石洪超， 陳明權(quán)， 商雪瑩， 李華， 孫東， 覃仁安， 何風雷

（1.廣州白云山陳李濟藥廠有限公司，廣東廣州 510288；2.廣東省藥品檢驗所，廣東廣州 510663）

廣陳皮為經(jīng)典的藥食同源產(chǎn)品，其中來源于茶枝柑，Citrus reticulata‘Chachi’的果皮稱為“廣陳皮”，為道地藥材，主產(chǎn)于兩廣地區(qū)。傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論及歷代本草論述中均認為廣陳皮“陳久者良”，是指廣陳皮需放置陳化后才能作為藥用，且陳化時間越久，藥效越好[1]。在廣陳皮的市場流通過程中，陳化年份對廣陳皮的價格也具有決定性的影響，從而產(chǎn)生了“一兩陳皮一兩金，百年陳皮勝黃金”的說法。但對于廣陳皮年份的判定，并沒有相關(guān)的統(tǒng)一標準及規(guī)定，基本靠陳皮銷售者自律和采購者的經(jīng)驗鑒別，為維護陳皮市場健康穩(wěn)定的發(fā)展，建立廣陳皮年份準確、快速的判定方法在陳皮市場行業(yè)中尤為重要。

廣陳皮在陳化過程中會出現(xiàn)外觀顏色差異與氣味差異，也是經(jīng)驗判別廣陳皮陳化年份的重要參考。外觀顏色易受到干燥方式、儲存條件、加工炮制方法等因素的影響而發(fā)生改變[2-3]，而氣味差異預示著不同陳化年份廣陳皮中的揮發(fā)油成分處于動態(tài)變化之中。相對而言，內(nèi)在的成分指標更為穩(wěn)定，因此，從揮發(fā)油成分的角度探索廣陳皮隨陳化年份的變化規(guī)律是可行的、合理的。目前，針對不同陳化年份廣陳皮的揮發(fā)油變化已有諸多研究[4-5]，但對于揮發(fā)油成分變化趨勢及與年份間的內(nèi)在規(guī)律未能闡述清楚，難以準確地鑒別廣陳皮年份。因此，本研究以自然陳化的廣陳皮為研究對象，探尋揮發(fā)油成分與陳化年份之間的規(guī)律，以期建立一種廣陳皮陳化年份的鑒別模型，既可真實、客觀地反映不同年份廣陳皮之間氣味差異的成分變化，又可快速、準確地鑒別出廣陳皮的陳化年份，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料

1.1 試驗樣品為保證用于建立模型的樣品陳化年份的可靠性，本試驗樣品直接從在廣陳皮道地產(chǎn)區(qū)且建立廣陳皮規(guī)范化產(chǎn)業(yè)化種植基地的公司購買，其中編號為CP1 ～CP6 購自江門市新會區(qū)柑滿園食品有限公司（種植基地位置為22°23’25”N、113°7’20”E），CP7 ～CP10 購自江門市蓬江區(qū)高品農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司（種植基地位置為22°19’59”N、113°6’42”E）。本研究所用樣品均由廣州中醫(yī)藥大學中藥鑒定教研室主任黃海波副教授鑒定為蕓香科植物茶枝柑，Citrus reticulate‘Chachi’的果皮，樣品詳細信息見表1。

表1 廣陳皮樣品信息表Table 1 Sample information sheet of Guangdong Citri Reticulatae Pericarpium

1. 2 儀器7890B-5977A 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Agilent 公司）；75 μm PDMS/DVB 固相微萃取儀-纖維頭（美國SUPELCO 公司，灰色）；BS110S型電子分析天平（德國賽多利斯公司）；WXJ 型粉碎機（上海凱旋中藥機械制造有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品制備將廣陳皮樣品剪碎成邊長1 cm的小方塊，取1.0 g 于250 mL 頂空瓶中，密封后于90 ℃水浴平衡10 min，插入固相萃取纖維50/30 μm CAR/DVB/PDMS頂空萃取40 min，250 ℃解吸3 min進樣。

2.2 測定條件色譜條件：采用安捷倫HP-5 MS（30 mm × 0.25 mm × 0.25 μm）色譜柱，高純He 作為載氣，流速為1.0 mL/min，進樣口溫度為230 ℃，采用程序升溫模式，柱初始溫度為50 ℃，保持2 min；以3 ℃/min 的速率升至70 ℃，保持10 min；以8 ℃/min的速率升至110 ℃，保持5 min；以4 ℃/min的速率升至210 ℃，保持2 min。分流比為30∶1。質(zhì)譜（MS）條件：離子源溫度230 ℃，電子能量70 eV，離子采集范圍35 ～450，m/，z。廣陳皮樣品GC/MS色譜圖，見圖1。

2.3 揮發(fā)油測定結(jié)果所得質(zhì)譜數(shù)據(jù)與NIST14數(shù)據(jù)庫進行匹配后，將每組數(shù)據(jù)進行整理，選擇其中每個峰的高匹配成分（定性匹配度＞80）。10 組（8個不同陳化年份）廣陳皮共匹配出75個揮發(fā)油成分，其中共同含有的揮發(fā)性成分有17 個，編號為S1 ～S17，見表2。各成分在不同陳化年份的廣陳皮中相對含量存在明顯差異，且與陳化年份呈現(xiàn)上升、下降或先上升再下降等多種變化趨勢。

表2 不同陳化年份的廣陳皮中共有揮發(fā)性成分Table 2 Total volatile components in Guangdong Citri Reticulatae Pericarpium of different aging years

2. 4 揮發(fā)油成分隨儲存廣陳皮年份變化規(guī)律分析為探尋共有成分與不同陳化年份之間的相關(guān)性，采用SPSS 19.0 軟件對17 個共有成分分別與陳化年份進行Pearson 相關(guān)性分析，其中有8 個成分與陳化年份具有一定的相關(guān)性，見表3。成分S9、S16、S17 與年份具有非常顯著相關(guān)性（P＜0.01），S6、S7、S8 與陳化年份具有顯著相關(guān)性（P≤0.05），成分S4、S15 雖然與年份的相關(guān)性不顯著（P＞0.05），但考慮到其Pearson 相關(guān)系數(shù)絕對值均大于0.7，也認為成分S4、S15 與陳化年份之間具有一定的相關(guān)性。由表2 可看出：成分S4、S6、S7、S8、S15 整體上呈現(xiàn)出隨著陳化年份增加，其相對含量逐漸減少的趨勢；而成分S9、S16、S17 則呈現(xiàn)隨著陳化年份增加，其相對含量也逐漸增加的趨勢。因此，擬將上述8個共有成分納入與年份變化規(guī)律的研究范疇。

表3 不同陳化年份廣陳皮中的8個共有成分與陳化年份之間的相關(guān)性分析結(jié)果Table 3 Correlation analysis results between 8 common components in Guangdong Citri Reticulatae Pericarpium of different aging years and aging years

將與年份呈負相關(guān)的成分（S4、S6、S7、S8、S15）分別排列組合作為分子組，與年份呈正相關(guān)的成分（S9、S16、S17）分別排列組合作為分母組，將每個分子組分（FZ）和分母組分（FM）分別進行比較，為顧及成分組合的完整性和包容性，分子組與分母組均盡量包含2個及以上的成分，并結(jié)合篩選條件（①優(yōu)選分子與分母中含數(shù)量較多的成分，②成分與年份的相關(guān)性，P＜0.01 或其相對含量＞0.05%），篩選出與年份呈連續(xù)下降或上升趨勢的比值，見表4。最終選定“S9+S16”成分組合作為分母，“S4+S6+S7+S8”與“S4+S6+S7+S8+S15”成分組合作為分子，2 組比值均與年份呈連續(xù)下降的趨勢，結(jié)果見表5。

表4 廣陳皮中與年份呈連續(xù)變化趨勢的組合匯總Table 4 Summary of combinations with continuous trend with year in Guangdong Citri Reticulatae Pericarpium

表5 廣陳皮中與年份呈連續(xù)變化趨勢的組合比值Table 5 Ratio of combinations with continuous trend with year in Guangdong Citri Reticulatae Pericarpium

2.5 建立陳化年份判別模型以陳化年份作為自變量（X），以2 組比值分別作為因變量（Y），采用SPSS 19.0 軟件對上述2 組比值分別采用11 種模型進行曲線模擬，上述2組比值分別作為因變量在進行曲線模擬后，發(fā)現(xiàn)比值（S4+S6+S7+S8）/（S9+S16）的各模型方程在整體上相關(guān)系數(shù)R2 高，說明本成分組比值可以更好地反映陳化年份變化規(guī)律的真實情況，結(jié)果見表6。

表6 2組比值因變量的模型相關(guān)系數(shù)Table 6 Model correlation coefficients for 2 sets of ratio dependent variables

陳化年份作為自變量（X），以比值（S4+S6+S7+S8）/（S9+S16）分別作為因變量（Y），進行曲線模擬，在所有的曲線模擬模型中，優(yōu)先選擇模型相關(guān)系數(shù)（R2）最高的曲線；由表7、表8 可知，“復合”“增長”“指數(shù)”以及“Logistic”模型相關(guān)系數(shù)最高且一致（R2= 0.949），且4 種模型相應的模擬曲線圖完全一致，見圖2。因此，4 個方程表達式實為同一函數(shù)，綜合考慮到上述4 種方程在實際應用中的運算復雜性，最終選擇復合方程，Y= 613.555×0.893，X（R2=0.949）作為判別不同陳化年份的廣陳皮的模型。

圖2 4種廣陳皮陳化年份判別模型方程擬合曲線圖Figure 2 Fitting curves of the model equations for determining the ageing years of 4 types of Guangdong Citri Reticulatae Pericarpium

表7 廣陳皮陳化年份判別模型匯總和參數(shù)估計值Table 7 Summary and parameter estimates of the model for determining the ageing year of Guangdong Citri Reticulatae Pericarpium

表8 4種廣陳皮陳化年份判別模型方程表達式Table 8 Expression of the model equation for determining the ageing year of 4 kinds of Guangdong Citri Reticulatae Pericarpium

3 討論

對于自然陳化的廣陳皮，可以通過人體嗅覺發(fā)現(xiàn)3、10、20、30年等年份跨度較大的廣陳皮氣味依次為果香味、清香撲鼻、陳香醇厚及藥香陳味，這意味著不同年份廣陳皮在陳化過程中出現(xiàn)動態(tài)變化的揮發(fā)油成分涉及多個成分（4 個及以上），而非單一成分。

現(xiàn)代研究表明，廣陳皮揮發(fā)油變化規(guī)律較為復雜，隨著陳化年份的增加，揮發(fā)油的總量變化有不同的研究結(jié)論[6-7]，歸結(jié)于影響陳皮揮發(fā)油的因素有很多，包括廣陳皮自身采摘期、儲存條件以及揮發(fā)油的提取方式等。因此，在探索不同陳化年份的廣陳皮揮發(fā)油變化規(guī)律過程中，試驗樣品的選擇及揮發(fā)油的提取方式尤為重要。

關(guān)于試驗樣品的選擇方面，根據(jù)地方標準《DB4407/T70-2021 地理標志產(chǎn)品新會陳皮》中規(guī)定的“廣陳皮”需在自然陳化環(huán)境下保存時間3年或以上[8]。另有研究顯示，陳化年份大于5 年的廣陳皮具有特定波段的吸收[9]，且揮發(fā)性成分的含量趨于穩(wěn)定[10]。因此，本研究以自然陳化5 年以上的廣陳皮為研究對象，探尋其揮發(fā)油成分與陳化年份之間的規(guī)律。在揮發(fā)油提取方式的選擇上，本研究采用SPME 技術(shù)提取陳皮樣品中揮發(fā)油成分，與傳統(tǒng)的揮發(fā)油提取技術(shù)不同的是，SPME 技術(shù)既不會破壞陳皮樣品又能使揮發(fā)油成分被充分提取，節(jié)省提取時間，操作便捷，符合快速檢驗的目的。

本研究對參與模型擬定的揮發(fā)油成分，不僅要求成分與年份具有一定的相關(guān)性，而且為了能綜合全面地反映揮發(fā)性成分的動態(tài)變化，分子與分母成分組中包含的揮發(fā)油成分數(shù)量均在2個及以上，且規(guī)定各組合的相對含量以及各組合之間產(chǎn)生的比值均與年份呈連續(xù)下降或上升的趨勢，相較于其他研究[11]中單一的分子與分母的組合，本法更能真實地反映出揮發(fā)油與年份的變化規(guī)律。最后進行函數(shù)擬合所得到的模型相關(guān)系數(shù)，R2為0.949，表明本法擬合的方程模型判別廣陳皮年份的準確率更高。以本擬合函數(shù)作為廣陳皮陳化年份的判別模型是可行的、準確的。但本年份判別模型是否適用于陳化5 年以下、33 年以上的廣陳皮，尚有待于相應陳化年份的陳皮樣品作進一步驗證。