金夢冬,張 靖,王 博,劉 田,2,劉祖培,張海森,2*,靳亞平,2,陳華濤,2*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院,陜西 楊凌 712100;2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物生物技術(shù)重點實驗室,陜西 楊凌 712100)

生物鐘系統(tǒng)是哺乳動物固有的內(nèi)在調(diào)控機(jī)制,參與調(diào)控機(jī)體大量行為活動和生理功能的晝夜節(jié)律性變化[1],對生物體的生存與其對環(huán)境的適應(yīng)具有重要意義。在自然條件下,動物體通過接收外界光線明暗變化的周期性信號調(diào)節(jié)自身生理功能以維持生存。在實際生產(chǎn)中,研究發(fā)現(xiàn)奶牛乳汁中乳蛋白含量具有明顯的季節(jié)性變化,且在12月份達(dá)到峰值[2]。有數(shù)據(jù)表明,泌乳奶牛體內(nèi)醛固酮、孕酮、鈉、鉀具有明顯的晝夜節(jié)律性變化,而皮質(zhì)醇受時間的影響較小[3]。泌乳奶牛血漿中的生長激素和泌乳素具有晝夜節(jié)律性變化[4]。檢測妊娠與非妊娠兩組奶牛血清的葡萄糖、尿素、肌酐、總膽固醇、總脂質(zhì)等指標(biāo),結(jié)果顯示葡萄糖和尿素具有明顯的晝夜節(jié)律性變化,同時發(fā)現(xiàn)飼養(yǎng)管理、環(huán)境等因素可對奶牛激素水平及其相關(guān)生理功能的節(jié)律性變化產(chǎn)生顯著影響[5]。NIKKHAH等[6]通過給不同胎次泌乳奶牛在9:00和21:00供應(yīng)精飼料和粗飼料,分析產(chǎn)奶量、24 h采食量以及血液代謝產(chǎn)物的變化,結(jié)果表明:飼喂時間的變化會改變奶牛的采食量,但對經(jīng)產(chǎn)奶牛的產(chǎn)奶量幾乎沒有影響;在21:00飼喂精飼料可提高經(jīng)產(chǎn)奶牛的乳脂率,但不影響初產(chǎn)奶牛的乳脂率,并且在9:00飼喂時結(jié)果正好相反。上述數(shù)據(jù)表明飼喂時間的改變對泌乳奶牛的乳脂率有影響;胎次可能是改變奶牛乳脂率的重要因素。QUIST等[7]發(fā)現(xiàn)泌乳奶牛產(chǎn)奶量、乳蛋白率、SCC等也表現(xiàn)晝夜節(jié)律性變化。敲除奶牛乳腺上皮細(xì)胞中的生物鐘核心基因PER2后抑制了SREBF1和PPARG的表達(dá),細(xì)胞凋亡相關(guān)通路Caspase-8基因mRNA表達(dá)量顯著上升,從而下調(diào)乳腺上皮細(xì)胞中脂肪酸的合成和甘油三酯的生成以及脂滴的分泌等[8]。降低小鼠乳腺上皮細(xì)胞中的生物鐘核心基因CLOCK的表達(dá)水平,顯著降低脂肪酸合成酶編碼基因FASN的表達(dá),對乳脂合成有明顯的抑制作用[9],而奶牛的CLOCK蛋白與小鼠高度相似,兩者CDS區(qū)的相似性為90.3%[10]。哺乳動物在長期的壓力或者疾病狀態(tài)下,晝夜節(jié)律會發(fā)生紊亂,當(dāng)奶?；既榉垦讜r,奶牛生理活動的節(jié)律性也會受到嚴(yán)重影響[11]。

乳房炎是奶牛養(yǎng)殖場中最常見且頻發(fā)的疾病,同時也是影響奶牛泌乳性能的重要因素。奶牛乳房炎的發(fā)生會降低奶牛泌乳性能,縮短奶牛利用期限,提高奶牛淘汰率,是影響奶牛養(yǎng)殖場經(jīng)濟(jì)效益的重要因素,不利于我國奶牛產(chǎn)業(yè)、乳品行業(yè)的快速發(fā)展。本研究通過檢測健康組和乳房炎組奶牛不同時間點血液和乳汁樣品的氧化應(yīng)激水平、炎性因子含量與生物鐘基因表達(dá)的差異性,從時間生物學(xué)角度探究奶牛乳房炎發(fā)生時的晝夜變化特征,以期為乳房炎的防治提供參考借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗樣品來源與采集試驗樣品采集于關(guān)中地區(qū)某一規(guī)?；膛?選取處于泌乳期的健康狀態(tài)(n=10)和患乳房炎(n=5)的3～4胎次(5～6歲)荷斯坦奶牛。按照擠奶時間(0:00、8:00與20:00)采集奶牛的血液和乳汁樣品。本研究采集樣本所用的臨床型乳房炎奶牛根據(jù)牛場生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)和實驗室檢查綜合判定:先通過牛舍現(xiàn)場診斷奶牛乳房出現(xiàn)紅腫熱痛、乳汁變性等臨床乳房炎癥狀,同時對乳汁樣本通過氫氧化鈉凝乳法和乳體細(xì)胞計數(shù)(somatic cell counts,SCC)結(jié)果(SCC >100萬個/mL)作出實驗室診斷(注:一般認(rèn)為,SCC在50萬個/mL以內(nèi)為正常,而超過50萬個/mL為隱性乳房炎,超過100萬個/mL為臨床型乳房炎)。

1.2 試驗試劑β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)測試盒、丙二醛(MDA)測試盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)測試盒、過氧化氫酶(CAT)測試盒、過氧化氫(H2O2)測試盒、超氧化物岐化酶(SOD)測試盒、總抗氧化能力(T-AOC)測試盒、總膽固醇(T-CHO)測試盒購自南京建成生物工程研究所;葡萄糖測定試劑盒購自上海榮盛生物藥業(yè)有限公司;磷酸緩沖鹽溶液(PBS)購自北京索萊寶科技有限公司;TRIzol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司;ChamQ SYBR qPCR Master Mix購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司;紅細(xì)胞裂解液購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.3 主要儀器設(shè)備普通離心機(jī)購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司;低溫離心機(jī)購自德國艾本德股份公司;全波長酶標(biāo)儀、熒光定量RCR儀、普通PCR儀購自美國伯樂(BIO-RAD)公司。

1.4 奶牛乳成分測定統(tǒng)計采樣當(dāng)天健康組和乳房炎組奶牛的日產(chǎn)奶量,按照0:00、8:00與20:00 共3個擠奶時間點,在每次擠奶中期分別收集健康組和乳房炎組每頭奶牛的乳汁樣品50 mL,密封后立即送往陜西省奶牛生產(chǎn)性能測定管理站進(jìn)行乳成分檢測。

1.5 奶牛血漿中葡萄糖和總膽固醇含量測定根據(jù)操作說明書,分別將各試劑依次加入管中,混勻,37℃放置10 min,測D505 nm值。計算公式:血漿中葡萄糖含量(mmol/L)=樣本管D505 nm/校準(zhǔn)管D505 nm× 校準(zhǔn)液濃度。根據(jù)操作說明書分別將各試劑依次加入管中,混勻,37℃放置10 min,測D505 nm值。計算公式:血漿中膽固醇含量(mmol/L)=(D樣本-D空白)/(D標(biāo)準(zhǔn)-D空白)×C標(biāo)準(zhǔn)。

1.6 奶牛血漿中氧化應(yīng)激水平測定分別于0:00、8:00與20:00采集健康組和乳房炎組每頭奶牛的血液樣品,收集于肝素鈉抗凝管中,室溫放置2 h后于2 000 r/min離心5 min,收集上層血漿,并于-80℃保存。

1.6.1奶牛血漿中β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶測定 根據(jù)操作說明書分別將各試劑依次加入管中,混勻,測各孔D400 nm值。計算公式:血漿中β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(β-N-acetylglucosaminidase,NAG)活力(U/L)=(測定D400 nm- 對照D400 nm)/(標(biāo)準(zhǔn)D400 nm-空白D400 nm)×C標(biāo)準(zhǔn)(0.6 mmol/L)× 1 000÷反應(yīng)時間(15 min)。

1.6.2奶牛血漿中丙二醛含量測定 根據(jù)操作說明書分別將各試劑依次加入管中,混勻,95℃水浴40 min,流水冷卻至室溫,3 500 r/min離心10 min,取上清250 μL,測量各孔D532 nm值。計算公式:血漿中丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量(μmol/L)=(測定D532 nm-對照D532 nm)/(標(biāo)準(zhǔn)D532 nm-空白D532 nm)×C標(biāo)準(zhǔn)(10 nmol/mL)× 樣本測試前稀釋倍數(shù)。

1.6.3奶牛血漿中谷胱甘肽過氧化物酶活力測定 酶促反應(yīng):根據(jù)操作說明書,分別將各試劑依次加入管中,混勻,3 500 r/min離心10 min,取上清1 mL。顯色反應(yīng):根據(jù)操作說明書,分別將各試劑依次加入管中,混勻,室溫靜置15 min后,測量D412 nm值。計算公式:血漿中谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)活力 =(非酶管D412 nm-酶管D412 nm)/(標(biāo)準(zhǔn)管D412 nm-空白管D412 nm)×C標(biāo)準(zhǔn)(20 μmol/L) × 樣本稀釋前倍數(shù) × 稀釋倍數(shù)。

1.6.4奶牛血漿中過氧化氫酶測定 根據(jù)操作說明書,分別將各試劑加入管中,混勻,測量各管D405 nm值。ΔD=對照D405 nm-測定D405 nm。計算公式:血漿過氧化氫酶(catalase,CAT)活力(U/mL)=ΔD×271÷V樣÷t×n。注:271為斜率的倒數(shù),是常數(shù);V樣是指取樣量,0.1 mL;t指反應(yīng)時間,即60 s;n是指樣本測試前的稀釋倍數(shù)。

1.6.5奶牛血漿中過氧化氫含量測定 根據(jù)操作說明書分別將各試劑加入管中,混勻,測量各孔D405 nm值。計算公式:過氧化氫(hydrogen peroxide,H2O2)含量(mmol/L)=(測定D405 nm-空白D405 nm)/(標(biāo)準(zhǔn)D405 nm-空白D405 nm)× 163。

1.6.6奶牛血漿中超氧化物歧化酶測定 根據(jù)操作說明書分別將各試劑加入管中,混勻,37℃孵育20 min,測量D450 nm值。計算公式:超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)抑制率(%)=[(對照D450 nm-對照空白D450 nm)-(測定D450 nm-測定空白D450 nm)]/(對照D450 nm-對照空白D450 nm)×100%;SOD活力(U/mL)=SOD抑制率 ÷ 50%×反應(yīng)體系稀釋倍數(shù)(0.24 mL/0.02 mL)×樣本測試前稀釋倍數(shù)。

1.6.7奶牛血漿中總抗氧化水平測定 根據(jù)操作說明書分別將各試劑依次加入管中,室溫6 min。反應(yīng)結(jié)束后盡快測量各孔D405 nm值并計算總抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC),標(biāo)準(zhǔn)曲線中Trolox的濃度分別為0.1,0.2,0.4,0.8,1.0 mmol/L。

1.7 奶牛乳汁樣品氧化應(yīng)激水平測定方法同1.6。

1.8 實時熒光定量PCR檢測奶牛血液炎性相關(guān)因子與生物鐘基因mRNA在健康組與乳房炎組的表達(dá)變化將EDTA-K2的抗凝管標(biāo)記編號,采集0:00、8:00與20:00共3個時間點健康組與乳房炎組奶牛的血液樣品后及時低溫冷凍保存;吸取250～300 μL采集血液樣品至離心管中,加入6倍體積的紅細(xì)胞裂解液,上下顛倒混勻,室溫裂解5 min;4 000 r/min離心3 min后棄去上清,即獲得白細(xì)胞沉淀,沉淀為白色或淡紅色(注:如果紅細(xì)胞裂解不完全,重復(fù)此步驟);向獲得的沉淀中加入2倍體積的1 × PBS溶液洗滌1～2次,4 000 r/min 離心3 min后棄去上清;加入1 mL TRIzol溶液至離心后的樣品中,反復(fù)吹打混勻,室溫靜置5 min;4℃、12 000 r/min離心 5 min,將上清轉(zhuǎn)移到新的管中;加入0.2 mL 氯仿,搖晃混勻,室溫靜置5 min,4℃、1 2000 r/min 離心15 min,將水樣層加入新的管中;向水樣層加入等體積異丙醇,顛倒混勻,室溫靜置10 min,4℃、12 000 r/min離心10 min,去上清;加入1 mL 75%乙醇,渦旋振蕩后4℃、7 500 r/min離心5 min,除去上清后重復(fù)此步驟;去除上清,7 500 r/min離心30 s,除去液體。離心管底部沉淀即為提取的全血RNA樣品,待沉淀半透明后加入適量的DNase/RNase-Free水,測定總RNA濃度后根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說明書進(jìn)行后續(xù)試驗或置于-80℃?zhèn)溆?。引物信息見?1。

1.9 實時熒光定量PCR檢測奶牛乳汁炎性相關(guān)因子、生物鐘基因及酪蛋白基因mRNA在健康組與乳房炎組的表達(dá)變化收集0:00、8:00與20:00共3個時間點健康組和乳房炎組每頭奶牛的乳汁樣品各100 mL左右,密封并做好標(biāo)記后置于低溫狀態(tài)保存?zhèn)溆?將采集的牛乳于低溫離心機(jī)1 000 r/min離心10 min,除去濃稠的上層乳脂,保留下層渾濁液體(約 10 mL),加入等體積1 × PBS進(jìn)行清洗,低溫離心機(jī)1 000 r/min離心10 min,棄上層液體并保留下層少量渾濁液體,此步驟可重復(fù)多次,直至管內(nèi)液體澄清,棄上清;將上述得到的沉淀轉(zhuǎn)移至新的離心管中,12 000 r/min離心10 min后棄去上清;后續(xù)步驟同1.8。

1.10 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計與分析本試驗利用Excel 2016、GraphPad Prism 8.0等軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和統(tǒng)計學(xué)分析。所有處理的數(shù)據(jù)均以“平均值 ±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示,并利用t檢驗或Two-way ANOVA進(jìn)行差異統(tǒng)計學(xué)分析。P<0.05被認(rèn)為具有顯著性差異。組間比較:*表示P<0.05,**表示P<0.01,***表示P<0.001,****表示P<0.000 1;時間點比較:#表示P<0.05,##表示P<0.01,###表示P<0.001,####表示P<0.000 1。

2 結(jié)果

2.1 健康組和乳房炎組奶牛日產(chǎn)奶量與乳成分的差異如圖1A、G所示,4%氫氧化鈉凝乳法檢測健康組和乳房炎組的乳汁樣品,結(jié)果顯示健康組乳汁無明顯變化,乳房炎組乳汁呈現(xiàn)透明狀,并有凝乳塊形成;DHI檢測結(jié)果顯示健康組與乳房炎組奶牛乳汁的SCC具有顯著性差異(P<0.000 1),并且乳房炎組奶牛乳汁的SCC顯著高于100萬個/mL。上述數(shù)據(jù)表明本研究采集的樣品準(zhǔn)確無誤。如圖1B～H所示,健康組和乳房炎組奶牛日產(chǎn)奶量平均值分別為39.142和34.840 kg,乳房炎組奶牛的日產(chǎn)奶量顯著低于健康組(P<0.05)。DHI檢測結(jié)果顯示健康組與乳房炎組奶牛乳汁的乳脂率、乳蛋白率、乳糖率、總固體、SCC及尿素氮含量有顯著性差異(P<0.001);相較于健康組,乳房炎組奶牛的乳脂率、乳糖率、總固體與尿素氮比率在3個時間點均降低;乳房炎組的乳蛋白率和SCC相較于健康組在3個時間點均升高,SCC差異顯著(P<0.01);乳房炎組的乳糖率在8:00顯著低于20:00(P<0.05),健康組的尿素氮在8:00顯著低于20:00(P<0.05)。在3個時間點,健康組的乳脂率和總固體差異不顯著,但呈現(xiàn)先下降后上升的變化趨勢;乳房炎組的乳脂率、總固體和尿素氮在3個時間點差異不顯著,均呈現(xiàn)先下降后上升的變化趨勢。上述結(jié)果表明,乳房炎可導(dǎo)致奶牛日產(chǎn)奶量與乳品質(zhì)下降;同時,檢測結(jié)果提示奶牛乳成分含量具有晝夜差異。

A.氫氧化鈉凝乳實驗;B.日產(chǎn)奶量;C.乳脂率;D.乳蛋白率;E.乳糖率;F.總固體;G.體細(xì)胞數(shù);H.尿素氮。*表示P<0.05,**表示P<0.01,***表示P< 0.001,****表示P<0.000 1;#表示P<0.05,##表示 P<0.01,###表示 P<0.001,####表示 P<0.000 1;*代表組間比較,#代表時間比較。下同

表1 實時熒光定量PCR引物信息

2.2 乳房炎對奶牛血漿葡萄糖和膽固醇含量的影響通過酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒檢測3個時間點健康組和乳房炎組奶牛血漿樣品中的葡萄糖和總膽固醇含量,如圖2所示,乳房炎組的葡萄糖含量在3個時間點均顯著高于健康組(P<0.000 1),同時健康組葡萄糖含量呈現(xiàn)下降的趨勢,而乳房炎組呈現(xiàn)先下降再上升的變化趨勢。乳房炎組奶牛血漿中總膽固醇含量顯著低于健康組(P<0.000 1),健康組與乳房炎組奶牛血漿的膽固醇含量均呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢,并且在8:00時含量最高。

A.葡萄糖含量;B.膽固醇含量

2.3 健康組和乳房炎組奶牛血漿氧化應(yīng)激水平的變化通過ELISA試劑盒檢測奶牛血漿中氧化應(yīng)激相關(guān)因子(β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活力、丙二醛含量、谷胱甘肽過氧化物酶活力、過氧化氫酶活力、過氧化氫含量、超氧化物歧化酶活力和總抗氧化能力)的變化,結(jié)果如圖3所示。與健康組相比,乳房炎組奶牛的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活力和過氧化氫含量升高且差異顯著(P<0.000 1),乳房炎組血漿中的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活力在0:00和8:00相較于健康組差異顯著(P<0.05),過氧化氫含量在0:00和20:00差異顯著(P<0.05)。健康組奶牛血漿中的丙二醛含量在3 個時間點均不具有顯著性差異,乳房炎組的丙二醛含量在0:00和8:00以及8:00和20:00差異顯著(P<0.01)。過氧化氫酶活力在2組中差異顯著(P<0.01);在0:00與20:00,乳房炎組的過氧化氫酶活力均顯著升高于健康組(P<0.05,P<0.000 1),乳房炎組奶牛在3 個時間點均差異顯著(P<0.05)。

3個時間點谷胱甘肽過氧化物酶活力的變化與過氧化氫酶活力的變化趨勢相似?？偪寡趸芰υ诮】到M和乳房炎組的3個時間點均呈現(xiàn)下降趨勢,且組間差異顯著(P<0.05)。乳房炎組血漿中的超氧化物歧化酶活力在3個時間點具有高于健康組的趨勢,但是差異不顯著。上述結(jié)果表明,健康組和乳房炎組奶牛血漿的氧化應(yīng)激水平具有晝夜差異,乳房炎組奶牛的氧化與抗氧化水平失衡,總抗氧化能力下降。

2.4 健康組和乳房炎組奶牛乳汁中氧化應(yīng)激水平的變化采用ELISA試劑盒檢測奶牛乳汁的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活力、丙二醛含量和過氧化氫酶活力,結(jié)果如圖4所示。在3個時間點,乳房炎組的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活力顯著高于健康組(P<0.000 1),且差異顯著。丙二醛含量與β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活力的變化趨勢完全相反,健康組奶牛乳汁中的丙二醛含量顯著高于乳房炎組(P<0.01)。健康組奶牛乳汁中的丙二醛含量在3個時間點呈現(xiàn)先下降再上升的晝夜變化(P<0.001),乳房炎組的丙二醛含量在3個時間點無顯著性差異。

A.β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活力;B.丙二醛含量;C.過氧化氫酶活力

健康組奶牛乳汁中的過氧化氫酶活力在3個時間點呈現(xiàn)先下降再上升的晝夜變化(P<0.01),而乳房炎組在3個時間點呈現(xiàn)持續(xù)下降的變化;相較于健康組,乳房炎組奶牛乳汁中的過氧化氫酶活力在0:00和20:00均降低,且差異顯著(P<0.05),而在8:00的變化與之相反且差異顯著(P<0.05)。上述結(jié)果表明,健康組和乳房炎組奶牛乳汁中的氧化應(yīng)激水平具有晝夜差異,且乳房炎組奶牛的丙二醛含量和過氧化氫酶活力均降低,提示其抗氧化能力下降。

2.5 奶牛血液中炎性相關(guān)因子與生物鐘基因mRNA在健康組與乳房炎組的表達(dá)變化通過實時熒光定量PCR檢測健康組和乳房炎組奶牛血液中的炎性因子和生物鐘基因mRNA的表達(dá)變化,結(jié)果如圖5所示。

A.炎性相關(guān)因子mRNA的表達(dá);B.生物鐘基因mRNA的表達(dá)

乳房炎組中炎性相關(guān)因子IL-8、IL-1β與IL-6 mRNA的表達(dá)量均高于健康組,其中IL-8與IL-β基因的表達(dá)組間差異顯著(P<0.05),抗炎因子IL-10 mRNA的表達(dá)變化與之相反,在乳房炎組中的表達(dá)量顯著下降(P<0.000 1)。健康組和乳房炎組奶牛血液中生物鐘基因NR1D1與CRY1 mRNA的表達(dá)變化組間差異顯著(P<0.05)。健康組奶牛血液中的生物鐘基因NR1D1、CRY1、PER2、RORα、DBP在3個時間點均呈現(xiàn)先下降再上升的趨勢,且具有晝夜差異;乳房炎組中血液生物鐘基因CRY1、RORα、BMAL1、DBP的表達(dá)變化依然遵循先下降再上升的變化趨勢,但NR1D1的表達(dá)水平與健康組完全相反,PER2的表達(dá)持續(xù)下降,在20:00時達(dá)到最低。上述結(jié)果表明,奶牛血液中的炎性相關(guān)因子和生物鐘基因的表達(dá)具有差異,并提示奶牛血液中生物鐘基因的表達(dá)和乳房炎的發(fā)生發(fā)展具有潛在聯(lián)系。

2.6 奶牛乳汁中炎性相關(guān)因子、生物鐘基因與酪蛋白基因mRNA在健康組與乳房炎組的表達(dá)變化如圖6所示。奶牛乳汁中的炎性因子存在晝夜變化,與健康組相比,乳房炎組中促炎因子CCL5、IL-1β、IL-8、IL-6、TNF-α的表達(dá)均顯著升高(P<0.01),抗炎因子IL-10顯著降低(P<0.000 1)。生物鐘基因NR1D1、BMAL1、DBP顯著低于健康組(P<0.000 1),酪蛋白相關(guān)基因CSN1S1、CSN2、CSN3均顯著低于健康組(P<0.001)。在0:00、8:00與20:00時健康組中酪蛋白基因CSN1S1、CSN2、CSN3在0:00處于最低,之后逐漸升高,在20:00達(dá)到最高。上述結(jié)果表明,奶牛乳汁中的炎性相關(guān)因子及生物鐘基因表達(dá)具有晝夜差異,提示乳汁中生物鐘基因的表達(dá)與乳房炎的發(fā)生發(fā)展存在潛在聯(lián)系。

3 討論

乳房炎發(fā)病率高、且易反復(fù)發(fā)作,可嚴(yán)重?fù)p害奶牛養(yǎng)殖場的經(jīng)濟(jì)效益。目前全球2.2億頭奶牛中約有1/3患乳房炎[12],我國奶牛乳房炎發(fā)病率高達(dá)60%～70%,每年損失約30億元人民幣[13]。乳房炎引起的奶牛泌乳性能下降是造成養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟(jì)損失的主要因素[14]。因此,探究奶牛乳房炎的發(fā)生發(fā)展規(guī)律,并制定合理的防治措施,是確保奶牛養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的前提條件。

目前,奶牛泌乳性能、氧化應(yīng)激水平以及生物鐘基因的表達(dá)變化與奶牛乳房炎的發(fā)生發(fā)展過程是否具有一定聯(lián)系,尚不清楚。本研究通過測定健康組和乳房炎組奶牛一天的3個時間點(0:00、8:00與20:00)乳汁和血液樣品的不同指標(biāo)并進(jìn)行分析。不同時間點乳成分檢測結(jié)果顯示,在健康組中,尿素氮在8:00和20:00差異顯著(P<0.05),乳脂率和總固體含量具有晝夜差異,且在8:00含量最低。這些結(jié)果提示奶牛乳成分具有晝夜節(jié)律性變化,這為實際生產(chǎn)中根據(jù)對不同乳成分的需求制定合理的擠奶時間提供了前期理論基礎(chǔ)。同時,試驗結(jié)果顯示乳房炎組的乳脂率顯著低于健康組,造成這個結(jié)果的原因可能是臨床型乳房炎奶牛的乳腺組織受損,抑制乳腺上皮細(xì)胞的乳脂合成,進(jìn)而導(dǎo)致乳脂率降低。

血液中的葡萄糖是機(jī)體各組織器官正常代謝活動的能量來源。反芻動物血液中的葡萄糖主要來自于兩個方面:一是由瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生的丙酸異生;二是由飼料蛋白質(zhì)產(chǎn)生的糖異生[15]。本研究結(jié)果表明,乳房炎組奶牛血液中的葡萄糖含量顯著高于健康組,可能是由于乳房炎造成的奶牛瘤胃代謝紊亂,葡萄糖與糖原轉(zhuǎn)化受阻。膽固醇是維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)所必需的基本分子,對各種正常的生物功能至關(guān)重要,膽固醇的升高與很多疾病的發(fā)生密切相關(guān),包括肝硬化、黏液性水腫、腎病綜合征、膽總管阻塞、乳房炎等[16]。本研究中發(fā)現(xiàn)乳房炎組膽固醇的含量顯著低于健康組,這可能反映在能量負(fù)平衡條件下乳房炎奶牛機(jī)體對能量的消耗增加[17],或由于機(jī)體生理功能出現(xiàn)障礙,膽固醇合成減少,從而導(dǎo)致脂蛋白含量降低[18]。另外,通過比對不同時間點血液中葡萄糖與膽固醇含量的變化,我們發(fā)現(xiàn)健康組奶牛血液一天中膽固醇的變化幅度較大,且這種變化幅度伴隨乳房炎的發(fā)生而減弱?？赡苁怯捎谌榉垦捉M奶牛機(jī)體處于應(yīng)激狀態(tài)并且代謝途徑受阻,導(dǎo)致患乳房炎奶牛對日糧中脂類物質(zhì)的吸收和轉(zhuǎn)化受阻,進(jìn)而致使膽固醇合成量減少且變化幅度減弱。

氧化應(yīng)激是指由于機(jī)體內(nèi)的活性氧自由基ROS(reactive oxygen species)和活性氮自由基RNS(reactive nitrogen species)失衡[19],生成大量的氧化中間產(chǎn)物,使機(jī)體處于能量負(fù)平衡狀態(tài)。哺乳動物體內(nèi)發(fā)生氧化應(yīng)激后,機(jī)體的生理狀況和代謝水平發(fā)生急劇改變,導(dǎo)致動物機(jī)體對疾病的抵御能力下降產(chǎn)生多種慢性疾病。奶牛發(fā)生氧化應(yīng)激可影響奶牛的生長發(fā)育和生產(chǎn)性能。氧化應(yīng)激對乳房炎癥有重要的調(diào)控作用。奶牛在泌乳初期由于活性氧生成增加導(dǎo)致氧化和抗氧化作用失衡,致使機(jī)體免疫應(yīng)答能力下降,奶牛乳腺組織更易被病菌侵襲并誘發(fā)乳房炎[20]。在隱性乳房炎中,血液中抗氧化水平顯著降低,但紅細(xì)胞中脂質(zhì)過氧化物水平升高[21]。超氧化物岐化酶(SOD)、血漿過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)是哺乳動物體內(nèi)的抗氧化酶,參與調(diào)控機(jī)體的氧化和抗氧化平衡。SOD通過歧化超氧陰離子形成的H2O2解除超氧陰離子對細(xì)胞的損傷作用[22]。發(fā)生氧化應(yīng)激時,自由基攻擊膜脂蛋白和多不飽和脂肪酸時可產(chǎn)生155種含氧化合物,其中包括丙二醛(MDA)和共軛二烯在內(nèi)的醛類化合物[23]。一般通過同時檢測MDA和SOD來反映出細(xì)胞的氧化損傷程度。NAG溶菌酶是檢測乳腺上皮細(xì)胞的完整性的標(biāo)志之一[24]。本研究結(jié)果顯示乳房炎組奶牛乳汁中的NAG含量顯著高于健康組,且在3個時間點差異顯著,表明NAG的含量可能受到生物鐘的調(diào)控。乳房炎組的CAT與GSH-Px含量在3個時間點差異顯著,SOD無統(tǒng)計學(xué)差異,但其變化趨勢與CAT、GSH-Px一致,表明機(jī)體內(nèi)抗氧化酶的變化與生物鐘密切相關(guān)。在本研究中,乳房炎組的總抗氧化能力降低,表明乳房炎組奶牛消除氧自由基的能力下降,體內(nèi)的氧化與抗氧化作用處于失衡狀態(tài),且過氧化反應(yīng)增強(qiáng),這會導(dǎo)致機(jī)體逐漸發(fā)展為亞健康狀態(tài),進(jìn)而導(dǎo)致日產(chǎn)奶量降低影響經(jīng)濟(jì)效益。

近年來,關(guān)于哺乳動物生物鐘的研究越來越多。有研究指出奶牛乳腺的分泌活動受到生物鐘的調(diào)控[25],奶牛妊娠晚期暴露于慢性光-暗相移環(huán)境下可能導(dǎo)致奶牛的產(chǎn)奶量下降[26]。胡良宇[2]的研究表明敲低PER2基因可以明顯促進(jìn)分娩后小鼠的乳腺腺泡生長發(fā)育,并且提高酪蛋白CSN1S1、CSN2和CSN3表達(dá)量。另外,有研究指出生物鐘蛋白BMAL1、CRY、REV-ERB可影響炎癥細(xì)胞因子與趨化因子的表達(dá),從而調(diào)控機(jī)體的免疫功能[27]。在白細(xì)胞亞群中,包括先天性和適應(yīng)性免疫細(xì)胞,如單核細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞(NK)、中性粒細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞等,都發(fā)現(xiàn)了生物鐘的節(jié)律性振蕩[28]。生物鐘核心基因NR1D1缺失會影響神經(jīng)元的正常生理功能,導(dǎo)致小鼠海馬區(qū)的促炎因子增加[29]。本研究檢測了不同時間點健康組和乳房炎組奶牛血液和乳汁中炎性相關(guān)因子、生物鐘基因以及酪蛋白基因的表達(dá)變化,結(jié)果表明,在血液中,乳房炎組的促炎因子IL-1β、IL-8、IL-6較健康組升高;CCL5、IL-1β、IL-8、IL-6、抗腫瘤因子(TNF-α)在健康組和乳房炎組中的含量改變且呈現(xiàn)晝夜差異,生物鐘基因NR1D1的表達(dá)在健康組和乳房炎組中具有顯著性差異,且在0:00顯著降低。在乳汁中,乳房炎組的CCL5、IL-1β、IL-8、IL-6、TNF-α mRNA表達(dá)水平顯著高于健康組,且具有晝夜差異;CSN1S1、CSN2、CSN3的mRNA表達(dá)水平均顯著低于健康組,且隨時間變化不斷上升,在20:00達(dá)到最高;NR1D1、BMAL1、DBP顯著低于健康組;在健康組中,生物鐘基因NR1D1、DBP的mRNA的表達(dá)水平與酪蛋白基因CSN1S1、CSN2、CSN3呈現(xiàn)相反趨勢。這些結(jié)果表明,由于奶牛乳房發(fā)生的炎癥激活了機(jī)體的免疫系統(tǒng),從而導(dǎo)致乳房炎組奶牛血液和乳汁中炎性相關(guān)因子發(fā)生改變,而奶牛乳汁中的體細(xì)胞主要為白細(xì)胞,白細(xì)胞炎性因子含量的變化可能引起生物鐘基因表達(dá)量發(fā)生改變[27]。上述結(jié)果提示,生物鐘可能參與炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展且與酪蛋白基因的表達(dá)變化密切相關(guān),進(jìn)一步提示生物鐘基因(NR1D1、BMAL1、DBP)的表達(dá)變化與奶牛乳房炎的發(fā)生發(fā)展具有潛在聯(lián)系,乳體細(xì)胞中生物鐘基因的表達(dá)變化或可作為奶牛乳房炎診斷的潛在指標(biāo)。