李 斌,馬萬鵬,裴文剛,鄭 瑩,段琦穎,盧亞賓,李建龍,蘇戰(zhàn)強(qiáng)

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,新疆 烏魯木齊 830052)

中國是世界上雙峰駝的主要分布區(qū)域,新疆阿勒泰地區(qū)是雙峰駝的主產(chǎn)地之一,不完全統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示:全國約有駱駝36.87萬峰,主要分布在新疆、內(nèi)蒙古、甘肅和青海,新疆存欄18.94萬峰,占全國的51.36%。從分布區(qū)域廣度上看,新疆分布最廣,且阿勒泰地區(qū)分布最為集中[1-2]。因駝奶對(duì)于人類炎癥、傷口感染[3]、肺結(jié)核[4]、糖尿病[5]等多種疾病具有治療或輔助治療的作用,且可作為優(yōu)質(zhì)保健營(yíng)養(yǎng)品備受人們的青睞。近年來新疆地區(qū)乳用駱駝養(yǎng)殖業(yè)作為特色產(chǎn)業(yè)得到了迅速發(fā)展,而駱駝乳房炎的流行是制約駝奶產(chǎn)量提高的關(guān)鍵瓶頸[6]。

受雙峰駝分布的影響,國外研究主要以非洲地區(qū)單峰駝為主,有關(guān)哈薩克斯坦等地雙峰駝乳房炎樣品中細(xì)菌多樣性的研究尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。目前新疆雙峰駝臨床型、隱型以及正常駝乳樣品中細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)以及主要致病菌種類、耐藥情況尚未探明[7]。本研究利用Illumina MiSeq 測(cè)序技術(shù)對(duì)比分析臨床型、隱型乳房炎及正常駝乳中微生物多樣性差異,同時(shí)對(duì)采集的58份乳房炎駝乳進(jìn)行細(xì)菌的分離鑒定,探究其耐藥情況,為阿勒泰地區(qū)駱駝乳房炎臨床治療及預(yù)防提供理論借鑒。

1 材料與方法

1.1 樣品及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物所有駱駝乳樣均采自阿勒泰地區(qū)福?？h、清河縣、吉木乃縣駱駝養(yǎng)殖場(chǎng)。7周齡雌性BALB/c小鼠,購自新疆醫(yī)科大學(xué)。

1.2 主要試劑細(xì)菌生化鑒定管購自杭州微生物試劑有限公司;科瑪嘉培養(yǎng)基購自杭州貝邦科技有限公司;營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、瓊脂粉、血瓊脂、麥康凱培養(yǎng)基均購自北京奧博星生物技術(shù)有限公司;藥敏片購自O(shè)XOID公司;細(xì)菌DNA提取試劑盒購自O(shè)MEGA公司;Taq DNA聚合酶、DL2000 DNA Marker均購自TIANGEN公司。

1.3 主要儀器電子天平,德國 Sartonrius 公司;PCR儀,美國Thermo Hybaid公司;超凈工作臺(tái),上海智城分析儀器制造有限公司;凝膠成像儀,美國Amersham Pharmacia Biotech公司;電泳槽、電泳儀,美國Bio-Rad公司。

1.4 樣品采集方法在駱駝養(yǎng)殖場(chǎng)無菌采集58份乳房炎及12份正常駱駝乳樣品,隨機(jī)挑選臨床型、隱型及正常駝乳樣品各3份,每份10 mL,干冰保存,用于細(xì)菌多樣性檢測(cè);其余樣品置于冰盒中,36 h內(nèi)送回實(shí)驗(yàn)室,用于細(xì)菌分離鑒定。乳房炎樣品采用臨床癥狀(乳區(qū)紅腫、乳汁絮狀、血乳)及CMT檢查法確定。

1.5 微生物菌群多樣性檢測(cè)將上述9份乳樣,分臨床型(clinical)、隱型(subclinical)、健康(health)3組,送至派森諾生物公司進(jìn)行宏基因組測(cè)序、分析。使用通用引物進(jìn)行細(xì)菌16S rRNA基因V3-V4區(qū)的PCR擴(kuò)增。338F:5′-ACTCCTACGGGAGGCA-GCA-3′;806R:5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′。反應(yīng)條件:98℃ 2 min;98℃ 15 s,55℃ 30 s,72℃ 30 s,共25個(gè)循環(huán);72℃ 5 min。測(cè)序結(jié)果經(jīng)去噪和ASV/OTU聚類后,進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

1.6 細(xì)菌分離純化與鑒定吸取1 mL乳樣加入無菌搖菌管內(nèi),加入9 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(含5%胎牛血清),置37℃恒溫?fù)u床增菌培養(yǎng)12～16 h。增菌后無菌環(huán)境下蘸取上述培養(yǎng)液,分別在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(含5%胎牛血清)、科馬嘉培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基上劃線,培養(yǎng)18～24 h后挑取不同單菌落,繼續(xù)劃線,重復(fù)上述操作5次,得到純化菌株,加入甘油置于-80℃冰箱保存。純化菌株隨后進(jìn)行革蘭染色,觀察其形態(tài),結(jié)合菌落形態(tài)及培養(yǎng)特性,初步確定細(xì)菌種類。

隨后,根據(jù)培養(yǎng)特性及染色結(jié)果選擇合理的生化鑒定管,進(jìn)行生化鑒定。

1.7 分子生物學(xué)鑒定使用細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒提取上述生化反應(yīng)特性有差異的菌株基因組DNA,以此為模板,以27F/1492R為引物,對(duì)其16S rRNA進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系(20 μL):基因組DNA 1 μL,上下游引物各 1 μL,Premix Taq 10 μL,ddH2O 7 μL。反應(yīng)條件:94℃ 5 min;94℃ 30 s,54℃ 30 s,72℃ 1.5 min,共35個(gè)循環(huán);72℃ 10 min。PCR反應(yīng)完成后經(jīng) 1%瓊脂糖凝膠在 20×TAE 電泳液中電泳 30 min,凝膠成像系統(tǒng)中記錄結(jié)果。然后將PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收與純化,膠回收產(chǎn)物送至上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.8 主要致病菌致病性測(cè)定選擇分離率最高的3種細(xì)菌,首先測(cè)定菌液CFU(重復(fù)操作3次),隨后將小鼠隨機(jī)分為3組,每組5只,腹腔注射菌液0.5 mL,相同環(huán)境下飼養(yǎng),小鼠自由飲食,觀察死亡情況,連續(xù)觀察7 d,用寇氏改良法計(jì)算其LD50,同時(shí)設(shè)立注射生理鹽水作為對(duì)照組。死亡小鼠解剖觀察病變情況后制作肝臟觸片,瑞氏染色觀察細(xì)菌形態(tài)。

1.9 藥敏試驗(yàn)移液器吸取100 μ L上述3種菌液,無菌涂布后緊貼不同藥物紙片,37℃溫箱中培養(yǎng)12 h,用游標(biāo)卡尺測(cè)定抑菌圈直徑,記錄。

2 結(jié)果

2.1 多樣性測(cè)序

2.1.1物種組成分析 3個(gè)樣本共得到634 492條有效序列,序列長(zhǎng)度分布在400～440 bp之間,峰值長(zhǎng)度為430 bp,單個(gè)樣本高質(zhì)量序列在74 000～88 000之間。9個(gè)樣品共鑒定出14門、180科、210屬的微生物,選取各組平均豐度值前10細(xì)菌,繪制不同分類水平下的物種組成圖,結(jié)果表明門分類水平下Proteobacteria、Bacteroidetes、Firmicutes為主要優(yōu)勢(shì)菌門,與健康乳樣相比乳房炎樣品中Proteobacteria升高,Bacteroidetes降低(圖1)。

圖1 細(xì)菌門分類水平的比較

屬水平下Aquabacterium、Acidovorax、Caulobacter、Rubrivivax、Asticcacaulis為主要優(yōu)勢(shì)菌屬,通過組間分析可知臨床組和隱型組相對(duì)于健康組Aquabacterium、Asticcacaulis升高,而Acidovorax則降低,其中Aquabacterium差異較為顯著,而Caulobacter、Rubrivivax豐度的降低更有利于臨床型乳房炎的發(fā)生(圖2)。

圖2 細(xì)菌屬分類水平的比較

2.1.2Alpha多樣性分析 以組內(nèi)樣品平均Chao指數(shù),繪制稀疏曲線(圖3),3組樣品的稀疏曲線逐漸趨于平坦,表明測(cè)序量趨于飽和,且物種多樣性臨床組>隱型組>健康組。以O(shè)TU豐度排列為橫坐標(biāo),以分組中OTU的均值的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)繪制豐度等級(jí)曲線(圖4),曲線橫軸跨度較大,表明物種豐度較高,符合分析要求。

圖3 相似度為97%條件下各樣本的稀疏曲線

圖4 相似度為97%條件下各樣本的豐度等級(jí)曲線

物種聚類采用average聚類法,選擇豐度top 10菌屬,對(duì)分組中各物種豐度平均值進(jìn)行歸一化處理后,繪制屬水平下物種組成熱圖(圖5)。結(jié)果顯示臨床型和隱型乳樣中Azospirillum、Novosphingobium、Acidovorax、Deinococcus豐度均降低,Aquabacterium、Asticcacaulis豐度升高;臨床型乳樣中Burkholderia、Ochrobactrum豐度明顯升高,Caulobacter、Rubrivivax明顯降低。

2.2 細(xì)菌分離及鑒定58份乳樣增菌經(jīng)選擇及鑒別培養(yǎng)基純化后,革蘭染色可發(fā)現(xiàn)呈葡萄串排列的陽性球菌、短鏈陽性球菌、革蘭陰性桿菌(圖6),生理生化鑒定結(jié)果表明疑似葡萄球菌果糖、凝固酶、V-P等反應(yīng)呈陽性(表1);短鏈陽性球菌CAMP、馬尿酸鈉、乳糖反應(yīng)陽性(表2);大多革蘭陰性桿菌甲基紅、硫化氫等顯陰性(表3),分別符合金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、大腸桿菌的反應(yīng)特性。結(jié)合16S RNA測(cè)序結(jié)果表明(圖7),58份乳房炎樣品中,共分離到金黃色葡萄球菌(27株)、大腸桿菌(16株)、鏈球菌(14株)、鮑曼不動(dòng)桿菌(8株)、肺炎克雷伯菌(3株)5種,68株細(xì)菌。

表1 金黃色葡萄球菌生化鑒定結(jié)果

表2 無乳鏈球菌生化鑒定結(jié)果

表3 大腸桿菌生化鑒定結(jié)果

A.金黃色葡萄球菌;B.無乳鏈球菌;C.大腸桿菌(1 000×)

M.DL2000 DNA Marker;1.陰性對(duì)照;2～24.部分菌株

2.3 主要菌株致病性測(cè)定結(jié)果經(jīng)測(cè)定金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、無乳鏈球菌的濃度分別為1.39×109,5.7×109,8.4×109CFU/mL,小鼠死亡情況及LD50如表4所示。腹腔注射12 h后開始出現(xiàn)精神萎頓,癱臥等癥狀,死亡小鼠大多發(fā)生在36～72 h之間,大多死亡小鼠剖檢可見肝、脾有水腫或壞死病變,少部分肝臟有出血點(diǎn),細(xì)菌形態(tài)與接種菌一致。

表4 部分細(xì)菌引起小鼠死亡情況

2.4 藥敏試驗(yàn)紙片法檢測(cè)結(jié)果顯示駝源金黃色葡萄球菌耐藥較為嚴(yán)重,已對(duì)青霉素、復(fù)方新諾明、頭孢西叮等7類藥物產(chǎn)生耐藥,對(duì)紅霉素、美羅培南、鏈霉素等敏感。大腸桿菌對(duì)青霉素、林可霉素耐藥,對(duì)環(huán)丙沙星、氨芐西林、鏈霉素等敏感。無乳鏈球菌對(duì)復(fù)方新諾明耐藥,對(duì)阿米卡星、鏈霉素等多數(shù)藥物敏感。

3 討論

雙峰駝雖然與單峰駝、雙峰駝、羊駝同屬駱駝科,但三者在生理功能[8]、產(chǎn)奶量[9]、環(huán)境適應(yīng)能力以及生活環(huán)境[10-11]等方面均有所差異,而國內(nèi)外關(guān)于雙峰駝乳房炎樣品中微生物菌群的研究尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。張敏等[12]比較分析了新疆克州和塔城地區(qū)牛奶、駝奶、馬奶、羊奶中細(xì)菌多樣性差異,結(jié)果表明駝奶中Proteobacteria占比87.96%,與本研究健康組的85.22%較為接近,而顯著低于牛奶中的97.00%;在屬水平上,塔城地區(qū)駝乳主要以Escherichia-Shigella、Enterobacter、Lactococcus為主,而本研究健康駝乳中優(yōu)勢(shì)菌屬為Aquabacterium(17.75%)、Acidovorax(20.44%)、Caulobacter(12.93%)存在顯著的差異。這種差異可能與塔城送檢駝乳被環(huán)境污染有關(guān),一般而言Escherichia-Shigella、Enterobacter屬的微生物可能引起動(dòng)物腹瀉或其他疾病,常作為致病菌被檢疫[13-14]。而本研究所涉及的乳樣已經(jīng)經(jīng)過乳房炎篩查且按無菌要求采集,并在采樣現(xiàn)場(chǎng)于液氮罐中保存運(yùn)輸,故檢測(cè)結(jié)果更具說服力。

PIYER[15]的調(diào)查數(shù)據(jù)表明,中東地區(qū)單峰駝乳腺炎主要病原菌為金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、大腸桿菌和克雷伯菌。 ABERA等[16]研究結(jié)果表明:埃塞俄比亞索馬里州駱駝乳房、擠奶桶及市售生乳樣品中,葡萄球菌(分離率:89.8%)、鏈球菌(53.7%)、大腸桿菌(31.5%)、沙門菌(17.6%)、克雷伯菌(5.6%)和腸桿菌(5.6%)為主要致病菌。SELIGSOHN 等[17]報(bào)道:尼亞牧民駱駝乳房炎平均感染率為46 %,病原菌以無乳鏈球菌、非金葡菌葡萄球菌和金黃色葡萄球菌為主,研究結(jié)果與本研究細(xì)菌分離結(jié)果基本一致?，斠览萚18]在阿勒泰地區(qū)福?？h的調(diào)查結(jié)果顯示,駱駝乳房炎陽性率為26%[10],與本研究臨床型乳房炎3.8%及隱型乳房炎14.7%有較大的差異。

綜合來看,隨著新疆駝乳產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展,駱駝乳房炎仍然普遍流行,且最主要的致病菌金黃色葡萄球菌耐藥性已經(jīng)較為嚴(yán)重,建議養(yǎng)殖企業(yè)及牧民根據(jù)藥敏結(jié)果合理用藥,同時(shí)應(yīng)堅(jiān)持科學(xué)養(yǎng)殖技術(shù)培訓(xùn),以最大限度控制乳房炎的發(fā)生。