魏玥 付長庚 李洪崢 楊文文 彭煜暄 路愛梅 龍霖梓 曲華 于子凱

動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是一種常見的動脈內膜炎癥性疾病,內膜炎癥反應的嚴重程度決定著AS的進展和轉歸[1]。巨噬細胞是AS斑塊中主要的炎性細胞,可在AS微環(huán)境因素的影響下極化為功能相反的兩種表型,即M1型和M2型,二者極化失衡可促進AS的炎癥持續(xù)狀態(tài),進而加重AS[2]。研究表明,M1型巨噬細胞可通過分泌促炎因子加劇炎癥反應,加速AS的形成;而M2型巨噬細胞具有抗炎作用,可促進組織修復,延緩AS的進展,因此,調控二者極化平衡對防治AS具有重要意義[3-4]。

三七總皂苷(panax notoginseng saponins,PNS)是活血化瘀類中藥三七的主要有效成分,PNS制劑被廣泛用于心血管疾病的臨床治療[5]。既往研究顯示,PNS具有降低血脂水平、抑制炎癥反應、抑制心肌細胞凋亡等作用[6-7]。團隊前期研究表明,PNS可通過降脂穩(wěn)斑、抗炎等起到抗AS作用,但其是否能夠通過調控巨噬細胞極化抗AS值得進一步研究[8-9]?；诖?本研究擬選用ApoE-/-小鼠構建AS模型,探討PNS通過調控巨噬細胞極化防治AS的潛在機制。

1 材料與方法

1.1 動物與飼料

SPF級雄性ApoE-/-小鼠53只,同品系雄性C57BL/6J小鼠13只,6周齡,體質量20～24 g,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司,合格證號:SCXK(京)2021-0006。實驗所需基礎飼料和高脂飼料均購自小黍有泰(北京)生物科技有限公司,許可證號為SCXK(京)2018-0006。高脂飼料由83.5%基礎飼料+15%豬油+1.5%膽固醇構成。本實驗通過中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院動物倫理委員會批準(批件號:2022XLC047-2)。

1.2 實驗藥物

三七總皂苷購自昆藥集團股份有限公司(主要含三七皂苷 R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1及人參皂苷Rd等成分;標準品化學純度:86%),批號JK12022029;辛伐他汀片,購自華潤雙鶴利民藥業(yè)(濟南)有限公司,批號2104439。

1.3 主要實驗試劑

腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素-6(interleukin-6,IL-6)酶聯(lián)免疫吸附劑測定法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測試劑盒(聯(lián)科生物,貨號分別為A282H20841、A206H20131);油紅染液、蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin staining,HE)染液、多聚甲醛固定液(武漢賽維爾生物科技有限公司,貨號分別為:G1015、G1003、G1101);RNA提取液、2×SYBR Green qPCR Master Mix (None ROX)(武漢賽維爾生物科技有限公司,貨號分別為G3013、G3320);引物序列由武漢賽維爾生物科技有限公司合成。誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)抗體、精氨酸酶(Ariginase-1, Arg-1)抗體、CY3標記山羊抗兔IgG(武漢賽維爾生物科技有限公司,貨號分別為:GB11119-100、GB11285-100、GB21303),PBS緩沖液、DAPI染色試劑、抗熒光淬滅封片劑(武漢賽維爾生物科技有限公司,貨號分別為:G0002、G1012、G1401)。

1.4 主要實驗儀器

Chemray 800型全自動生化分析儀(深圳雷杜生命科技公司),Epoch型酶標檢測儀(美國Bio Tek公司),D3024R型臺式高速冷凍型微量離心機(北京大龍興創(chuàng)實驗儀器股份公司),Donatello型脫水機(意大利DIAPATH公司),JB-P5型包埋機(武漢俊杰電子有限公司),RM2016型病理切片機(上海徠卡儀器有限公司),CFX Connect型熒光定量PCR儀(美國Bio-rad公司),ETC811型PCR儀(北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司),KZ-5F-3D型三維冷凍研磨儀、MV-100型渦旋混勻儀、MC-700掌上離心機(武漢賽維爾生物科技有限公司),Nikon Eclipse E100型正置光學顯微鏡、Nikon DS-U3型成像系統(tǒng)(日本尼康公司),D70型照相機(日本佳能公司)。

1.5 動物分組、模型建立及給藥

適應性喂養(yǎng)1周后,予ApoE-/-小鼠高脂飼料以造模,予C57BL/6J小鼠基礎飼料,自由采食及進水8周[10]。隨機處死ApoE-/-小鼠3只、C57BL/6J小鼠3只,取胸主動脈,制作冰凍切片行油紅O染色以確認造模成功[11]。其余ApoE-/-小鼠按隨機數字表法分為5組,即模型組、PNS低劑量組、PNS中劑量組、PNS高劑量組、辛伐他汀組,每組10只。ApoE-/-小鼠繼續(xù)喂食高脂飼料,C57BL/6J小鼠繼續(xù)喂食基礎飼料,同時分別予PNS低劑量組、PNS中劑量組、PNS高劑量組組小鼠PNS 30 mg/(kg·d)、60 mg/(kg·d)、120 mg/(kg·d)灌胃[8,12],予辛伐他汀組小鼠辛伐他汀混懸液3.52 mg/(kg·d)灌胃[12],予模型組及空白組等體積生理鹽水灌胃,持續(xù)8周。

1.6 血清及組織標本采集

給藥8周后取材,取材前12小時禁食不禁水,1%戊巴比妥鈉(50 mL/kg)腹腔注射麻醉后摘眼球取血,室溫靜置2小時后,于4℃下4 000 r/min離心15分鐘,分離上清液后于-80℃冰箱內凍存,每組隨機選取6只用于檢測血脂及炎癥因子水平。打開胸腹腔,暴露心臟,分離主動脈,每組取3根完整主動脈置于4%多聚甲醛固定液中固定,用于大體油紅O染色;取3根連有心臟的胸主動脈置于4%多聚甲醛固定液中固定,用于HE染色及免疫熒光染色;取3根主動脈用于實時熒光定量聚合酶鏈式反應(Real-time PCR,RT-PCR)分析,剩余主動脈組織置于凍存管后迅速于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 檢測指標及方法

1.7.1 血脂檢測 全自動生化分析儀檢測血清中甘油三酯(triglyceride,TG)、總膽固醇(total cholesterol,TC)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)的含量。

1.7.2 ELISA法檢測血清中IL-6、TNF-α因子水平 嚴格按照ELISA試劑盒說明書操作,經包被、封閉、洗滌后依次按說明加入待檢樣品、抗體、酶結合物、顯色底物,并最終加入硫酸終止反應。用酶標儀在450 nm波長處依次測得各孔吸光度值,根據標準品濃度和吸光度值做出標準曲線,最后根據標準曲線方程計算出血清中IL-6、TNF-α的濃度。

1.7.3 主動脈大體油紅O染色 將固定好的主動脈剖開,先浸入60%的異丙醇3秒再于油紅O染液中37℃避光染色60分鐘后取出,浸入60%異丙醇分化至管腔內脂肪斑塊呈紅色、其他部位近無色,取出血管,濾紙吸除多余水分后鏡下觀察主動脈整體斑塊形成情況并采集圖像。Image-Pro Plus 6.0用于各組小鼠主動脈相對斑塊面積圖像分析。

1.7.4 主動脈竇部HE染色 將固定好的主動脈清洗、脫水后進行石蠟包埋,在主動脈竇處連續(xù)切取5 μm厚的組織切片,依次入環(huán)保型脫蠟液、無水乙醇、75%酒精后水洗,入蘇木素染液染色后水洗、分化、水洗、反藍、沖洗,再依次入85%、95%梯度酒精脫水后入伊紅染液染色,再依次入無水乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。鏡下觀察主動脈竇處AS病變情況并采集圖像。

1.7.5 免疫熒光標記檢測主動脈竇斑塊內巨噬細胞標志物iNOS和Arg-1的相對表達 將主動脈竇處的石蠟切片脫蠟處理,并進行抗原修復。PBS沖洗后用10%BSA封閉30分鐘,分別加入iNOS抗體(1∶500)和Arg-1抗體(1∶500),4°C孵育過夜,PBS洗滌后加入熒光二抗工作液(1∶300),室溫孵育50分鐘。DAPI染液染細胞核,避光室溫孵育10分鐘。滴加抗熒光淬滅劑封片后于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.7.6 RT-PCR檢測主動脈中巨噬細胞標志物iNOS和Arg-1 mRNA表達 用RNA提取液分別提取各組主動脈組織中的總RNA,并檢測RNA濃度及純度。按照試劑盒說明書進行反轉錄,然后進行PCR擴增,反應條件為95℃預變性30秒;95℃變性15秒,60℃退火30秒,40個循環(huán),每升溫0.5℃,采集一次熒光信號。選用β-actin作為內參基因,以2-△△CT法計算iNOS及Arg-1 mRNA的相對表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.8 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 PNS對ApoE-/-小鼠血脂的影響

與空白組相比,模型組TG、TC、LDL水平均明顯升高(P<0.01),HDL水平明顯降低(P<0.01);與模型組相比,中、高劑量的PNS及辛伐他汀可顯著降低血清TG水平(P<0.01),此外,低、中、高劑量的PNS及辛伐他汀均能顯著降低血清TC、LDL水平(P<0.01),同時中、高劑量的PNS可顯著升高血清HDL水平(P<0.01)。見表2。

表2 PNS對ApoE-/-小鼠血脂水平的影響

2.2 PNS對ApoE-/-小鼠血清炎癥因子的影響

與空白組相比,模型組血清IL-6、TNF-α水平顯著升高(P<0.01)。與模型組相比,PNS低、中、高劑量組及辛伐他汀組均能降低血清中IL-6、TNF-α水平,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表3。

表3 PNS對ApoE-/-小鼠血清炎癥因子的影響

2.3 PNS對ApoE-/-小鼠主動脈大體油紅O染色的影響

主動脈大體油紅O染色顯示,空白組小鼠主動脈無明顯紅染,未見明顯斑塊形成。模型組小鼠主動脈弓處可見大面積紅染斑塊,胸、腹主動脈處可見大量散在的點、片狀紅染斑塊。與模型組小鼠相比,PNS各劑量組的紅染斑塊面積隨劑量的增加而逐漸減少。辛伐他汀亦能減少小鼠主動脈的斑塊面積。斑塊面積占主動脈總面積的定量分析表明,與空白組相比,模型組的相對斑塊面積顯著增加(P<0.05);與模型組相比,PNS中、高劑量組及辛伐他汀組均能顯著降低主動脈相對斑塊面積(P<0.05),PNS低劑量組亦能降低主動脈斑塊面積(P>0.05)。見圖1,表4。

圖1 PNS對ApoE-/-小鼠主動脈大體油紅O染色的影響

表4 PNS對ApoE-/-小鼠主動脈相對斑塊面積的影響

2.4 PNS對ApoE-/-小鼠主動脈HE染色的影響

主動脈竇HE染色顯示,空白組小鼠主動脈內膜結構完整、連續(xù)且表面光滑,未見AS斑塊形成;模型組小鼠主動脈內膜結構紊亂,可見凸向管腔的大面積AS斑塊,其內有大量泡沫細胞聚集,同時伴有膽固醇結晶沉積。各劑量PNS及辛伐他汀干預后,主動脈內膜結構較模型組均有所改善,AS斑塊明顯減少,病變程度明顯減輕。見圖2。

圖2 PNS對ApoE-/-小鼠主動脈竇HE染色的影響(HE染色,×100)

2.5 PNS對ApoE-/-小鼠主動脈竇處斑塊內M1型、M2型巨噬細胞標志物熒光強度的影響

圖像中,藍色為細胞核,紅色為iNOS陽性表達,綠色為Arg-1陽性表達。與空白組相比,模型組的iNOS熒光強度增強;與模型組相比,經PNS各劑量組及辛伐他汀干預后M1型巨噬細胞標志物iNOS熒光強度降低,且PNS降低主動脈竇斑塊內iNOS效果較辛伐他汀明顯。與空白組相比,模型組Arg-1熒光強度變化不明顯;與模型組相比,PNS干預后主動脈竇斑塊內M2型巨噬細胞標志物Arg-1熒光強度增強,辛伐他汀組Arg-1熒光強度較模型組有所增強,但強度不及PNS各劑量組。見圖3。

圖3 PNS對ApoE-/-小鼠主動脈竇處斑塊內M1型、M2型巨噬細胞標志物熒光強度的影響(×200,50μm)

2.6 PNS對ApoE-/-小鼠主動脈中M1型、M2型巨噬細胞標志物表達的影響

與空白組相比,模型組主動脈的M1型巨噬細胞標志物iNOS mRNA的相對表達顯著升高(P<0.01),M2型巨噬細胞標志物Arg-1 mRNA的相對表達顯著降低(P<0.01)。與模型組相比,PNS低、中、高劑量組及辛伐他汀組均能夠顯著降低主動脈iNOS mRNA的相對表達(P<0.01),PNS低、中、高劑量組還可顯著增加主動脈Arg-1 mRNA的相對表達(P<0.01)。見表5。

表5 PNS對ApoE-/-小鼠主動脈中M1型、M2型巨噬細胞標志物mRNA表達的影響

3 討論

《中國心血管健康與疾病報告2021》[13]顯示,我國目前心血管病(cardiovascular disease,CVD)患病人數已達到3.3億,且CVD患病率仍處于上升階段,CVD已成為我國重大公共衛(wèi)生問題。AS是CVD的病理基礎,防治AS刻不容緩。

血脂異常是導致AS發(fā)生和發(fā)展的主要危險因素之一。脂蛋白,特別是LDL-C通過受損的內皮細胞在血管內膜處過度沉積,并經過氧化修飾成為氧化型低密度脂蛋白(oxidizedlowdensitylipoprotein,ox-LDL),進一步損害內皮細胞,觸發(fā)單核細胞的募集、激活并分化為巨噬細胞,巨噬細胞通過清道夫受體吞噬ox-LDL,轉換為泡沫細胞,形成AS的早期病變即脂質條紋,隨后平滑肌細胞增殖、遷移,膠原纖維增多,進一步發(fā)展為AS斑塊[14]。大量研究證實,血脂水平與AS病變程度關系密切,血清LDL-C水平的升高可促進主動脈根部脂質的沉積,而當特定基因的敲除導致血漿脂質水平顯著降低時,AS病變面積及斑塊厚度顯著減少,同時伴隨著巨噬細胞的浸潤減少[15-16]。與既往研究結果一致,本研究結果表明PNS可顯著降低血脂水平,減少AS斑塊面積,對AS有較好的干預作用。

血管炎癥是動脈粥樣硬化進展和斑塊破裂的關鍵驅動因素,抑制炎癥反應對于AS的防治具有重要意義。其中,炎性細胞因子是抗炎治療的重要干預靶點[17-18]。IL-6及TNF-α是與AS發(fā)生密切相關的炎性因子[19-21]。一項針對有高AS風險但無任何臨床炎癥表現人群的RESCUE研究指出,IL-6抑制劑能夠顯著降低與AS相關的炎癥反應,且效果呈劑量依賴性[21-22];Nallasamy等[23]的體內外研究亦表明,降低TNF-α水平可減少單核細胞對血管內皮細胞的粘附,進而減輕血管內皮炎癥反應,起到心肌保護作用。本研究中PNS干預8周可以顯著降低AS模型小鼠血清中IL-6及TNF-α水平,減輕AS炎癥反應的程度。

巨噬細胞極化在AS的形成中扮演重要角色,能夠影響AS斑塊內的炎癥反應及斑塊穩(wěn)定性[24]。研究發(fā)現調控巨噬細胞極化過程中抗炎與促炎表型之間的平衡,是治療AS的重要作用靶點。Song等[25]的體內外研究證實過表達miR-30a-5p可降低M1型/M2型巨噬細胞的比率,進而降低血漿中IL-6、TNF-α等促炎因子水平,增加抗炎因子水平,同時明顯減少主動脈根部病變面積。Laura等[26]研究發(fā)現,通過特異性敲除白細胞分化抗原40上調M2型巨噬細胞標志物相關基因的表達后,炎癥相關基因的表達顯著降低,AS斑塊的病變程度和斑塊穩(wěn)定性亦隨之改善。本研究發(fā)現,PNS干預AS模型小鼠8周后,M2型巨噬細胞標志物Arg-1的表達顯著升高,M1型巨噬細胞標志物iNOS的表達顯著降低,表明PNS可通過調控巨噬細胞極化,即促進M1型巨噬細胞極化、抑制M2型巨噬細胞極化,進而改善炎癥反應,起到AS治療效果。

綜上,PNS干預能夠降低AS模型小鼠的血脂水平,抑制炎癥因子IL-6及TNF-α的分泌,減少AS斑塊面積,這可能與PNS可減少M1型促炎巨噬細胞的極化,增加M2型抗炎巨噬細胞極化,進而減輕炎癥反應有關。本研究為臨床進一步探究PNS抗AS的效應機制提供了新的理論依據,但其干預巨噬細胞極化的具體途徑仍有待進一步研究。