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        酶解超聲結(jié)合提取虎杖中白藜蘆醇及純化方法研究

        2023-11-27 14:43:18付培蕾邱明恒馮爽李陽(yáng)杰
        中國(guó)食品 2023年22期
        關(guān)鍵詞:標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)

        付培蕾 邱明恒 馮爽 李陽(yáng)杰

        白藜蘆醇(Resveratrol,RES)是一種從植物中提取的二苯乙烯結(jié)構(gòu)的多酚,最初是從百合科藜蘆屬的毛葉藜蘆中得到的,后來(lái)發(fā)現(xiàn)在虎杖、葡萄、花生中也有其成分,而虎杖中含量最高。白藜蘆醇的化學(xué)名稱(chēng)為(E)-3,5,4-三羥基二苯乙烯,分子式為C14H12O3,相對(duì)分子質(zhì)量為228.4g·mol-1,難溶于水,易溶于甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯以及氯仿、乙醚等有機(jī)溶劑。白藜蘆醇在自然條件下以自由態(tài)和糖苷兩種形式存在,白藜蘆醇及其糖苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)還分別存在順式和反式兩種異構(gòu)體,白藜蘆醇的活性大于其苷,纖維素酶可將白藜蘆醇苷水解為白藜蘆醇。白藜蘆醇對(duì)乳腺癌、胃癌、結(jié)腸癌、黑色素癌細(xì)胞等均有顯著抑制作用,還具有抗衰老、抗氧化、抗菌、抗病毒、抗喘、防治心血管疾病等多種生理活性。本實(shí)驗(yàn)采用纖維素酶解結(jié)合超聲法提取虎杖中的白藜蘆醇,從而得到一種低能耗、高產(chǎn)率的提取虎杖中白藜蘆醇的工藝。

        一、儀器與材料

        1.儀器。超聲波清洗機(jī);紫外可見(jiàn)分光光度計(jì),島津UV2600;高效液相色譜儀,島津LC-20A;半制備高效液相色譜儀,Waters2535;紅外分光光度計(jì),熱電iS50。

        2.材料。虎杖(產(chǎn)地江西,經(jīng)原河南中醫(yī)藥大學(xué)教授王建剛教授鑒定為虎杖);白藜蘆醇(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%的對(duì)照品);纖維素酶,甲醇(GR、AR),無(wú)水乙醇(AR),乙酸乙酯(AR),三氯甲烷(AR),冰醋酸(GR),檸檬酸,檸檬酸三鈉,無(wú)水乙醚(GR),丙酮(AR),乙腈(GR)。

        二、實(shí)驗(yàn)與方法

        1.紫外分光光度法方法學(xué)的建立。(1)白藜蘆醇含量測(cè)定方法的建立。本實(shí)驗(yàn)采用紫外可見(jiàn)分光光度法測(cè)定虎杖提取物中白藜蘆醇類(lèi)粗提物的含量。

        (2)對(duì)照品溶液的配制。稱(chēng)取白藜蘆醇對(duì)照品1.0mg,加適量甲醇溶解,配制成100?g·mL-1的白藜蘆醇對(duì)照品溶液。

        (3)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制。分別配制濃度為1、2、4、6、8?g·mL-1的白藜蘆醇對(duì)照品溶液,使用紫外分光光度計(jì)在306nm處測(cè)定白藜蘆醇的吸光度,以濃度C為橫坐標(biāo),以吸光度絕對(duì)值A(chǔ)為縱坐標(biāo),進(jìn)行線(xiàn)性回歸,計(jì)算回歸方程與相關(guān)系數(shù)。

        (4)供試品溶液的配制。稱(chēng)取虎杖粉末(過(guò)60目)2.00g,加入適量纖維素酶,量取適量pH=5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液,于一定溫度下酶解一定時(shí)間。取出后加入適量乙醇溶液,超聲提取一定時(shí)間后抽濾,蒸干得浸膏。加入適量甲醇溶解,轉(zhuǎn)移于50mL容量瓶中,稀釋至刻度。精密吸取上述溶液0.1mL,轉(zhuǎn)移至10mL容量瓶中,稀釋至刻度,于306nm處測(cè)吸光度值,根據(jù)如下公式計(jì)算提取率:

        提取率=C×V×稀釋倍數(shù)/m

        C為被測(cè)樣品中白藜蘆醇的濃度(?g·mL-1),V為樣品最終定容體積(mL),m為虎杖的質(zhì)量(mg)。

        2.提取單因素考察。酶添加量分別考察0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%,酶解時(shí)間分別考察0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h,酶解溫度分別考察40℃、50℃、60℃、70℃、80℃,酶解pH分別考察3.4、4.0、4.4、5.0、5.4,乙醇濃度分別考察50%、60%、70%、80%、90%,液料比分別考察10:1、15:1、20:1、25:1、30:1,超聲時(shí)間分別考察20min、30min、40min、50min、60min,其他條件不變進(jìn)行初步試驗(yàn)。

        3.響應(yīng)面設(shè)計(jì)篩選最佳提取工藝。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選取影響較大的因素,以粗提取物的提取率為因變量,使用Design-Expert軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì),篩選出最佳提取工藝。

        4.最佳工藝重復(fù)性試驗(yàn)。根據(jù)響應(yīng)面設(shè)計(jì)得出的最佳提取工藝,重復(fù)進(jìn)行6次實(shí)驗(yàn),以白藜蘆醇含量為參照計(jì)算粗提物的提取率。

        5.粗提物的分離與純化。(1)乙酸乙酯初步除雜。將初步提取的溶液抽濾,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇得浸膏,加入適量甲醇溶解,粗提物用乙酸乙酯萃取3次,合并乙酸乙酯層,除去多糖、苷類(lèi)等極性較大的雜質(zhì),實(shí)現(xiàn)初步純化。

        (2)薄層鑒定。將白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液、萃取前提取液、萃取后提取液分別點(diǎn)樣20μL于硅膠G板上,以氯仿:丙酮:乙醇:水(4:4:0.5:0.2)為展開(kāi)劑,于365nm波長(zhǎng)處紫外燈下觀察,觀察到初步除雜后目標(biāo)單體的存在。

        (3)高效液相方法學(xué)建立。①色譜條件。色譜柱為Agilent SB-C18(150mm×4.6,5μm),流動(dòng)相為乙腈:0.2%冰醋酸(64.8:35.2)。②專(zhuān)屬性考察。稱(chēng)取適量空白溶劑、白藜蘆醇對(duì)照品,加入色譜甲醇配制成一定濃度的白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)樣測(cè)定。③標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立。配制濃度為0.2、2、10、20、40、50?g·mL-1的白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別進(jìn)樣測(cè)定,以RES的濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。④回收率、日間日內(nèi)精密度、重復(fù)性實(shí)驗(yàn)。分別取濃度為10、20、50?g·mL-1的低、中、高三個(gè)水平的白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行進(jìn)樣測(cè)定,根據(jù)所得峰面積計(jì)算相應(yīng)濃度,并與理論濃度進(jìn)行對(duì)比,計(jì)算回收率與RSD。1天內(nèi)每個(gè)濃度測(cè)定6次,連續(xù)測(cè)定6天,考察日間日內(nèi)精密度。平行3次,計(jì)算RSD,考察重復(fù)性。

        (4)制備型高效液相制備及單體純度測(cè)定。使用Waters2535半制備型高效液相色譜儀,分別進(jìn)白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液和乙酸乙酯萃取后樣品液,觀察半制備液相圖譜,取制得樣品測(cè)得單體純度。

        6.結(jié)構(gòu)鑒定。通過(guò)紅外光譜圖和核磁共振氫譜圖,對(duì)分離的單體進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。

        三、結(jié)果與分析

        1.白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。由圖1可知,白藜蘆醇的濃度與吸光度的線(xiàn)性回歸方程為Y=0.1212X-0.0046,相關(guān)系數(shù)為R=0.9997,表明白藜蘆醇在1-8?g·mL-1范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。

        圖1:白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

        2.單因素考察試驗(yàn)結(jié)果。由圖2可知,對(duì)白藜蘆醇提取率影響較大的是酶解溫度和酶解pH,因此可選擇進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。

        3.響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)選取酶解溫度和酶解pH作為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的兩個(gè)因素,每個(gè)因素三個(gè)水平,進(jìn)行12組實(shí)驗(yàn)。對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用Design Exepert軟件進(jìn)行回歸擬合,得到提取率對(duì)酶解溫度和pH的回歸方程為Y=1.20-0.019A-0.023B+0.033AB-0.14A?-0.10B?(R=0.9952)。

        根據(jù)中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)所得二維等高線(xiàn)圖和三維響應(yīng)曲面圖(圖3),確定最佳提取工藝條件,可知白藜蘆醇提取率的理論最大值為1.20%,所對(duì)應(yīng)的提取條件為:纖維素酶添加量0.2%,纖維素酶解時(shí)間1.5h,纖維素酶解溫度49℃,纖維素酶解pH=3.8,乙醇濃度70%,液料比20:1,超聲時(shí)間40min。

        4.最佳工藝重復(fù)性結(jié)果。響應(yīng)面篩選出的最佳工藝重復(fù)性良好,RSD均小于2.0%,說(shuō)明此工藝較穩(wěn)定可靠。

        5.粗提物的純化與分離鑒定。(1)薄層鑒定結(jié)果。乙酸乙酯萃取后,與標(biāo)準(zhǔn)品白藜蘆醇的Rf值相近的熒光斑點(diǎn)仍存在,表明白藜蘆醇仍保留在乙酸乙酯層。

        (2)專(zhuān)屬性結(jié)果。由圖4可知,溶劑對(duì)檢測(cè)沒(méi)有影響,白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間在7.5min,說(shuō)明專(zhuān)屬性較好,因此可以使用此條件下的檢測(cè)方法測(cè)定白藜蘆醇的含量。

        (3)高效液相標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。根據(jù)高效液相色譜儀所得數(shù)據(jù),白藜蘆醇峰面積與濃度的線(xiàn)性擬合方程為Y=152980X-14767,相關(guān)系數(shù)R=0.9999,說(shuō)明白藜蘆醇在0.2-50?g·mL-1范圍內(nèi)具有良好的線(xiàn)性關(guān)系,符合檢測(cè)要求。

        (4)回收率、日間日內(nèi)精密度、重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。由表1可知,三個(gè)水平濃度的白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液的回收率均在98%-102%,RSD均小于2.0%,日內(nèi)日間精密度、重復(fù)性的RSD均小于2.0%,說(shuō)明此條件下測(cè)定的方法精密度和重復(fù)性較好,因此可以采用此條件下的測(cè)定方法測(cè)定白藜蘆醇的含量。

        (5)半制備高效液相分離結(jié)果。以乙腈:水(40:60)為流動(dòng)相,2mL·min-1流速進(jìn)樣測(cè)定,與白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間收集目標(biāo)產(chǎn)物,測(cè)得單體質(zhì)量分?jǐn)?shù)為97.83%。

        由圖5可知,此色譜條件下白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間為8.23min,萃取物中有多種成分,其中保留時(shí)間為8.23min的峰為白藜蘆醇,收集此保留時(shí)間的樣品,真空干燥得粉末。

        (6)單體的結(jié)構(gòu)鑒定。由紅外表征結(jié)果(圖6)可知,a中3284cm-1和b中3285cm-1是分子間羥基形成氫鍵締合的特征峰,a中3022cm-1和b中3021cm-1是芳?xì)涞纳炜s振動(dòng)峰,1592cm-1-1449cm-1是苯環(huán)骨架振動(dòng)的特征峰。

        圖6:紅外光譜圖

        注:a.白藜蘆醇對(duì)照品;b.提取物分離單體

        圖7:核磁共振氫譜圖

        注:A.白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品;B.提取物分離單體

        由核磁結(jié)果(圖7)可知,分離單體的核磁共振氫譜與白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品的核磁共振氫譜基本一致,各峰的化學(xué)位移如下:a處酚羥基峰的化學(xué)位移為9.54ppm(s,1H),b處兩個(gè)化學(xué)環(huán)境相同的酚羥基質(zhì)子的化學(xué)位移為9.22ppm(s,2H),乙烯基上的兩個(gè)質(zhì)子峰分別為d處6.94ppm(d,1H,J=16HZ)和e處6.82ppm(d,1H,J=16HZ),苯環(huán)上的質(zhì)子峰分別為c處7.40ppm(d,1H,J=16HZ)、f處6.76ppm(d,2H,J=16HZ)、g處6.39ppm(s,2H)、h處6.12ppm(s,1H)。所收集樣品經(jīng)與白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品核磁共振氫譜對(duì)照,基本確定樣品即為白藜蘆醇。

        四、討論與結(jié)論

        采用紫外分光光度法測(cè)定白藜蘆醇的含量,白藜蘆醇含量在1-8?g·mL-1范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線(xiàn)性關(guān)系。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面設(shè)計(jì)篩選出虎杖中白藜蘆醇的最佳提取工藝為:酶解溫度49℃,pH=3.8,酶添加量0.2%,酶解時(shí)間1.5h,乙醇濃度70%,液料比20:1,超聲時(shí)間40min。此條件下白藜蘆醇提取率達(dá)1.19%,在環(huán)保節(jié)能的基礎(chǔ)上進(jìn)一步提高了提取率。

        將初步純化的提取物進(jìn)行分離,并與白藜蘆醇對(duì)照品對(duì)照,根據(jù)保留時(shí)間收集目標(biāo)產(chǎn)物,測(cè)得單體質(zhì)量分?jǐn)?shù)為97.83%。再通過(guò)紅外光譜及核磁共振氫譜對(duì)收集樣品進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定,經(jīng)與白藜蘆醇對(duì)照品對(duì)照,基本確定樣品即為分離所得白藜蘆醇單體。

        基金項(xiàng)目:教育部產(chǎn)學(xué)研項(xiàng)目“移動(dòng)互聯(lián)網(wǎng)時(shí)代下藥學(xué)專(zhuān)業(yè)教學(xué)改革研究”(20202028026)。

        作者簡(jiǎn)介:付培蕾(1995-),女,漢族,河南鄭州人,助教,碩士研究生,研究方向?yàn)樗幨鹿芾砼c中藥制劑開(kāi)發(fā)。

        邱明恒(1995-),女,漢族,河南鄭州人,助教,碩士研究生,研究方向?yàn)樗幬镌u(píng)價(jià)與藥事管理。

        馮爽(1986-),女,漢族,河南鄭州人,講師,碩士研究生,研究方向?yàn)樗幬镌u(píng)價(jià)與藥事管理。

        李陽(yáng)杰(1986-),男,漢族,河南鄭州人,副教授,碩士研究生,研究方向?yàn)樗幨鹿芾砼c藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

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