李新荻,王 宇,盧 鴻,羅布白珍,何辰慶,段夢(mèng)琪,葉幼榮,張 健,商 鵬*

(1. 西藏農(nóng)牧學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,西藏 林芝 860000;2. 西藏特色農(nóng)牧資源研發(fā)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心,西藏 林芝 860000;3. 林芝市巴宜區(qū)畜牧獸醫(yī)總站,西藏 林芝 860000)

前纖維蛋白1(Profilin-1,PFN1)是一種在組織中廣泛表達(dá)的基因,幾乎與所有細(xì)胞功能相關(guān)聯(lián),是進(jìn)化過(guò)程中高度保守的肌動(dòng)蛋白單體結(jié)合蛋白(G-actin),分子量為12～15 kDa[1]。骨骼肌由肌纖維組成,肌原纖維是骨骼肌收縮的物質(zhì)基礎(chǔ);肌原纖維由粗、細(xì)肌絲構(gòu)成,肌動(dòng)蛋白為細(xì)肌絲的重要組分之一[2]。PFN1作為Profilin家族的首要成員,通過(guò)介導(dǎo)G-actin聚合影響細(xì)胞骨架的動(dòng)態(tài)重組以響應(yīng)胞內(nèi)外信號(hào),來(lái)調(diào)控許多重要的細(xì)胞活動(dòng)過(guò)程[3]例如,細(xì)胞分裂和分化、細(xì)胞形態(tài)建成和保持等[4]。目前,對(duì)于PFN1基因的研究主要集中在因其缺失引起的細(xì)胞功能障礙和突變導(dǎo)致的癌癥引發(fā)機(jī)制上[1],關(guān)于PFN1基因在骨骼肌中的功能探索尚處于空白,在豬上的相關(guān)研究亦未見(jiàn)報(bào)道。

藏豬是我國(guó)唯一的高原、高寒放牧型豬種[5],多采用放牧為主、舍飼為輔的傳統(tǒng)養(yǎng)殖方式,其育肥豬增重緩慢、育肥期甚長(zhǎng)[6]。藏豬以其胴體肉質(zhì)細(xì)嫩、多汁、色鮮、味美與獨(dú)有的地域特色風(fēng)味[7],成為消費(fèi)者的饋贈(zèng)佳品與餐桌佳肴。藏豬為小型豬種,發(fā)育期長(zhǎng)、生長(zhǎng)緩慢[6],難以滿足藏豬肉市場(chǎng)消費(fèi)的漲幅,如何在保證肉質(zhì)的前提下提高藏豬肉產(chǎn)量成為當(dāng)下亟待解決的問(wèn)題。本研究選用了30、90、180日齡三個(gè)不同生長(zhǎng)階段的西藏本土小型豬—藏豬,快速生長(zhǎng)型豬—大約克豬為研究對(duì)象;通過(guò)對(duì)PFN1基因多態(tài)性與mRNA表達(dá)規(guī)律分析,初步探索PFN1基因在藏豬與大約克豬骨骼肌中的作用,為后續(xù)改良藏豬肉品質(zhì)同時(shí)提高藏豬肉產(chǎn)量的研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

采集藏豬(n=40,飼養(yǎng)于西藏某藏豬開(kāi)發(fā)有限公司)、大約克豬(n=40,飼養(yǎng)于林芝市某生態(tài)農(nóng)業(yè)開(kāi)發(fā)有限公司)耳組織樣品,置于75%酒精中,-20 ℃保存,用于后續(xù)DNA提取。分別在30日齡(哺乳期結(jié)束)、90日齡(保育期結(jié)束)、180日齡(快速生長(zhǎng)期)各隨頭機(jī)挑選8頭藏豬、7頭大約克豬屠宰,采集腿肌、背最長(zhǎng)肌組織樣品,迅速放入液氮,轉(zhuǎn)置于-80 ℃保存,用于RNA提取。

1.2 DNA、RNA提取及cDNA制備

用苯酚-氯仿抽提法提取豬DNA,-20 ℃保存?zhèn)溆?。用Trizol提取法進(jìn)行總RNA提取;用快速反轉(zhuǎn)錄cDNA試劑盒(北京天根生化科技有限公司,KR180123)合成cDNA,-20 ℃保存?zhèn)溆?。用NanoDrop 2000(Thermo公司生產(chǎn))分別檢測(cè)DNA、RNA的純度和濃度;1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA、RNA的完整性。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

1.3.1 基因分型引物 登錄GenBank下載豬PFN1基因CDS區(qū)(登錄號(hào):NM_001244416.1)與啟動(dòng)子區(qū)域的DNA序列(登錄號(hào):NC_010454.4),使用Primer Premier 5.0軟件及NCBI BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)網(wǎng)站設(shè)計(jì)基因分型引物(表1)。

表1 PFN1基因5'側(cè)翼區(qū)、CDS區(qū)引物信息Table 1 5'-flanking region of PFN1 gene and primer information of CDS region

1.3.2 定量引物 下載GenBank中豬PFN1的mRNA序列,以GAPDH作為內(nèi)參基因,利用NCBI BLAST網(wǎng)站(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)設(shè)計(jì)RT-qPCR引物(表2),用于基因的組織表達(dá)分析。以上引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表2 PFN1基因和GAPDH基因定量引物信息Table 2 Quantitative primer information of PFN1 gene and GAPDH gene

1.4 PCR擴(kuò)增與測(cè)序

以藏豬和大約克豬的cDNA、DNA為模板,分別擴(kuò)增PFN1基因的CDS區(qū)域、5'UTR啟動(dòng)子區(qū)域;PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。采用Sanger測(cè)序法對(duì)條帶明亮單一,長(zhǎng)度正確的PCR產(chǎn)物進(jìn)行混池測(cè)序(TP、YP各10頭)和個(gè)體測(cè)序(TP、YP各40頭)。

1.5 基因頻率、基因型頻率和轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)

使用ChromasPro和SnapGene軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析,統(tǒng)計(jì)各個(gè)突變位點(diǎn)的基因型頻率和基因頻率;用在線軟件JASPAR(http://jaspar.genereg.net/)對(duì)PFN1基因的SNPs位點(diǎn)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)。

1.6 RT-qPCR

以cDNA為模板,以GAPDH作為內(nèi)參基因,檢測(cè)PNF1基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量;每個(gè)樣品組設(shè)置3個(gè)重復(fù);qRT-PCR 20 μL反應(yīng)體系:SYBR Green Mix(北京天根生化科技有限公司,FP171206)10 μL;上、下游引物(10 μmol/L)各0.6 μL;RNase-free ddH2O 7.8 μL;cDNA模板1 μL。qRT-PCR擴(kuò)增程序:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s;59 ℃退火30 s;72 ℃延伸20 s;72 ℃延伸5 min;共40個(gè)循環(huán)。mRNA的相對(duì)表達(dá)量使用2-ΔΔCt法[8]進(jìn)行計(jì)算。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

利用IBM SPSS Statistics 23軟件測(cè)定PFN1基因表達(dá)量的差異顯著性,測(cè)定結(jié)果以P值(P-value)表示:P<0.05 時(shí)差異顯著,P<0.01 時(shí)差異極顯著,P>0.05 時(shí)差異不顯著[9];使用Pearson's chi-squared test、Fisher Exact test對(duì)PFN1基因的基因型頻率和基因頻率進(jìn)行卡方檢驗(yàn)(χ2- test):χ2越大,樣本的實(shí)際觀測(cè)值與理論推斷值之間的偏離程度越大;χ2越小,二者偏差越小;表明理論值與觀測(cè)值越相符。

2 結(jié)果與分析

2.1 SNPs位點(diǎn)

Sanger測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn),在PFN1基因5'UTR起始密碼子上游2 500 bp啟動(dòng)子區(qū)域共發(fā)現(xiàn)3個(gè)SNPs位點(diǎn)(圖1):-31 bp處發(fā)現(xiàn)T/C突變,記為T(mén)-31C;-1401 bp處發(fā)現(xiàn)A/G突變,記為A-1401G;-1542 bp處發(fā)現(xiàn)C/T突變,記為C-1542T。PFN1基因CDS區(qū)無(wú)突變。

圖1 PFN1 基因突變位點(diǎn)測(cè)序峰圖a. T-31C位點(diǎn);b. A-1401G;c. C-1542TFig.1 Sequencing peak of PFN1 mutation sitesa. The T-31C site; b. The A-1401G site; c. The C-1542T site

2.2 基因頻率和基因型頻率

由表3可知,在PFN1基因5'UTR啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)現(xiàn)3個(gè)SNPs位點(diǎn),其中A-1401G、C-1542T為連鎖突變位點(diǎn)(即A-1401G位點(diǎn)出現(xiàn)A到G堿基的突變,同時(shí)存在C-1542T位點(diǎn)C到T堿基的突變)。在T-31C位點(diǎn)存在TT、TC、CC三種基因型,藏豬優(yōu)勢(shì)等位基因型為CC型;在A-1401G位點(diǎn)存在AA、AG、GG三種基因型,藏豬優(yōu)勢(shì)等位基因型為GG型;在C-1542T位點(diǎn)存在CC、CT、TT三種基因型,藏豬優(yōu)勢(shì)等位基因型為T(mén)T型。于藏豬與大約克豬中的等位基因頻率和基因型頻率均存在極顯著差異(P<0.01);兩個(gè)豬品種內(nèi)均符合Hardy-Weinberg平衡[10](P>0.05)。

表3 PFN1基因多態(tài)性位點(diǎn)基因型頻率和等位基因頻率Table 3 Genotype distribution and allele frequency of PFN1 Gene polymorphic site

表4 PFN1基因SNPs位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)結(jié)果 Table 4 Transcription factors prediction result of PFN1 gene SNPs

2.3 轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)

通過(guò)在線網(wǎng)站對(duì)5'UTR啟動(dòng)子區(qū)域的3個(gè)SNPs位點(diǎn)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn):T-31C、A-1401G、C-1542T突變后產(chǎn)生ASCL1、ASCL2、MYOG、MAZ、PLAGL2、Atoh1、Hand2、SREBF1等8個(gè)新的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn);其中,T-31C的突變導(dǎo)致FERD3L結(jié)合位點(diǎn)消失;C-1542T的突變導(dǎo)致MEIS1結(jié)合位點(diǎn)消失。

2.4 骨骼肌發(fā)育過(guò)程中PFN1基因的差異表達(dá)

由圖2可以看出,PFN1基因在藏豬與大約克豬的腿肌、背最長(zhǎng)肌中的相對(duì)表達(dá)量差異不顯著(P>0.05)。在30日齡,PFN1基因在藏豬和大約克豬腿肌與背最長(zhǎng)肌中的mRNA表達(dá)水平均高于90日齡與180日齡同組織,且30日齡在不同品種間PFN1基因表達(dá)量無(wú)顯著差異(P>0.05);90日齡時(shí),藏豬在腿肌中PFN1基因mRNA表達(dá)量顯著低于大約克豬(P<0.05),在背最長(zhǎng)肌中mRNA表達(dá)量極顯著低于大約克豬(P<0.01);180日齡時(shí),藏豬兩組織中mRNA表達(dá)量皆極顯著低于大約克豬(P<0.01)。PFN1基因的表達(dá)水平隨著兩豬種生長(zhǎng)日齡的增加,在骨骼肌組織中呈整體下降的趨勢(shì)。

圖2 藏豬與大約克豬不同發(fā)育時(shí)期PFN1基因在腿肌和背最長(zhǎng)肌中的mRNA表達(dá)量*為差異顯著(P<0.05),**為差異極顯著(P<0.01)Fig. 2 mRNA expression levels of PFN1 gene in the leg muscle and longissimus dorsi muscle of Tibet pigs(TP) and Yorkshire pigs(YP) at different development stages* indicates significant difference (P<0.05), ** indicates highly significant difference (P<0.01)

3 討 論

動(dòng)物細(xì)胞中profilin具有兩種不同的功能:一方面,profilin結(jié)合G-actin調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白動(dòng)態(tài)重組來(lái)響應(yīng)胞內(nèi)外信號(hào),從而調(diào)控細(xì)胞的增殖、生長(zhǎng)、存活、遷移等活動(dòng)[11];另一方面,profilin可促進(jìn)ATP/ADP交換,將G-actin-ATP定位到能提高肌動(dòng)蛋白裝配的微絲正端,促進(jìn)單體結(jié)合到微絲上使微絲組成肌原纖維[12]。據(jù)Alkam D等研究,PFN1氨基酸序列在脊椎動(dòng)物和低等生物上高度保守[1]。本試驗(yàn)克隆了豬PFN1基因的CDS區(qū)域并同源序列做比對(duì),發(fā)現(xiàn)無(wú)突變位點(diǎn)的存在,證實(shí)了該項(xiàng)觀點(diǎn)。

RT-qPCR結(jié)果顯示,PFN1基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量在骨骼肌中30日齡最高,隨日齡增加而下降。有研究表明豬肌纖維數(shù)目在妊娠期已被固定,出生后骨骼肌生長(zhǎng)主要通過(guò)肌纖維體積的增大實(shí)現(xiàn)[13]。Witke等[14]發(fā)現(xiàn),在小鼠中PFN1是胚胎發(fā)育的所有階段存在普遍表達(dá)的基因,敲除PFN1基因致使小鼠胚胎細(xì)胞在兩細(xì)胞階段由于細(xì)胞分裂中的缺陷而停滯,該研究證明PFN1基因?qū)τ趥€(gè)體早期的細(xì)胞增殖發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。由此推測(cè),PFN1基因高表達(dá)于骨骼肌發(fā)育早期,調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖與分化;而個(gè)體出生后肌纖維數(shù)目不再改變或增加,PFN1基因?qū)±w維細(xì)胞的增殖等作用開(kāi)始逐漸減弱,這可能是豬PFN1基因表達(dá)水平隨日齡增加而逐步下降并且在不同骨骼肌組織中其表達(dá)趨勢(shì)呈基本一致的原因。本試驗(yàn)中T-31C、A-1401G突變位點(diǎn)結(jié)合的新轉(zhuǎn)錄因子MyoG參與驅(qū)動(dòng)骨骼肌纖維的終末分化[15],Koki等[16]發(fā)現(xiàn)若敲除MyoG,骨骼肌成肌細(xì)胞分化為正常的肌纖維受到抑制并表現(xiàn)為出生后高致死率;高表達(dá)MyoG則加速成肌細(xì)胞分化成熟、肌管融合,MAZ協(xié)同促進(jìn)肌細(xì)胞分化的過(guò)程[17]。關(guān)聯(lián)SNPs位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)與定量結(jié)果分析,PFN1基因在肌細(xì)胞中的作用一致且符合機(jī)體發(fā)育規(guī)律。

肌纖維是骨骼肌的基本單位,肌間脂肪含量、肌纖維直徑等因素對(duì)嫩度影響顯著[18]。有研究表明,隨著肌纖維直徑的增大,肌肉嫩度相應(yīng)降低;肌纖維越細(xì),密度越大,肌肉脂肪含量越高,肉質(zhì)越細(xì)嫩[19]。說(shuō)明肌纖維直徑與肌內(nèi)脂肪是影響肉品嫩度的重要因素。據(jù)趙韶華研究,在自發(fā)性高血壓大鼠肥大心肌組織中,PFN1基因的表達(dá)上調(diào),伴隨心肌細(xì)胞肥大、膠原纖維增生和肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架受損,而沉默PFN1基因則有助于減輕心肌纖維化程度[20]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,在腿肌與背最長(zhǎng)肌中,90、180日齡藏豬的表達(dá)量均顯著或極顯著低于大約克豬。由此推測(cè),PFN1基因調(diào)控細(xì)胞骨架穩(wěn)態(tài)以保持肌纖維細(xì)胞形態(tài);而藏豬中PFN1的低表達(dá)量抑制了肌纖維直徑的增大從而保持藏豬的骨骼肌肌肉嫩度。本試驗(yàn)中A-1401G、C-1542T兩個(gè)連鎖突變位點(diǎn)結(jié)合的新轉(zhuǎn)錄因子PLAGL2通過(guò)調(diào)節(jié)小GTP酶影響細(xì)胞骨架形態(tài)[21]。SREBF1對(duì)脂肪沉積有正向調(diào)控作用,增加均可顯著促進(jìn)細(xì)胞中脂滴的形成[22]。提示SREBF1和PLAGL2協(xié)同作用,抑制肌纖維直徑增大同時(shí)提高了肌纖維與肌束間的脂肪含量[23]。綜上表明,這兩個(gè)連鎖突變位點(diǎn)可能是調(diào)控PFN1基因表達(dá)形成藏豬豬肉的嫩度、風(fēng)味俱佳的關(guān)鍵原因之一,可作為分子標(biāo)記[24]。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn),豬的PFN1基因3個(gè)SNPs位點(diǎn)的多態(tài)性與骨骼肌中mRNA的差異表達(dá)相關(guān);推測(cè)這3個(gè)SNPs位點(diǎn)引起的轉(zhuǎn)錄因子變化可能是調(diào)控其表達(dá)的關(guān)鍵作用位點(diǎn)。因此,PFN1可作為骨骼肌早期發(fā)育和肉質(zhì)性狀新的候選基因,為后續(xù)闡明PFN1基因在豬生長(zhǎng)發(fā)育中的分子作用機(jī)制與分子標(biāo)記輔助育種提供新思路和理論依據(jù)。