余雙英 劉璐 張軍東

（1. 上海昊海生物科技股份有限公司 上海 201613；2. 上海利康瑞生物工程有限公司 上海 201707）

豬源纖維蛋白黏合劑在臨床常用于手術中輔助止血，該產品生物相容性好、無毒無刺激，能有效黏附于創(chuàng)口起到良好的止血和促進創(chuàng)口愈合的作用[1-3]。豬源纖維蛋白黏合劑主要是由豬纖維蛋白原、豬凝血酶及相應的稀釋劑組成的一種復合制劑，氨丁三醇作為豬凝血酶稀釋劑的一種重要輔料，根據相關要求需控制其含量。因此，建立一種適合本產品中氨丁三醇含量的測定方法尤為重要。

國家藥品標準[標準號：WS-10001-(HD-0467)-2002]氨丁三醇注射液[4]和《中華人民共和國藥典》2020 年版四部藥用輔料氨丁三醇中的含量測定均采用滴定法：以甲基紅做指示劑，用鹽酸滴定液（0.1 mol/L）滴定。但是在豬凝血酶稀釋劑制備過程中添加了稀鹽酸調節(jié)產品的pH，鹽酸會對最終滴定結果有干擾，故排除滴定法。

氨丁三醇屬帶鄰位的多羥基醇，相對分子質量較小，且沒有紫外吸收，但能夠在強堿條件下與氫氧化銅發(fā)生絡合反應，生成深藍色的氨丁三醇銅溶液，利用紫外-可見分光光度法測定絡合物的吸光度，從而計算出氨丁三醇的含量。已有文獻[5-6]采用紫外-可見分光光度法測定不同產品中氨丁三醇的含量，但本品中除氨丁三醇外還有其他一些對測定產生干擾的組分，不適合用于本品中氨丁三醇的測定。因此，本研究針對公司產品特點，對測定方法中采用的波長、硫酸銅及氫氧化鈉溶液的濃度或用量、離心轉速等條件均進行了改進，最終建立的方法操作簡單，結果準確，并經過了方法學驗證。

1 材料與方法

1.1 樣品與試劑

豬凝血酶稀釋劑（公司自產）；氨丁三醇對照品（中國食品藥品檢定研究院）；硫酸銅、氫氧化鈉、鹽酸（分析純級，上海凌峰化學試劑有限公司）；氯化鈣（藥用級，廣東省臺山市新寧制藥有限公司）。

1.2 儀器與設備

紫外- 可見分光光度計（Cary 60，Aglient Technologies）；ME104 和ME1002 分析天平、S220 pH計[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；H1650 臺式高速離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）。

1.3 溶液配制

1）氫氧化銅懸濁液 在10 mL 離心管中分別依次加入5%氫氧化鈉溶液3.5 mL 和15%硫酸銅溶液0.3 mL，立即振蕩混勻，即得氫氧化銅懸濁液（需現配現用）。

2）對照品儲備液（24 mg/mL） 精密稱取對照品氨丁三醇0.6 g 于25 mL 容量瓶中，加水溶解后，稀釋至刻度，搖勻，作為對照品儲備液。

3）線性溶液 分別精密量取0.25、0.40、0.50、0.60、0.75 mL 對照品儲備液于10 mL 容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得一系列質量濃度分別為0.60、0.96、1.20、1.44、1.80 mg/mL 的線性溶液。

4）供試品儲備液（24 mg/mL） 精密稱取氨丁三醇0.6 g，置于25 mL 容量瓶中，加少量與凝血酶稀釋劑中相同濃度的氯化鈣溶液（45 mmol/L）溶解后，然后用氯化鈣溶液稀釋至刻度，搖勻，作為供試品樣品儲備液。

1.4 檢測波長

制備4 組氫氧化銅懸濁液，各組中分別加入3 mL空白溶液（純化水）、3 mL 空白基質（不含氨丁三醇的凝血酶稀釋劑）、3 mL 對照品溶液（1.20 mg/mL）和3 mL 供試品溶液，立即振蕩混勻，于10 000 r/min 離心5 min，取上清液再次于10 000 r/min 離心5 min，然后取上清液于400 ～800 nm 波長下進行全波段掃描，確定檢測波長。

1.5 回歸方程

取5 份氫氧化銅懸濁液，分別加入上述不同質量濃度的線性溶液3 mL，立即振蕩混勻，于10 000 r/min 離心5 min，取上清液重復離心一次，然后取上清液在620 nm 波長下測吸光度，并以純化水為空白對照。以吸光度對氨丁三醇濃度作線性回歸，求得回歸方程。

2 結果

2.1 檢測波長的選擇

對照品和樣品溶液在620 nm 處具有最大吸收，而空白溶液和空白基質在該波長下基本沒有紫外吸收（圖1），表明此波長下測定的專屬性較好，故選擇620 nm 為測定波長。

圖1 全波段掃描圖

2.2 線性回歸方程

經計算得線性回歸方程為y=0.100 6x+0.011 9，相關系數r=0.998 5，說明氨丁三醇對照品溶液在0.579 3～1.737 9 mg/mL 范圍內，氨丁三醇濃度和吸光度線性關系良好。

2.3 準確度

分別制備濃度為70%、100%、130%的樣品液各3份進行測定，結果顯示其平均回收率分別是100.21%、98.36%、97.59%；9 份樣品液的平均回收率為98.72%（n=9），RSD 為1.46%（n=9）（表1），表明回收率較好。

表1 準確度測定

2.4 精密度（重復性/中間精密度）

兩位研究人員于不同日期各測定供試品溶液6 份，測得氨丁三醇含量的平均值分別為1.166 4 mg/mL、1.114 6 mg/mL（n=6）；12 份樣品的平均值為1.140 5 mg/mL（n=12），RSD 為3.59%（n=12），結果滿足內控標準（RSD ≤5.0%）。

2.5 溶液穩(wěn)定性

對照品和供試品溶液于室溫放置0 或24 h，測定結果顯示，兩時間氨丁三醇含量測定結果的比值均滿足內控標準（95.0%～105.0%）（表2），表明對照品和供試品溶液的穩(wěn)定性良好。

表2 溶液穩(wěn)定性

2.6 耐用性

在其他條件不變的情況下，分別調整離心轉速為（10 000±500）r/min、檢測波長為（620±2）nm、氫氧化鈉濃度為5%±0.5%，氨丁三醇含量與正常條件下測得的結果比值均在95.0%～105.0%（表3），表明該方法耐用性良好。

表3 耐用性試驗

2.7 供試品檢測

取3 批豬凝血酶稀釋劑（ 批號20201101、20201201、20201203），測得其氨丁三醇含量分別為1.183 2 mg/mL、1.201 4 mg/mL、1.167 9 mg/mL，說明該方法適用于豬凝血酶稀釋劑中氨丁三醇含量測定。

3 討論

1）離心條件的選擇 在建立方法過程中比較了離心條件分別為8 000 r/min 離心2 次（5 min/次）、10 000r/min 離心1 次（5 min/次）和10 000 r/min 離心2 次（5 min/次，第一次離心后取上清液再次離心）對離心效果的影響，結果發(fā)現，前兩種離心方式均會有少量片狀沉淀漂浮在上層清液中，對測定結果產生干擾；而第三種離心效果相對較好，沉淀與上清液能夠完全分離，從而使測定結果更加準確。

2）氫氧化銅懸濁液的制備 本方法根據產品特點，參考文獻[6]調整了氫氧化鈉和硫酸銅的用量，由于氫氧化銅懸濁液不穩(wěn)定，需現配現用，且加入供試品溶液后需立即震蕩混勻，否則氫氧化銅易分解產生黑色氧化銅沉淀，干擾測定結果。

方法改進后，采用紫外-可見分光光度法測定豬凝血酶稀釋劑中氨丁三醇含量，方法簡單、專屬性強，且線性、精密度、準確度較好，樣品中其他成分不干擾測定結果，是比較理想、便捷的一種含量測定方法。