趙鈺琦， 應(yīng)曉明， 許嘉隆， 郭少卿

（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江杭州 310053；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三醫(yī)院，浙江杭州 310053）

高血壓是導(dǎo)致各種心血管疾病發(fā)生甚至死亡的重要原因[1]。研究[2]表明，高血壓人群合并焦慮抑郁的情況較為普遍，而焦慮抑郁極易引起失眠癥狀，導(dǎo)致睡眠時間縮短，睡眠質(zhì)量下降。絕經(jīng)后女性由于垂體-性腺軸失衡，引起神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)紊亂，導(dǎo)致雌激素減少，免疫功能下降，從而加重失眠的癥狀，嚴重影響生活質(zhì)量[3]。目前，常用的治療失眠的藥物為苯二氮卓類，但僅能暫時控制癥狀，停藥易反復(fù)，且有較多副作用[4]。研究[5]發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)療法如針刺、耳穴壓豆等，能顯著改善患者的失眠癥狀，提高免疫功能。但目前尚無針刺或耳穴壓豆治療絕經(jīng)后高血壓患者失眠癥狀的報道。微小RNA 為體內(nèi)存在的一種小分子RNA，具有多種生理功能[6]。研究[7]表明，血清miR-223、miR-146a 能夠調(diào)節(jié)免疫功能，在腫瘤、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等多種免疫異常疾病中發(fā)揮重要作用，因此，其可能與絕經(jīng)后免疫異常導(dǎo)致的失眠有關(guān)。本研究采用針刺聯(lián)合耳穴壓豆治療絕經(jīng)后女性高血壓患者失眠，取得顯著療效，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象及分組

選取2020 年5 月至2022 年1 月浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三醫(yī)院收治的98 例明確診斷為絕經(jīng)后女性高血壓失眠的患者為研究對象。按隨機數(shù)字表將患者隨機分為觀察組和對照組，每組各49 例。本研究符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)要求并通過浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三醫(yī)院倫理委員會的審核批準，倫理號：KY1637405。

1.2 診斷標準

1.2.1 西醫(yī)診斷標準

原發(fā)性高血壓參照《中國高血壓防治指南（2018 年修訂版）》[8]中的有關(guān)診斷標準。失眠參照《中醫(yī)內(nèi)科學(xué)》[9]中的有關(guān)診斷標準擬定。（1）至少有一種睡眠障礙癥狀：入睡困難、維持睡眠狀態(tài)困難、早醒、不愿按時入睡；（2）至少有一種日間癥狀：疲勞、記憶力減退、工作或?qū)W習(xí)受影響、白天嗜睡、情緒煩躁、易沖動、乏力；（3）睡眠及日間癥狀不能通過無合適睡眠時間或睡眠環(huán)境來解釋；（4）睡眠癥狀不能被其他的睡眠障礙解釋。

1.2.2 中醫(yī)辨證標準

參照《中醫(yī)內(nèi)科學(xué)》[9]和《中醫(yī)婦科學(xué)》[10]中有關(guān)心腎不交證的診斷標準。主癥：眩暈頭痛，心煩不寐；次癥：腰膝酸軟，潮熱盜汗，五心煩熱，煩躁易怒，心悸怔忡；舌象：舌紅苔少；脈象：脈細數(shù)。主癥具備且兼2 項或2 項以上次癥，結(jié)合舌脈即可診斷。

1.3 納入標準

①符合上述中西醫(yī)診斷標準；②絕經(jīng)后女性；③有高血壓病史，140 mmHg＜收縮壓＜179 mmHg；或90 mmHg＜舒張壓＜109 mmHg；④自愿參加本研究并簽署知情同意書的患者。

1.4 排除標準

①患有嚴重的心、肝、腎等臟器功能障礙的患者；②患有嚴重的免疫系統(tǒng)疾病的患者；③患有惡性腫瘤的患者；④患有嚴重的凝血功能障礙的患者；⑤精神類疾病的患者；⑥患有針刺禁忌證的患者。

1.5 治療方法

1.5.1 常規(guī)處理

2 組患者均給予健康宣教及苯磺酸氨氯地平片治療。苯磺酸氨氯地平片（絡(luò)活喜，輝瑞制藥有限公司，批準文號：國藥準字H20093660，規(guī)格：5 mg×7 片/盒）口服，每次5 mg，每天1 次。囑患者在治療過程中，低鹽低脂飲食，每天保證適量運動，閱讀書籍，睡前聆聽正念療法音頻輔助睡眠。

1.5.2 對照組

給予艾司唑侖片治療。艾司唑侖片（沈陽第一制藥有限公司，批號：國藥準字H2102958，規(guī)格：1 mg × 20 片）口服，每日1 次，每次2 片，睡前口服，連續(xù)治療4周。

1.5.3 觀察組

在對照組治療的基礎(chǔ)上，給予針刺聯(lián)合耳穴壓豆治療。針刺治療具體操作方法如下：患者取仰臥位，醫(yī)者站立于患者右側(cè)，常規(guī)消毒穴位局部皮膚。取穴如下：以百會、神庭、列缺、曲池、內(nèi)關(guān)、合谷為主穴，配穴包括風(fēng)池、風(fēng)府、氣海、關(guān)元、委中、三陰交、豐隆。采用華佗牌一次性無菌針灸針（蘇州華佗針灸器械有限公司，規(guī)格：0.25 mm×40 mm）。百會、神庭平刺5 ～8 mm，列缺斜刺8 ～10 mm，其余穴位直刺10 ～12 mm。進針后給予小幅度的提插、順時針小幅度捻轉(zhuǎn)，行平補平瀉手法，以患者能夠耐受為限，捻針的角度在180°～360°之間，頻率為90 ～120 次/min 之間，得氣后留針30 min。留針期間再行針2 次。每日治療1次，連續(xù)治療4周。耳穴壓豆治療，選穴為神門、交感、皮質(zhì)下、心、肝、腎，采用75%酒精消毒耳廓，采用探針將附有王不留行籽的膠布貼于上述穴位。囑患者每日定時按壓5 次，每個穴位按30 下，以略有脹痛但尚能忍受為度，每周2 次由專門的醫(yī)務(wù)人員更換耳穴上的膠布，療程共4周。

1.6 觀察指標

1.6.1 睡眠質(zhì)量評估

分別于治療前后觀察2組患者匹茲堡睡眠質(zhì)量指數(shù)（Pittsburgh sleep quality index，PSQI）評分的變化情況。此量表用于評估睡眠質(zhì)量，包含主觀睡眠質(zhì)量、入睡時間、持續(xù)時間、睡眠效率、睡眠異常、鎮(zhèn)靜藥使用及日間功能障礙7個方面，每個方面0 ～3 分?？偡譃?1 分，分數(shù)越高，表示睡眠質(zhì)量越差[11-12]。

1.6.2 血清miR-223、miR-146a水平

分別于治療前后空腹抽取2 組患者靜脈血3 mL，以3 000，g離心10 min，提取上層血清。采用miRNA 提取分離試劑盒（凱杰生物工程深圳有限公司，批號：217016）提取血清中miRNA，采用miRNA 的cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京百奧萊博科技有限公司，批號：MT0006）將miRNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)miRNA 熒光定量檢測試劑盒（上海澤葉生物科技有限公司，批號：ZY131042）說明書配制反轉(zhuǎn)錄體系，將配制好的體系放入Applied Biosystems 的實時熒光定量PCR 儀進行擴增。反應(yīng)程序為：95 ℃加熱1 min；進行40個循環(huán)，每個循環(huán)包括95 ℃變性30 s，58 ℃退火40 s，72 ℃延伸30 s；最后72 ℃加熱5 min 充分反應(yīng)。miR-146a 的引物由上海生物工程公司合成，序列如下：miR-223 正向5’-ATGTCCGACTAAAGTCGTCAAC-3’，反 向5’-GCTGCCTACAGCGTGCTTC-3’； miR-146a 正向5’-GCAGCCTCTAGAAGTCGTCAGG-3’，反向5’-CTGGGCTACTGAAGGCTAG-3’；內(nèi)參采用U6 基因，正 向5’-GACTGATGCTCTGGCCGA-3’，反向5’-GTCGGGTCGAAGCATGG-3’。采用2-△△Ct法計算miR-223、miR-146a的表達量。

1.6.3 外周血CD3+、CD4+、CD8+T細胞水平

分別于治療前后空腹抽取2組患者靜脈血5 mL，于EDTA 抗凝管中，搖勻，加入流式試管中，與單克隆抗體充分混勻，孵育10 min。滴加紅細胞裂解液500 μL，混勻。再滴加5 mL PBS 緩沖液，以3 000 r/min 離心5 min。小心倒掉上清，滴加300 μL PBS 重懸細胞，采用BD 公司FACB CantoII 流式細胞儀檢測CD3+、CD4+、CD8+T 細胞，并使用FACS DIVA軟件分析結(jié)果。

1.7 統(tǒng)計方法

采用SPSS 26.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析。計量資料采用均數(shù)±標準差（±s）表示，組內(nèi)比較采用配對，t檢驗，組間比較采用獨立樣本，t檢驗；計數(shù)資料采用率或構(gòu)成比表示，組間比較采用卡方檢驗；等級資料組間比較采用Ridit 分析。以，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組患者基線資料比較

觀察組49 例患者中，年齡47 ～83 歲，平均（67.53 ± 12.36）歲；病程15 ～40 d，平均（26.52 ±8.16）d。對照組49 例患者中，年齡48 ～82 歲，平均（65.42±11.18）歲；病程15 ～38 d，平均（25.37±7.40）d。2 組患者的年齡、病程等一般情況比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），表明2 組患者的基線特征基本一致，具有可比性。

2.2 2組患者治療前后PSQI評分比較

表1 結(jié)果顯示：治療前，2 組患者PSQI評分比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。治療后，2 組患者的PSQI 評分明顯改善（P＜0.05），且觀察組在改善PSQI 評分方面明顯優(yōu)于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 2組絕經(jīng)后女性高血壓失眠患者治療前后匹茲堡睡眠質(zhì)量指數(shù)（PSQI）評分比較Table 1 Comparison of PSQI scores between two groups of postmenopausal women with hypertension and insomnia before and after treatment（±s，分）

表1 2組絕經(jīng)后女性高血壓失眠患者治療前后匹茲堡睡眠質(zhì)量指數(shù)（PSQI）評分比較Table 1 Comparison of PSQI scores between two groups of postmenopausal women with hypertension and insomnia before and after treatment（±s，分）

注：①，P＜0.05，與同組治療前比較；②，P＜0.05，與對照組治療后比較

治療后5.28±0.94①4.37±0.83①②組別對照組觀察組例數(shù)/例49 49治療前7.26±1.22 7.31±1.27

2. 3 2組患者治療前后血清miR-223、miR-146a水平比較

表2 結(jié)果顯示：治療前，2 組患者血清miR-223、miR-146a水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。治療后，2 組患者的血清miR-223、miR-146a 水平明顯改善（P＜0.05），且觀察組在改善血清miR-223、miR-146a 水平方面明顯優(yōu)于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 2組絕經(jīng)后女性高血壓失眠患者治療前后血清miR-223、miR-146a水平比較Table 2 Comparison of serum miR-223 and miR-146a levels between two groups of postmenopausal women with hypertension and insomnia before and after treatment （±s）

表2 2組絕經(jīng)后女性高血壓失眠患者治療前后血清miR-223、miR-146a水平比較Table 2 Comparison of serum miR-223 and miR-146a levels between two groups of postmenopausal women with hypertension and insomnia before and after treatment （±s）

注：①，P＜0.05，與同組治療前比較；②，P＜0.05，與對照組治療后比較

miR-146a水平2.05±0.46 2.78±0.59①1.97±0.39 4.13±0.75①②組別對照組觀察組時間治療前治療后治療前治療后例數(shù)/例49 49 49 49 miR-223水平3.62±0.58 2.31±0.47①3.71±0.63 1.58±0.32①②

2.4 2組患者治療前后外周血CD3+、CD4+、CD8+T細胞水平比較

表3 結(jié)果顯示：治療前，2 組患者外周血CD3+、CD4+、CD8+T 細胞水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。治療后，2 組患者的外周血CD3+、CD4+、CD8+T 細胞水平明顯改善（P＜0.05），且觀察組在改善外周血CD3+、CD4+、CD8+T 細胞水平方面明顯優(yōu)于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表3 2組絕經(jīng)后女性高血壓失眠患者治療前后外周血CD3+、CD4+、CD8+T細胞水平比較Table 3 Comparison of serum CD3+，CD4+and CD8+T-cell levels between two groups of postmenopausal women with hypertension and insomnia before and after treatment（±s，%）

表3 2組絕經(jīng)后女性高血壓失眠患者治療前后外周血CD3+、CD4+、CD8+T細胞水平比較Table 3 Comparison of serum CD3+，CD4+and CD8+T-cell levels between two groups of postmenopausal women with hypertension and insomnia before and after treatment（±s，%）

注：①，P＜0.05，與同組治療前比較；②，P＜0.05，與對照組治療后比較

CD8+26.63±2.37 27.09±2.26①26.17±2.14 28.71±2.42①②組別對照組觀察組時間治療前治療后治療前治療后例數(shù)/例49 49 49 49 CD3+57.36±3.18 60.31±3.56①58.04±3.34 63.58±3.63①②CD4+30.10±2.88 31.26±3.19①30.72±3.35 34.67±3.52①②

3 討論

失眠表現(xiàn)為入睡時間延長、睡眠持續(xù)時間縮短、睡醒后精力未恢復(fù)等[13]。全世界35%～50%成年人均存在睡眠障礙[14]。高血壓患者的動脈壓升高，使得交感神經(jīng)興奮性增強，極易引起失眠等并發(fā)癥。目前，高血壓患者中伴有失眠癥狀的超過40%[15]，主要的治療手段為鎮(zhèn)靜催眠藥與降壓藥聯(lián)合使用[16]。然而，絕經(jīng)后的女性高血壓患者由于雌激素水平降低，引起神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)失衡，使得免疫功能紊亂，導(dǎo)致失眠加重[17]。研究表明，機體免疫功能受損時，T 細胞、NK 細胞、巨噬細胞功能下降，此時會激活程序性死亡因子CTLA-4 和PD-1，作用于腺苷A2 受體，抑制受體功能，使得下丘腦神經(jīng)元放電減少，導(dǎo)致失眠發(fā)生[18]。有研究[19]發(fā)現(xiàn)，失眠患者外周血NK 細胞膜的p30 受體數(shù)量減少，使得NK 細胞功能減弱。以上均表明免疫功能在失眠中發(fā)揮了重要作用。

中醫(yī)認為，失眠屬于“不寐”“不得眠”范疇[20]。病因包括陰陽失調(diào)、素體虛弱、臟腑失和、情志不安等[21]。病機涉及正常白晝衛(wèi)氣在表循行周身，夜間則入于陰分。倘若機體陰陽失調(diào)，衛(wèi)氣無法入陰，則出現(xiàn)入睡困難；年老或重病體虛時，氣血虧少，導(dǎo)致衛(wèi)氣衰減，亦會夜間難眠；若心血不足或肝郁化火，氣行不暢，則臥不安?；虬紓?，暴怒傷肝，也會導(dǎo)致失眠[22]。治則治法主要包括疏肝解郁、調(diào)和陰陽、益氣補血、養(yǎng)心安神等[23]。

本研究采用針刺治療心腎不交型失眠，主穴為百會、神庭、列缺、曲池、內(nèi)關(guān)、合谷。其中，百會息風(fēng)醒神、升陽固脫，神庭寧神醒腦，列缺通經(jīng)活絡(luò)、通調(diào)任脈，曲池疏風(fēng)清熱通絡(luò)，內(nèi)關(guān)寬胸理氣、寧心安神，合谷清熱解表通絡(luò)。配穴包括風(fēng)池、風(fēng)府、氣海、關(guān)元、委中、三陰交、豐隆。其中，風(fēng)池祛風(fēng)解毒、通利腦竅，風(fēng)府散風(fēng)息風(fēng)、通關(guān)開竅，氣海益氣助陽、溫腎固精，關(guān)元培補元氣，委中開竅醒神、疏經(jīng)通絡(luò)，三陰交滋陰健脾、補氣益腎，豐隆化痰開竅。以上諸穴合用，共奏疏經(jīng)通絡(luò)、寧心安神之功效?，F(xiàn)代研究[24]表明，針刺能升高下丘腦內(nèi)γ-氨基丁酸的水平，校正氨基酸代謝過程中谷氨酸及谷氨酰胺合酶的合成，穩(wěn)定谷氨酸/γ-氨基丁酸比值的平衡。另有研究[25]發(fā)現(xiàn)，針刺能通過Toll 樣蛋白依賴的NF-κB 信號通路參與免疫調(diào)節(jié)，影響下游的MyD88、IRAK 等分子，作用于免疫細胞膜受體，引起免疫細胞分泌白細胞介素、腫瘤壞死因子水平減少，從而調(diào)節(jié)免疫，平衡睡眠狀態(tài)。

中醫(yī)認為，耳與人體的臟腑、經(jīng)脈有著廣泛的聯(lián)系[26]。《靈樞》提到“耳者，宗脈之所聚”。耳穴壓豆采用王不留行按壓耳部穴位的方法，通過經(jīng)絡(luò)系統(tǒng)聯(lián)系臟腑，從而起到疏通經(jīng)脈、調(diào)理臟腑的作用[27]。本研究的耳穴包括神門、交感、皮質(zhì)下、心、肝、腎，其中：皮質(zhì)下能夠增強大腦灰質(zhì)功能，是治療失眠的主穴；心穴具有補充心經(jīng)氣血的作用；神門穴為手少陰心經(jīng)的原穴，能夠鎮(zhèn)靜安神；交感穴可以恢復(fù)自主神經(jīng)功能，寧心除煩。諸穴合用，能夠有效改善患者的失眠癥狀。現(xiàn)代研究[28]發(fā)現(xiàn)，耳穴壓豆能激活下丘腦-垂體-性腺軸的功能，調(diào)節(jié)皮質(zhì)類固醇的分泌水平。另有研究[29]表明，耳穴壓豆能明顯增加五羥色胺受體1A蛋白表達，減少2A受體表達，從而降低下游腺苷酸環(huán)化酶及一磷酸腺苷含量，縮短睡眠潛伏期，延長睡眠時間。

miRNA是體內(nèi)一種長度為22 nt的小分子核酸，具有影響基因表達轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)多種生理過程的作用[30]。miR-223在人體的血液、肝臟、腸道等多種組織器官中均有表達，其基因來源于X 染色體，長度為22 nt，位于莖環(huán)結(jié)構(gòu)的3’處，啟動區(qū)域在多個物種間具有高度保守性。miR-223 在T 細胞和B細胞中均有表達，在中性粒細胞生成中發(fā)揮重要作用[31]。miR-223 還能抑制自然殺傷細胞的活性，通過靶向抑制STAT3，調(diào)節(jié)T 細胞表面的TLR3 和TLR4受體，影響單核細胞向粒細胞的分化過程[32]。本研究結(jié)果表明，治療后觀察組的miR-223 水平明顯低于對照組，且miR-223 與T 細胞水平負相關(guān)。這提示針刺和耳穴壓豆可能是通過抑制miR-223 水平，影響與失眠相關(guān)的免疫信號通路，進而緩解失眠癥狀。

miR-146a 是另一種小分子miRNA，位于5 號染色體的LOC 區(qū)段的第二個外顯子處[33]。miR-146a 廣泛參與腫瘤、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等疾病的免疫調(diào)節(jié)過程[34]。其可通過影響IRF5 和干擾素信號通路，同時下調(diào)白細胞介素受體激酶的表達，影響干擾素等免疫因子水平[35]。miR-146a 含量升高能抑制樹突狀細胞凋亡，同時提高CD4+T 淋巴細胞增殖能力，從而增強適應(yīng)性免疫功能[36]。研究[37]發(fā)現(xiàn)，miR-146a 在記憶性T細胞中表達，經(jīng)由Fas死亡結(jié)構(gòu)域蛋白抑制白細胞介素2 分泌，抑制T 細胞凋亡。本研究結(jié)果表明，治療后觀察組的miR-146a 水平明顯高于對照組，且miR-146a 與T 細胞水平正相關(guān)。這提示針刺和耳穴壓豆可以通過提高miR-146a 水平，增加T 細胞數(shù)量，抑制T細胞凋亡，進而治療失眠。

本研究優(yōu)點在于不僅證明了針刺聯(lián)合耳穴壓豆對失眠的療效，還找到了能預(yù)測失眠復(fù)發(fā)的血清學(xué)指標。本研究的不足之處在于僅研究了高血壓女性的絕經(jīng)后狀態(tài)，該結(jié)果應(yīng)用于絕經(jīng)前狀態(tài)需謹慎。另外，本研究僅涉及高血壓患者的失眠情況，結(jié)果尚不能外推至未患高血壓的人群。未來我們將進一步研究絕經(jīng)前的女性高血壓患者，并探索針刺及耳穴壓豆的遠期療效。

綜上所述，針刺聯(lián)合耳穴壓豆治療絕經(jīng)后女性高血壓失眠，能明顯改善患者的臨床癥狀，降低miR-223含量，增加miR-146a含量，提高CD3+、CD4+、CD8+T 細胞水平，臨床效果顯著，值得在臨床進一步推廣應(yīng)用和深入研究。