張?zhí)锰茫?顏先偉， 林鈺， 雷海青， 黃偉樂， 劉靖，3

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東廣州 510405；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)嶺南醫(yī)學(xué)研究中心，廣東廣州 510405；3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東廣州 510405）

銀屑?。╬soriasis）是臨床難治的慢性復(fù)發(fā)性、炎癥性皮膚疾病，以紅斑、鱗屑、瘙癢為主要表現(xiàn)?！吨T病源候論·干病候》中稱之為“干癬，但有匡郭，皮枯索癢，搔之白屑出是也”?！锻饪谱C治全書》中詳細描述了銀屑病的癥狀：“白疕，一名疕風(fēng)，皮膚燥癢……十指間皮厚而莫能搔癢?！迸R床上銀屑病的西醫(yī)治療手段較多，但療效并不十分滿意[1]。中醫(yī)藥因安全性高，廣泛應(yīng)用于銀屑病的治療中，療效良好。

板藍根、大青葉、青黛是治療銀屑病方劑中的常用中藥，具有清熱解毒、涼血消斑的功效，用于溫毒發(fā)斑，均被證實能有效治療銀屑病[2-3]。靛藍（indigo）作為上述藥味的共同有效成分之一，是一種脂溶性生物堿成分。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)：外用靛藍乳液可以改善銀屑病小鼠模型的表皮厚度、減輕紅斑浸潤及鱗屑，降低皮損中炎癥因子的表達，展現(xiàn)出良好的治療效果；同時在細胞水平，靛藍還能對炎癥狀態(tài)下的巨噬細胞產(chǎn)生抗炎活性，抑制腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細胞介素（IL）-1β、IL-6 的表達[4]。目前研究[5]表明，巨噬細胞存在于銀屑病的皮損中，參與銀屑病炎癥狀態(tài)的發(fā)生發(fā)展，抑制皮損中巨噬細胞的浸潤可以減輕表皮增殖、紅斑鱗屑等銀屑病的病理變化及皮損表現(xiàn)。因此，本研究以IL-4 誘導(dǎo)RAW264.7 細胞，建立巨噬細胞M2 極化模型，同時用不同濃度的靛藍進行干預(yù)，比較IL-4 誘導(dǎo)與靛藍對RAW264.7 細胞極化的差異，進一步探討靛藍抗銀屑病機制，以期為靛藍的臨床運用提供參考依據(jù)，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞系及培養(yǎng)小鼠單核巨噬細胞白血病細胞系RAW264.7，購自中國源井生物公司，批號：YC-C020。以α-MEM 培養(yǎng)液（加入10%胎牛血清+0.1%青鏈霉素雙抗）培養(yǎng)，于37 ℃、5% CO2條件下進行常規(guī)培養(yǎng)和傳代操作。

1.2 藥物、試劑與儀器靛藍（分子式C16H10N2O2，分子量262.26），結(jié)構(gòu)式見圖1，純度100%，購自中國成都瑞芬思生物科技有限公司；α-MEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、青鏈霉素雙抗、胰蛋白酶均購自美國Gibco 公司；二甲基亞砜（DMSO）購自美國Sigma 公司；細胞計數(shù)試劑盒8（CCK-8），美國GlpBio 公司；四甲基偶氮唑鹽（MTT）試劑盒（上海碧云天公司）；IL-4（美國Peprotech 公司）；2×Universal Blue SYBR Green qPCR Master Mix（Servicebio 公司）；兔抗IL-10 抗體（萬類生物公司）；兔抗TNF-α抗體、兔抗精氨酸酶1（Arg-1）抗體、兔抗GAPDH 抗體（美國Affinity 公司）；山羊抗兔IgG 二抗（美國Thermo Scientific 公司）；增強化學(xué)發(fā)光（ECL）顯色液（美國Bio-Rad 公司）。B16UU型CO2培養(yǎng)箱（德國Heraues 公司）、ABI 7500 型熒光定量PCR 儀器（美國Applied Biosystems 公司）。

圖1 靛藍結(jié)構(gòu)式Figure 1 Structural formula of indigo

1. 3 巨噬細胞M2 極化模型制備取處于對數(shù)生長期的RAW264.7細胞，重懸后，調(diào)整細胞密度為1 × 106個/mL，將100 μL 細胞懸液加入100 mm 培養(yǎng)皿中，加入5 mL培養(yǎng)基并加入終濃度為20 ng/mL的IL-4 刺激3 d 制備巨噬細胞M2 極化模型。檢測M1 極化指標Arg-1 mRNA 表達量變化，若IL-4 干預(yù)后Arg-1表達上調(diào)，則判斷為造模成功[6]。

1.4 采用CCK-8法觀察不同濃度靛藍對RAW264.7細胞活力的影響取對數(shù)生長期的RAW264.7 細胞，分別加入含終濃度為0、0.004、0.04、0.4、4、40、400 μmol·L-1靛藍的培養(yǎng)基，用培養(yǎng)基將細胞密度調(diào)整為1×105個/mL，每孔100 μL細胞懸液接種于96孔板，在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)3 d。然后，加入10%的CCK-8試劑10 μL，在細胞培養(yǎng)箱中孵育1.5 h，應(yīng)用酶標儀在波長450 nm 處測量每個孔的吸光度（OD）值。計算各組細胞存活率：細胞存活率=實驗組OD 值/對照組OD 值× 100%。依據(jù)CCK-8 實驗結(jié)果，選擇無毒的3 個濃度（0.4、4、40 μmol·L-1）作為后續(xù)實驗靛藍的低、中、高濃度。

1.5 細胞分組與處理取生長狀態(tài)良好的RAW264.7細胞，重懸后將細胞密度調(diào)整至1×106個/mL，于100 mm 培養(yǎng)皿中加入10 mL 培養(yǎng)基，每皿接種100 μL細胞懸液。分為5組：空白對照組，正常培養(yǎng)基培養(yǎng)；IL-4 誘導(dǎo)組，按照“1.3”項方法制備RAW264.7 巨噬細胞M2 極化模型；靛藍0.4、4、40 μmol·L-1組，按照“1.3”項方法制備RAW264.7巨噬細胞M2 極化模型，同時對應(yīng)給予含靛藍終濃度為0.4、4、40 μmol·L-1的培養(yǎng)基。處理3 d。

1.6 實時熒光定量PCR 法檢測細胞誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）、Arg-1 的mRNA 表達按“1.5”項中方法處理干預(yù)3 d 后，收集RAW264.7 細胞。將重懸后的細胞加入離心管中，用TRIzol 法提取RNA，紫外分光光度計確定RNA 樣品的濃度及純度（需注意以下要求：OD260/OD280＜2.1，OD260/OD230＞1.5）。測定RNA 濃度后進行逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA 為模板，進行熒光定量PCR 反應(yīng)。使 用2 × Universal Blue SYBR Green qPCR Master Mix 配制20 μL 定量PCR 反應(yīng)體系。使用熒光定量PCR 儀進行擴增及定量檢測，按照SYRB 說明書“Stage 1 預(yù)變性1 個循環(huán)（95 ℃、30 s），Stage 2 變性（95 ℃、15 s）、退火/延伸（60 ℃、30 s）40 個循環(huán)，Stage 3 溶解曲線”為程序?qū)悠愤M行擴增。以融解曲線判斷是否存在非特異擴增。引物序列見表1，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。采用2-ΔΔCt法檢測目的基因相對表達量，β-actin為內(nèi)參。

表1 定量PCR引物序列表Table 1 Sequence list of quantitative PCR primers

1.7 Western Blot法檢測細胞Arg-1、IL-10、TNF-α的蛋白表達按“1.5”項中方法處理干預(yù)3 d 后，收集RAW264.7 細胞。使用放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解緩沖液提取蛋白，用二喹啉甲酸（BCA）法定量，然后用10% 十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）凝膠上樣電泳。電轉(zhuǎn)至0.22 μm 的PVDF 膜上。脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入Arg-1、IL-10、TNF-α、GAPDH 抗體（體積比1∶1 000 稀釋）4 ℃孵育過夜，再置于山羊抗兔IgG 二抗（體積比1∶3 000 稀釋）中室溫孵育2 h，洗膜后加入混合好的ECL 化學(xué)發(fā)光液充分反應(yīng)，用全能型凝膠成像系統(tǒng)（ChemiDoc MP）進行掃描拍照，根據(jù)不同發(fā)光強度調(diào)整曝光條件。使用ImageJ 確定蛋白電泳條帶的灰度值。以目的蛋白條帶與GAPDH 條帶灰度值比值表示目的蛋白的相對表達量。

1.8 統(tǒng)計方法采用SPSS 26.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，符合正態(tài)分布的多組數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），符合正態(tài)分布與方差齊性的兩組獨立計量資料采用兩獨立樣本，t檢驗，不符合正態(tài)分布，方差不齊則采用秩和檢驗，以，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IL-4誘導(dǎo)RAW264.7細胞形態(tài)學(xué)的變化圖2結(jié)果顯示：未經(jīng)IL-4 誘導(dǎo)的空白對照組，細胞形態(tài)大多數(shù)為圓形、橢圓形，部分呈不規(guī)則型；RAW264.7 細 胞 經(jīng)20 ng/mL 的IL-4 誘 導(dǎo)3 d 后，部分細胞形態(tài)呈規(guī)則圓形，部分呈梭形。表明IL-4誘導(dǎo)AW264.7 細胞形態(tài)學(xué)變化符合巨噬細胞M2極化表現(xiàn)。

圖2 IL-4誘導(dǎo)RAW264.7 細胞形態(tài)學(xué)變化Figure 2 IL-4 induces morphological changes in RAW264.7 cells

2.2 靛藍最佳濃度的確定圖3結(jié)果顯示，0.004 ～4 μmol·L-1的靛藍處理3 d 對巨噬細胞活力無明顯影響。靛藍濃度為40 μmol·L-1時，細胞存活率為（76.17 ± 11.04）%。而靛藍濃度為400 μmol·L-1時，巨噬細胞存活率為（45.36±6.12）%，顯著低于50%，表明該濃度靛藍對巨噬細胞有明顯毒性，故剔除該濃度。因此，優(yōu)選0.4、4、40 μmol·L-13個濃度進行后續(xù)實驗。

圖3 不同濃度靛藍處理3 d對RAW264.7細胞活力的影響Figure 3 Effect of different concentrations of indigo on the survival of RAW264.7 cells for three days

2.3 靛藍對IL-4 誘導(dǎo)RAW264.7 細胞M1/M2 極化標志物的影響圖4結(jié)果顯示：IL-4誘導(dǎo)RAW264.7細胞3 d 后，Arg-1 的mRNA、蛋白表達水平較空白對照組顯著升高（P＜0.001）；經(jīng)4、40 μmol·L-1濃度的靛藍干預(yù)后，Arg-1 的mRNA、蛋白表達水平均進一步升高，與IL-4 誘導(dǎo)組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。

圖4 靛藍對RAW264.7細胞Arg-1 mRNA、蛋白表達的影響Figure 4 Effect of indigo on mRNA and protein expressions of Arg-1 in RAW264.7 cells

圖5 結(jié)果顯示：IL-4 誘導(dǎo)RAW264.7 細胞3 d后，iNOS的mRNA表達水平較空白對照組顯著下降（P＜0.001）；經(jīng)0.4、4、40 μmol·L-1濃度的靛藍干預(yù)后，iNOS的mRNA表達水平進一步下降，與IL-4誘導(dǎo)組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.000 1）。

圖5 靛藍對RAW264.7細胞iNOS mRNA表達的影響Figure 5 Effect of indigo on the mRNA expression of iNOS in RAW264.7 cells

以上結(jié)果表明，IL-4 誘導(dǎo)RAW264.7 細胞M2極化模型構(gòu)建成功。靛藍可以上調(diào)M2 極化巨噬細胞標志物Arg-1 的轉(zhuǎn)錄、表達，抑制M1 極化巨噬細胞標志物iNOS 的轉(zhuǎn)錄。提示靛藍可促進IL-4 誘導(dǎo)RAW264.7細胞向M2型極化。

2. 4 靛藍對IL-4 誘導(dǎo)RAW264.7 細胞炎癥因子表達的影響圖6 結(jié)果顯示：IL-4 誘導(dǎo)RAW264.7細胞3 d后，IL-10的表達水平顯著升高（P＜0.05），TNF-α 的表達水平顯著降低（P＜0.05）。0.4、4、40 μmol·L-1濃度的靛藍均能進一步上調(diào)細胞IL-10的表達，并且能進一步下調(diào)TNF-α 的表達，40 μmol·L-1濃度靛藍組與IL-4 誘導(dǎo)組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。表明靛藍可發(fā)揮一定的抗炎作用。

圖6 靛藍對RAW264.7細胞IL-10、TNF-α蛋白表達的影響Figure 6 Effect of indigo on protein expressions of IL-10 and TNF-α in RAW264.7 cells

3 討論

中藥單體抗銀屑病作用及其機制是目前的研究熱點。已有許多關(guān)于單味中藥板藍根、大青葉、青黛治療銀屑病的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、動物、細胞層面的驗證，均提示其具有良好的抗炎、抗增殖的效用[7-9]。靛藍為上述藥味的共同有效成分之一，闡明其在銀屑病中的作用機制具有重要的研究意義。

RAW264.7 細胞是常用于制作炎癥模型的巨噬細胞，可以通過不同的環(huán)境誘導(dǎo)分化成不同功能類型的細胞[10-12]。有研究驗證20 ng/mL 的IL-4可以成功誘導(dǎo)RAW264.7細胞極化為M2型巨噬細胞（替代活化）[13]。M2 型巨噬細胞通過分泌IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β 等細胞因子，參與細胞、組織抗炎及組織損傷的修復(fù)過程。在創(chuàng)傷愈合過程中，早期創(chuàng)面會產(chǎn)生M1 型巨噬細胞，促進創(chuàng)面的炎癥反應(yīng)，殺傷外來生物，隨著炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展，M1 型巨噬細胞會逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)镸2 型巨噬細胞，促進創(chuàng)面的細胞增殖及血管形成[14]。但是，過度的M2 型巨噬細胞會導(dǎo)致細胞增殖過度、膠原蛋白沉積等促腫瘤作用[15]。

巨噬細胞本身具有高度的可塑性，可以在不同的組織中發(fā)揮特定的職能，也可以在固定的組織中隨著微環(huán)境的改變而出現(xiàn)表型的變化[16-17]。根據(jù)巨噬細胞標志物表達水平的改變，可以推測出M1/M2平衡的改變。Arg-1、iNOS分別是M2、M1型巨噬細胞標志物，本研究采用IL-4誘導(dǎo)RAW264.7細胞，同時使用不同濃度（0.4、4、40 μmol/L）的靛藍干預(yù)3 d，結(jié)果顯示，與空白對照組或模型組比較，靛藍3 個濃度組Arg-1 mRNA 及蛋白質(zhì)的表達均有不同程度的升高，iNOS mRNA 表達顯著降低。表明靛藍可以調(diào)節(jié)M1/M2 型巨噬細胞平衡，使M2 極化狀態(tài)下的巨噬細胞進一步向M2 方向極化。

IL-10 是具有抗炎特性的細胞因子，可以通過限制機體中各種免疫細胞對病原體的免疫反應(yīng)，避免機體遭受損害[18]。TNF-α 是公認的促炎因子[19]。本研究結(jié)果表明，靛藍可以抑制IL-4 誘導(dǎo)RAW264.7 細胞TNF-α 的表達，上調(diào)IL-10 的表達，提示靛藍可抑制炎癥反應(yīng)，減輕銀屑病炎癥損害。

綜上所述，本實驗以治療銀屑病的常用中藥板藍根、大青葉、青黛等的共同有效成分靛藍為實驗藥物，從巨噬細胞極化方面來探討中藥單體治療銀屑病的可能性，挖掘顯示靛藍可以通過促進巨噬細胞的M2 型極化在銀屑病中發(fā)揮治療作用。