洪藝勤 唐炳華 陳旭 于藜爽 王慧 解涵滟 郭冬青

缺血性心臟病是指當(dāng)血液減少或者停止流向心臟的某個(gè)部位時(shí),心肌就會(huì)因?yàn)槿毖醵軅?如果病情嚴(yán)重,則會(huì)導(dǎo)致急性心肌梗死[1]。本病的直接治療包括服用阿司匹林、硝酸甘油和吸氧[2],另外還有恢復(fù)心臟血液循環(huán)的再灌注療法,以及血管成形術(shù)。血管成形術(shù)效果顯著,但也具有較高的風(fēng)險(xiǎn)[3]。

缺血性心臟病最根本的原因是心肌缺血,因此最根本的治療就是增加缺血心肌的血流量。血管新生這種不傷害機(jī)體又增加血管從而增加血流量的方法,近些年來受到越來越多的關(guān)注和研究。血管新生是指從已有的血管中生成新的毛細(xì)血管,是一個(gè)復(fù)雜的過程,在生長發(fā)育、組織和器官再生以及許多病理狀況中都起著重要作用[4-5]。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic proteins, BMPs)屬于轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)家族成員,在血管內(nèi)穩(wěn)態(tài)和血管新生中發(fā)揮重要作用[6]。其中骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(bone morphogenetic protein-2, BMP2)已經(jīng)證實(shí)能夠在血管生物學(xué)中起作用[7],而且可以激活內(nèi)皮細(xì)胞并促進(jìn)血管新生[8]。Notch信號(hào)是一種高度保守的細(xì)胞間信號(hào)通路系統(tǒng)[9],Delta-Like配體蛋白-4(Delta-like 4, Dll4)是唯一由血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的Notch配體[10-12],可以通過抑制內(nèi)皮“尖端”細(xì)胞的進(jìn)一步形成和“柄”細(xì)胞的增殖作為血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)作用的負(fù)調(diào)節(jié)因子[13]。Dll4/Notch1的結(jié)合激活會(huì)導(dǎo)致Notch受體的蛋白裂解,Notch胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域從細(xì)胞膜釋放到細(xì)胞核,并與CSL轉(zhuǎn)錄因子和共激活因子結(jié)合,誘導(dǎo)下游靶基因轉(zhuǎn)錄[9],從而調(diào)節(jié)血管新生。

丹參具有活血祛瘀、通經(jīng)止痛的功效,可用于治療胸痹心痛、痛經(jīng)經(jīng)閉等[14]。丹參作用平和,能夠活血祛瘀而不傷正氣,如復(fù)方丹參片可用于治療心絞痛引起的胸痛[15]。面對(duì)心肌缺血再灌注大鼠,丹參飲可以改善心功能、減少心肌凋亡,對(duì)心臟發(fā)揮保護(hù)作用[16]。因此本研究基于BMP2-Dll4/Notch1通路探究丹參提取物對(duì)心肌缺血后血管新生的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

SPF級(jí)雄性SD大鼠48只,體質(zhì)量(220±20)g,購于北京斯貝福生物技術(shù)有限公司,于北京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物房中普通飼料飼養(yǎng),溫度:(22±2)℃,濕度:45%±5%,每日12小時(shí)光照與黑暗循環(huán),正常飲水。

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)來自北京安貞醫(yī)院。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

丹參提取物來自上海源葉生物科技有限公司,批號(hào):S27206-25g,是通過水萃取和酒精沉淀對(duì)丹參進(jìn)行制備而得。為確保藥物質(zhì)量,課題組通過HPLC-PDA建立了指紋圖譜,鑒定出了丹參的17個(gè)特征峰[17]。

瑞舒伐他汀來自阿斯利康藥業(yè)(中國)有限公司,10 mg/片,批號(hào):502705。

1.3 主要試劑與儀器

ALC-V8S小動(dòng)物呼吸機(jī),Visual Sonics小動(dòng)物超聲影像系統(tǒng),moorFLPI-2血流成像儀。CCK-8檢測試劑(同仁,日本),BMP2抗體(1∶1 000,Immunoway),Dll4抗體(1∶1 000,Bioss),Notch1抗體(1∶1 000,Proteintech),GAPDH抗體(1∶1 000,Proteintech),山羊抗兔單克隆二抗(1∶2 000,Proteintech),ECL超敏發(fā)光液(上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司),BMP2 ELISA試劑盒(泉州市睿信生物科技有限公司)。Molecular Devices SpectraMax i3x全波長酶標(biāo)儀,BIO-RAD制膠、電泳及電轉(zhuǎn)設(shè)備與凝膠成像儀及圖像分析系統(tǒng)。

1.4 動(dòng)物分組、造模及給藥

將48只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,腹腔注射1%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉,用氣管套管進(jìn)行插管,確認(rèn)通氣后連接小動(dòng)物呼吸儀,設(shè)置儀器參數(shù)為80次/分鐘,潮氣量3.0,呼吸比1∶2,于左胸前第3、4肋間開胸,傷口約1 cm左右,在距離左心耳1～1.5 mm處進(jìn)行結(jié)扎,其中隨機(jī)選取8只大鼠僅開胸穿線,不結(jié)扎,作為后續(xù)假手術(shù)組。結(jié)扎完畢后,于心臟表面點(diǎn)滴1～2滴呋塞米,隨后逐層關(guān)胸,于腹腔注射利多卡因注射液0.1 mL,置于預(yù)熱的電熱毯上,待其恢復(fù)自主呼吸后自行脫離氣管插管,待蘇醒后放回籠中。

術(shù)后將存活的40只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、丹參提取物組(0.292 8 g/kg)和陽性藥組(瑞舒伐他汀1 mg/kg)。假手術(shù)組和模型組給予空白溶劑(生理鹽水),丹參提取物和瑞舒伐他汀的給藥劑量根據(jù)臨床治療劑量等效換算。術(shù)后24小時(shí)后灌胃給藥,每天1次,灌胃體積為1 mL/100 g,持續(xù)4周。在實(shí)驗(yàn)過程中所有死亡的大鼠均被剔除出組,保證最后每組動(dòng)物存活數(shù)不少于6只。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)、分組與造模

培養(yǎng)條件:37℃,5% CO2,濕度70%～80%;完全培養(yǎng)基:90% 1640+10%胎牛血清+1%青霉素/鏈霉素。根據(jù)丹參提取物的藥物作用濃度,將HUVECs分為:空白對(duì)照組、模型組、400 μg/mL丹參提取物組、600 μg/mL丹參提取物組和800 μg/mL丹參提取物組?？瞻讓?duì)照組HUVECs在常規(guī)培養(yǎng)條件下培養(yǎng),再更換完全培養(yǎng)基培養(yǎng)8小時(shí)。模型組常規(guī)培養(yǎng)后,更換Earle平衡鹽溶液氧-葡萄糖剝奪法(oxygen-glucose deprivation,OGD)刺激8小時(shí)。

400 μg/mL丹參提取物組常規(guī)培養(yǎng)后,更換Earle平衡鹽溶液配制的400 μg/mL丹參提取物OGD刺激8小時(shí)。

600 μg/mL丹參提取物組常規(guī)培養(yǎng)后,更換Earle平衡鹽溶液配制的600 μg/mL丹參提取物OGD刺激8小時(shí)。

800 μg/mL丹參提取物組常規(guī)培養(yǎng)后,更換Earle平衡鹽溶液配制的800 μg/mL丹參提取物OGD刺激8小時(shí)。

1.6 檢測指標(biāo)

1.6.1 超聲檢測 大鼠末次給藥24小時(shí)后,經(jīng)腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉,將左胸備皮。使用小動(dòng)物超聲檢測各組大鼠的左室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end-diastole diameter, LVID;d)、左室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular end-systole diameter, LVID;s)、左心室舒張末期容積(left ventricular end-diastolic volume, LVIDV)和左室收縮末期容積(left ventricular end-systole volume, LVISV)等指標(biāo)。根據(jù)公式計(jì)算短軸縮短率(fractional shortening, FS)和射血分?jǐn)?shù)(ejection fraction, EF)。

FS(%)=(LVID;d-LVID;s)/LVID;d×100%

EF(%)=(LVIDV-LVISV)/LVIDV×100%

1.6.2 心臟微血流掃描 藥物干預(yù)28天,禁食12小時(shí)后,將大鼠麻醉,備皮,氣管插管,插上呼吸機(jī)。打開左胸,露出心臟,用紗布擦去心臟表面多余的血液,將moorFLPI-2血流成像儀的掃描探頭平行于心臟表面5 cm處放置并固定,探頭內(nèi)的光束照射到組織0.5 mm的深度測量心臟的血流。從藍(lán)色到紅色的圖像表示低到高的血流量。

1.6.3 心肌組織蘇木精—伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色 將石蠟切片依次放入二甲苯、無水乙醇、酒精及蒸餾水中脫蠟,隨后使用蘇木素染細(xì)胞核、伊紅染液染細(xì)胞質(zhì),最后脫水封片,圖像采集并分析。

1.6.4 CCK-8檢測細(xì)胞增殖活性 CCK-8工作液配制比為CCK-8∶1640培養(yǎng)基=1∶9,96孔板每孔加入100 μL工作液,37℃培養(yǎng)箱中孵育2小時(shí),酶標(biāo)儀波長450 nm檢測OD值。

將HUVECs接種到96孔板中,每孔接種6×103個(gè),貼壁培養(yǎng)到所需密度時(shí),棄去原培養(yǎng)基,加入完全培養(yǎng)基配制的不同濃度(10、50、100、200、400、600、800、1 000、2 000 μg/mL)丹參提取物刺激24小時(shí),使用CCK-8試劑確認(rèn)丹參提取物的無毒范圍。

將HUVECs接種到96孔板中,每孔接種6×103個(gè),貼壁培養(yǎng)到所需密度時(shí),棄去原培養(yǎng)基,加入Earle平衡鹽溶液配制的不同濃度(10、50、100、200、400、600、800、1 000、2 000 μg/mL)丹參提取物OGD刺激8小時(shí),使用CCK-8試劑確認(rèn)丹參提取物的起效濃度。

1.6.5 細(xì)胞成管實(shí)驗(yàn) 在置于冰上的96孔板上每孔加入35 μL Matrigel,37℃培養(yǎng)箱中孵育30分鐘,使其均勻凝固于孔底。將經(jīng)過不同處理的各組HUVECs以1×106個(gè)/mL的密度接種到Matrigel上。于37℃培養(yǎng)箱中孵育5小時(shí)后,棄上清,PBS沖洗細(xì)胞3次。加入Calcein-AM染料(5 μg/mL)并避光染色5分鐘。使用倒置顯微鏡拍照。使用Image-Pro Plus 6.0軟件計(jì)算圖中管的總長度和分支點(diǎn)總數(shù),進(jìn)而比較各組細(xì)胞的成管能力。

1.6.6 蛋白免疫印跡法(Western blots)檢測HUVECs中BMP2、Dll4、Notch1表達(dá)情況 將HUVECs培養(yǎng)皿置于冰上,將先前配制好的RIPA裂解液加入培養(yǎng)皿中,使用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞刮至皿一側(cè),取細(xì)胞于EP管中,充分裂解20分鐘,離心機(jī)12 000 r/min,離心10分鐘,取上清;采用BCA蛋白定量法進(jìn)行定量,加入loading buffer調(diào)整蛋白濃度,98℃金屬浴10分鐘,使蛋白充分變性,自然冷卻后使用;向配制好的濃縮膠上樣孔中分別加入5 μL Marker和10 μL蛋白樣品,80 V電泳90分鐘,300 mA電轉(zhuǎn)90分鐘,5%牛奶封閉液封閉2小時(shí),將膜放入BMP2一抗、Dll4一抗、Notch1一抗、GAPDH一抗中4℃孵育過夜,二抗常溫孵育1小時(shí),將膜置于凝膠成像儀中,將ECL發(fā)光液均勻地滴在膜上,設(shè)置合適的曝光時(shí)間,得到圖像并保存,使用Image Lab對(duì)條帶灰度進(jìn)行計(jì)算分析。

1.6.7 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測HUVECs上清液中BMP2表達(dá)情況 收集不同處理后的各組HUVECs培養(yǎng)基,根據(jù)制造商的說明,4 000 r/min離心20分鐘,提取上清液。于96孔板設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔、空白孔和樣本孔,標(biāo)準(zhǔn)品孔加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品各50 μL,空白孔不加,樣本孔分別加待測樣本50 μL,然后標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔都各加入檢測抗體100 μL,37℃恒溫箱避光孵育60分鐘。棄去液體,加入洗滌液靜置20秒,重復(fù)5次。將底物A和B按1∶1體積充分混合,每個(gè)孔加入混合液100 μL,37℃恒溫箱避光孵育15分鐘,隨后每個(gè)孔加入終止液50 μL,在酶標(biāo)儀上讀取各孔吸光度。通過標(biāo)準(zhǔn)品孔的OD值得到標(biāo)準(zhǔn)曲線y=aln(x)+b,再將樣本孔的OD值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中,從而得到每個(gè)樣本的濃度值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 丹參提取物對(duì)心肌缺血大鼠心功能的影響

左冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎28天后進(jìn)行超聲檢測,模型組大鼠的EF值和FS值顯著下降(P<0.01),提示模型組大鼠的心功能嚴(yán)重受損,LVID;d值增加(P<0.01),提示左心室擴(kuò)張。藥物干預(yù)28天后,與模型組相比,丹參提取物組的大鼠EF值和FS值顯著升高(P<0.01),LVID;d值和LVID;s值顯著降低(P<0.01),陽性藥組EF值和FS值亦升高(P<0.05),LVID;d值和LVID;s值亦降低(P<0.05),表明丹參提取物可以恢復(fù)心肌缺血大鼠的射血功能,改善心功能。見表1。

表1 各組心肌缺血模型大鼠心臟超聲檢測結(jié)果

2.2 丹參提取物對(duì)心肌缺血大鼠心臟血流量的影響

使用激光多普勒直觀評(píng)估丹參提取物對(duì)心臟血流的影響,結(jié)果顯示模型組心肌紅色信號(hào)明顯弱于假手術(shù)組(P<0.01),提示心肌血流量減少,血供不足。丹參提取物組血流信號(hào)明顯強(qiáng)于模型組,說明心肌血流量明顯增加(P<0.01),證明丹參提取物確實(shí)有促進(jìn)心肌缺血大鼠血管新生的作用,而陽性藥組促心臟血流的效果不明顯。見圖1,表2。

圖1 各組心肌缺血模型大鼠心臟血流量比較

表2 各組心肌缺血模型大鼠心臟血流量比較

2.3 丹參提取物對(duì)心肌缺血大鼠心肌細(xì)胞染色的影響

HE染色結(jié)果顯示,假手術(shù)組大鼠心肌細(xì)胞無結(jié)構(gòu)性改變且無炎細(xì)胞浸潤,模型組心肌形態(tài)變化嚴(yán)重,結(jié)構(gòu)異常并出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤。丹參提取物干預(yù)后,心肌細(xì)胞排列較為整齊,炎性細(xì)胞浸潤減少,證明丹參提取物具有明顯改善心肌細(xì)胞形態(tài)和炎癥的作用。見圖2。

圖2 各組心肌缺血模型大鼠心肌組織HE染色結(jié)果(×400)

2.4 丹參提取物對(duì)HUVECs無毒范圍的確定

為了篩選丹參提取物對(duì)HUVECs的毒性范圍,將丹參提取物作用于HUVECs細(xì)胞24小時(shí)。CCK-8結(jié)果顯示,丹參提取物在濃度為10～800 μg/mL時(shí)對(duì)HUVECs細(xì)胞活力幾乎沒有影響,證明此濃度范圍內(nèi)丹參提取物對(duì)細(xì)胞無毒副作用,而1 000～2 000 μg/mL丹參提取物明顯降低了細(xì)胞活力(P<0.05,P<0.01)。見表3。

表3 不同濃度丹參提取物對(duì)HUVECs細(xì)胞活力的影響

2.5 丹參提取物對(duì)OGD損傷的HUVECs細(xì)胞活力的影響

將內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行OGD處理的同時(shí),給予不同濃度的丹參提取物刺激,8小時(shí)后使用CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞活力。結(jié)果顯示,模型組與空白組相比,細(xì)胞活力明顯下降(P<0.01);而與模型組相比,100～2 000 μg/mL的丹參提取物能提高細(xì)胞活力,整體呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(P<0.05)。見表4。

表4 不同濃度丹參提取物對(duì)OGD損傷HUVECs細(xì)胞活力的影響

2.6 丹參提取物對(duì)HUVECs體外成管的影響

采用Matrigel成管實(shí)驗(yàn)來觀察HUVECs的成管能力。與空白組相比,模型組幾乎沒有分支點(diǎn)和成管能力;與模型組相比,400 μg/mL、600 μg/mL和800 μg/mL丹參提取物能增加管的總長度及分支點(diǎn)的數(shù)目,其中600 μg/mL成管效果最佳,提示丹參提取物對(duì)OGD損傷的HUVECs的成管能力有促進(jìn)作用。見圖3。

圖3 不同濃度丹參提取物對(duì)OGD損傷HUVECs細(xì)胞成管的影響

2.7 丹參提取物對(duì)BMP2-Dll4/Notch1通路的影響

與模型組比較,各組HUVECs細(xì)胞中BMP2的表達(dá)變化沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;各組HUVECs細(xì)胞上清液中,模型組分泌的BMP2含量顯著減少(P<0.01),而400 μg/mL、600 μg/mL和800 μg/mL丹參提取物能增加BMP2的分泌,600 μg/mL時(shí)增加最明顯(P<0.01)。見表5～6。

表5 各組HUVECs細(xì)胞中BMP2的蛋白表達(dá)水平比較

表6 各組HUVECs上清液中分泌的BMP2含量比較

通過Western blots檢測BMP2下游蛋白Dll4和Notch1的表達(dá)變化,發(fā)現(xiàn)OGD刺激能夠激活Dll4/Notch1,使Dll4、Notch1表達(dá)增加(P<0.01)。而丹參提取物能夠顯著降低Dll4、Notch1的表達(dá)(P<0.01),抑制Dll4/Notch1通路。見表7。

表7 各組HUVECs中Dll4、Notch1的蛋白表達(dá)水平比較

3 討論

缺血性心臟病由流向心臟的部分血流減少或停止引起,目前的治療方法不僅包括通過介入手術(shù)促進(jìn)缺血?jiǎng)用}的快速再灌注,還包括使用適當(dāng)?shù)妮o助抗血小板藥物保持血管暢通,使用他汀類藥物以降低低密度脂蛋白膽固醇和其他藥物以改善血管壁和心肌的愈合,從而減少其他缺血后并發(fā)癥的發(fā)生率,包括心律失常和心力衰竭[18]。而中醫(yī)藥則可以通過中藥配伍從減少炎癥、減少纖維化、促進(jìn)血管新生等多個(gè)方面調(diào)節(jié)保護(hù)心肌,從而恢復(fù)心臟血流。近年來,血管新生這一促進(jìn)恢復(fù)的治療方法在眾多通過減少損傷來達(dá)到治療目的的方法中脫穎而出,成為一個(gè)新的研究熱點(diǎn)。

BMPs最初是因其誘導(dǎo)骨和軟骨形成的能力而被發(fā)現(xiàn)。BMPs信號(hào)通路不僅參與骨發(fā)育,還參與原腸胚形成、胚胎模式形成和器官發(fā)生[19]、血管生成與血管完整性[7]、鐵穩(wěn)態(tài)[20]、炎癥[21]和有性生殖[22]。在不同的BMPs中,BMP2、BMP4、BMP6和BMP7已被證明在血管生物學(xué)中起作用[7],其中BMP2已經(jīng)被報(bào)道可以激活內(nèi)皮細(xì)胞并促進(jìn)血管新生[8],而且心肌梗死后血清中BMP2從第一天就開始下降,與左心室重構(gòu)過程相吻合[23]。

研究證實(shí),血管新生需要多種信號(hào)級(jí)聯(lián)的協(xié)調(diào)整合,包括VEGF、成纖維細(xì)胞生長因子、Notch/Dll4、血管生成素、TGF-β和BMP通路[18]。Dll4/Notch1信號(hào)通路是調(diào)節(jié)血管新生的重要通路,Dll4是血管新生的負(fù)調(diào)控因子[24],可被BMP2誘導(dǎo)[25],Notch1是一種高度保守的受體,廣泛存在于細(xì)胞表面,受Dll4的受體配體模式的調(diào)控[26]。

目前臨床前實(shí)驗(yàn)探究中藥促進(jìn)缺血心肌血管新生,多是通過檢測血液或心臟組織中血管生長因子含量以及對(duì)內(nèi)皮特異性標(biāo)記物CD31的免疫組化染色來間接評(píng)估心肌組織的血管新生情況,缺乏整體水平對(duì)心臟血流的評(píng)估。在本研究中,筆者使用moorFLPI-2血流成像儀直觀評(píng)估了各組大鼠的心臟血流量。通過超聲檢測、激光多普勒和HE染色證明丹參提取物不僅能夠改善心肌缺血大鼠的心功能,還能增加心臟血流量,改善心肌細(xì)胞形態(tài)和炎癥。

在離體細(xì)胞層面,本研究驗(yàn)證了丹參提取物能夠增加細(xì)胞活力,增加內(nèi)皮細(xì)胞的體外成管,佐證了丹參提取物對(duì)血管新生的調(diào)節(jié)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,丹參提取物不能明顯改變內(nèi)皮細(xì)胞中BMP2蛋白的表達(dá),但是能夠增加HUVECs上清中BMP2的分泌量,同時(shí)降低細(xì)胞中Dll4和Notch1的蛋白表達(dá),提示丹參提取物可能通過BMP2抑制Dll4/Notch1信號(hào)通路,這可能是丹參提取物通過促進(jìn)血管新生發(fā)揮心肌保護(hù)作用的機(jī)制之一。

綜上,丹參提取物可通過調(diào)節(jié)BMP2-Dll4/Notch1信號(hào)通路,促進(jìn)心肌缺血后血管新生,進(jìn)而發(fā)揮心功能保護(hù)作用。