《中國藥典》采用橙皮苷作為陳皮的含量測定成分[8];已出臺的陳皮配方顆粒國家標(biāo)準(zhǔn)亦采用橙皮苷作為含量測定成分,同時特征圖譜中以蕓香柚皮苷、橙皮苷、川陳皮素、橘皮素作為其特征峰[6]?，F(xiàn)代藥理研究表明,蕓香柚皮苷具有抗炎、抗氧化的作用[9];橙皮苷具有抗病毒、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫力、保護心血管系統(tǒng)等作用[10];川陳皮素具有抗腫瘤、抗炎、改善記憶、抗氧化、影響血管平滑肌等多種生物活性[11];橘皮素具有抗腫瘤的作用[12]。浸膏粉的得粉率直接影響生產(chǎn)產(chǎn)量,因此將得粉率和蕓香柚皮苷、橙皮苷、川陳皮素、橘皮素的含量作為陳皮噴霧干燥工藝的關(guān)鍵質(zhì)量屬性。采用魚骨圖進(jìn)行關(guān)鍵工藝參數(shù)的初步篩選,結(jié)果見圖2。影響綜合評分的因素類別主要有設(shè)備、藥液、環(huán)境、工藝參數(shù)4大類,上述因素可再細(xì)化分類為9個影響因素。根據(jù)前期研究經(jīng)驗及文獻(xiàn)分析[13-15],可確定藥液相對密度、藥液溫度、進(jìn)料速度、進(jìn)風(fēng)溫度和霧化壓力為影響噴霧干燥工藝的關(guān)鍵因素。

圖2 陳皮配方顆粒噴霧干燥工藝參數(shù)篩選魚骨圖

2.6.2 Plackett-Burman試驗篩選關(guān)鍵工藝參數(shù) Plackett-Burman試驗設(shè)計可通過較少的試驗從眾多影響因素中快速、準(zhǔn)確、高效地篩選出顯著因素,為進(jìn)一步工藝優(yōu)化研究提供支持[13]。采用Plackett-Burman試驗設(shè)計將藥液相對密度(A)、藥液溫度(B)、進(jìn)料速度(C)、進(jìn)風(fēng)溫度(D)和霧化壓力(E)5個工藝控制點作為關(guān)鍵工藝參數(shù),以得粉率(Y1)和蕓香柚皮苷(Y2)、橙皮苷(Y3)、川陳皮素(Y4)、橘皮素(Y5)的含量作為關(guān)鍵質(zhì)量屬性,采用Minitab 16.0軟件設(shè)計試驗。由信息熵賦值法計算得到得粉率(Y1)、蕓香柚皮苷(Y2)、橙皮苷(Y3)、川陳皮素(Y4)、橘皮素(Y5)的權(quán)重分別是0.148、0.151、0.075、0.379、0.241,按綜合評分(OD)=0.148×Y1+0.151×Y2+0.075×Y3+0.379×Y4+0.241×Y5,計算各組試驗的綜合評分,試驗設(shè)計及結(jié)果見表3、表4。

表3 Plackett-Burman試驗設(shè)計因素水平表

表4 Plackett-Burman試驗結(jié)果

對Plackett-Burman試驗結(jié)果進(jìn)行方差分析,結(jié)果見表5,可知藥液相對密度(A)和進(jìn)料速度(C)對OD值有顯著影響(P<0.05),其它三個因素對OD值無顯著影響,即藥液相對密度(A)和進(jìn)料速度(C)為陳皮配方顆粒噴霧干燥工藝的關(guān)鍵工藝參數(shù)。

表5 Plackett-Burman試驗的方差分析結(jié)果

2.6.3 中心點復(fù)合設(shè)計試驗優(yōu)化關(guān)鍵工藝參數(shù) 中心點復(fù)合設(shè)計是一類用于擬合響應(yīng)曲面的設(shè)計方法,與傳統(tǒng)設(shè)計方法相比,該設(shè)計可以明顯減少試驗次數(shù),提高試驗預(yù)測精準(zhǔn)度,降低試驗的成本[16]?；赑lackett-Burman試驗結(jié)果,采用中心點復(fù)合設(shè)計試驗對藥液相對密度(A)和進(jìn)料速度(C)進(jìn)行工藝優(yōu)化。根據(jù)生產(chǎn)經(jīng)驗,固定其它3個因素的水平分別為進(jìn)風(fēng)溫度170℃,藥液溫度50℃,霧化壓力0.5 Mpa。采用Design Expert 8.0軟件設(shè)計試驗,由信息熵賦值法計算得到得粉率(Y1)、蕓香柚皮苷(Y2)、橙皮苷(Y3)、川陳皮素(Y4)、橘皮素(Y5)的權(quán)重分別是0.217、0.267、0.185、0.161、0.170,按綜合評分(OD)=0.217×Y1+0.267×Y2+0.185×Y3+0.161 ×Y4+0.170×Y5,計算各組試驗的綜合評分,試驗設(shè)計及結(jié)果見表6、表7。

表6 中心點復(fù)合設(shè)計試驗設(shè)計因素水平表

表7 中心點復(fù)合設(shè)計試驗結(jié)果

根據(jù)表7的數(shù)據(jù),采用Design Expert 8.0軟件分別對5個關(guān)鍵質(zhì)量屬性(Y1～Y5)及相應(yīng)關(guān)鍵工藝參數(shù)(A、C)分別進(jìn)行擬合,OD的回歸方程為:OD=0.61-0.17A-0.069C+0.04AC-0.00246A2-0.05C2,相應(yīng)的方差分析見表8。OD與藥液相對密度(A)、進(jìn)料速度(B)的響應(yīng)面圖和等高線圖如圖3。

表8 方差分析及擬合優(yōu)度分析

圖3 藥液相對密度和進(jìn)料速度對OD值響應(yīng)面圖與等高線圖

由表8可知,OD模型的P值為0.0002,小于0.05,模型成立;模型決定系數(shù)為0.9502,模型擬合程度較好;模型失擬項P值為0.1201>0.05,無失擬因素存在;模型精密度為15.382>4,模型精密度較理想;說明響應(yīng)值OD的實際值與預(yù)測值之間有較好的擬合度,該模型可用來預(yù)測陳皮配方顆粒噴霧干燥工藝的實際情況。藥液相對密度(A)、進(jìn)料速度(C)的P值均<0.05,說明藥液相對密度和進(jìn)料速度對陳皮配方顆粒浸膏粉的OD值均有顯著影響;AC的P值>0.05,說明AC的交互作用對OD值影響不顯著;C2的P值<0.05,表明進(jìn)料速度對OD值的影響十分顯著。由圖3可知,進(jìn)料速度在一定范圍內(nèi),藥液相對密度越低,OD值越高;藥液相對密度在一定范圍內(nèi),進(jìn)料速度越低,OD值越低。

2.7 設(shè)計空間建立

在設(shè)定的參數(shù)空間內(nèi)搜索滿足OD值大于0.7的所有因素組合,即構(gòu)成設(shè)計空間,但由于模型的預(yù)測值與真實值之間存在一定差異,所以設(shè)計空間的邊界具有不確定性。為了應(yīng)對設(shè)計空間邊界的不確定性,在定義設(shè)計空間時可加入置信水平α=0.05的置信區(qū)間,將設(shè)計空間優(yōu)化,結(jié)果用Overlay polt展示,如圖4。圖中亮黃色區(qū)域為加入95%置信區(qū)間后的設(shè)計空間,在此設(shè)計空間所有的點都符合工藝目標(biāo)的期望值;暗黃色區(qū)域為原設(shè)計空間內(nèi)不可靠的部分,在此空間的所有點有5%的概率無法滿足工藝目標(biāo)。因設(shè)計空間并不規(guī)則,不便對二者進(jìn)行嚴(yán)格控制,為了便于操作,推薦的操作空間范圍藥液相對密度為1.04～1.05,進(jìn)料速度為18%～32%。

圖4 加入95%置信區(qū)間的噴霧干燥工藝設(shè)計空間

2.8 驗證試驗

選取6個試驗點進(jìn)行驗證試驗,用來檢驗所建模型的預(yù)測能力。試驗點過程參數(shù)及結(jié)果見表9。1號、2號和3號為95%置信區(qū)間內(nèi)的點(圖4亮黃色區(qū)域),4號、5號和6號為95%置信區(qū)間外的點(圖4暗黃色區(qū)域)。對表9中OD值的實測值與預(yù)測值進(jìn)行獨立樣品t檢驗比較,顯著性均大于0.05,實測值與預(yù)測值無顯著差異,說明設(shè)計空間具有較好的預(yù)測性。

表9 驗證實驗結(jié)果

3 結(jié)論

長期以來,中藥制劑質(zhì)量依靠終端檢驗而非過程控制,忽略了對原料質(zhì)量屬性和生產(chǎn)工藝過程的理解,無法預(yù)測生產(chǎn)過程中可能發(fā)生的問題,多數(shù)情況下僅依靠經(jīng)驗判斷,難以保證產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定可控。與傳統(tǒng)的質(zhì)量源于檢驗(quality by testing,QbT)理念相比,質(zhì)量源于設(shè)計將質(zhì)量控制重心移至原料控制和制藥過程控制,制訂有針對性的策略,使產(chǎn)品質(zhì)量始終介于可接受范圍內(nèi),適用于中藥生產(chǎn),有利于藥品質(zhì)量的風(fēng)險管理和持續(xù)改進(jìn)[4]。

本研究將質(zhì)量源于設(shè)計理念應(yīng)用于陳皮配方顆粒噴霧干燥工藝優(yōu)化實驗中,采用Plackett-Burman試驗設(shè)計和中心點復(fù)合設(shè)計試驗設(shè)計優(yōu)選出藥液相對密度和進(jìn)料速度兩個關(guān)鍵工藝參數(shù),建立噴霧干燥工藝的設(shè)計空間,并進(jìn)行驗證,驗證結(jié)果表明工藝參數(shù)在該設(shè)計空間內(nèi)能保證陳皮配方顆粒噴霧干燥過程和產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定。同時采用信息熵賦值法計算各關(guān)鍵質(zhì)量屬性的權(quán)重,使綜合評分結(jié)果更科學(xué)、合理,避免了主觀因素對試驗結(jié)果造成誤差。將質(zhì)量源于設(shè)計理念運用于中藥制劑工藝的研發(fā),同時采用科學(xué)的試驗方法構(gòu)建設(shè)計空間,可提升中藥配方顆粒質(zhì)量的穩(wěn)定性,有利于提高中藥配方顆粒的整體質(zhì)量水平。