查代巧 貝 琪 康子桐 朱小杰 李東曉 和文祥 田海霞

(西北農(nóng)林科技大學資源環(huán)境學院,陜西 楊凌 712100)

微生物可以利用石油污染物為碳源進而分解污染物降低其毒性,因此微生物技術在石油污染修復中備受關注[1]。獲得高效石油降解微生物對于強化微生物在石油污染修復中的應用具有重要意義。研究表明,紡綞形賴氨酸芽孢桿菌(Lysinibacillusfusiformis) 23-1在石油為2%(質(zhì)量分數(shù))的條件下對石油的降解率達到了57%[2];代爾夫特菌(Delftiasp.) FM6-1和無色桿菌(Achromobactersp.) FM6-1均能降解多環(huán)芳烴(萘、菲、熒蒽和芘)和脂肪烴(C12、C16、C20和C32)[3];好氧芽胞桿菌(Aeribacilluspallidus) UCPS2能在50 ℃條件下降解蒽(降解率92%～96%)、芴(降解率83%～86%)、菲(降解率16%～54%)和芘(降解率51%～71%)[4];紅串紅球菌(Rhodococcuserythropolis) CD130和CD167對土壤中石油的降解率分別達到了29.8%和38.4%[5]。以上微生物均表現(xiàn)出較好的石油降解效果,但在實際應用中,微生物的活性易受到環(huán)境因素的影響,導致修復效果受到影響。楊立瓊[6]的研究表明石油降解菌在最適生長溫度、pH、氮源、磷源等條件下,微生物對石油的降解率提高了20～30百分點。CUI等[7]對溫度、pH、氧氣等條件優(yōu)化后,微生物對石油的降解率提高了10～30百分點。因此分離高效石油降解菌并探明其最適生長條件,對提高它在原位復雜環(huán)境中的定殖、降解效果至關重要。

微生物對石油的降解機理探究不僅可以判斷微生物對石油的潛在降解能力,還有助于探索修復方法[8-9]。目前認為微生物降解石油的機理首先是石油與微生物充分接觸或者進入微生物細胞內(nèi),后在微生物酶的作用下被催化氧化,最終經(jīng)過三羧酸循環(huán)被徹底分解為二氧化碳和水。部分微生物在石油污染脅迫條件下,會產(chǎn)生生物表面活性劑等具有兩親性(親水性和疏水性)的物質(zhì)來改變微生物細胞表面特性,或者增加石油在水中的溶解度,進而增加微生物細胞與石油接觸的可能性,從而提升石油的生物利用度[10]。因此對微生物產(chǎn)生物表面活性劑及石油降解基因的探索是研究石油降解菌降解石油的基礎。

本研究旨在從石油污染土壤中篩選出高效石油降解菌,優(yōu)化其石油降解條件,同時對其石油降解機理進行初步探究,以評估菌株的石油降解能力,為石油污染的微生物修復技術研究和應用提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品的采集

選擇延長和南陽油田廢棄油井和油泥堆放點的石油污染土壤,采集5～20 cm深處的土樣,充分混勻后采用四分法將土樣分裝于潔凈的自封袋中,4 ℃冷藏備用。土壤石油含量(以總石油烴計)測定參考文獻[5]的方法,采樣點信息見表1。

表1 采樣點信息1)Table 1 Sampling points information

1.2 石油降解菌的篩選及降解能力監(jiān)測

稱取3 g土樣,分別加入到30 mL的4種培養(yǎng)基(培養(yǎng)基成分及添加石油濃度見表2)中,置于恒溫搖床(180 r/min、30 ℃)培養(yǎng)7 d。吸取1 mL,再次接入到對應培養(yǎng)基中,同時增加石油濃度,在相同條件下培養(yǎng),此馴化步驟重復3次后,采用平板劃線分離法進行菌株的純化,培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基(成分:酵母粉5 g,胰蛋白胨10 g,NaCl 10.0 g,瓊脂20 g,蒸餾水1 L)。將純化好的單菌株保存于-20 ℃冰箱中。

表2 石油降解菌篩選培養(yǎng)基Table 2 Petroleum degrading bacteria screening medium

將待測菌株接種于LB液體培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基中不加瓊脂)中活化至600 nm下的吸光度(OD600)為0.9～1.0時,于10 000 r/min離心1 min收集菌體。將菌體重懸于無菌生理鹽水,按體積分數(shù)2%接種至含3 g/L石油的BSM培養(yǎng)基中,置于恒溫搖床(180 r/min、30 ℃)培養(yǎng)。以接種無菌生理鹽水為空白對照,所有處理均設置3個平行。培養(yǎng)10 d后,利用鹽酸酸化混合培養(yǎng)液,使其pH≤2,置于分液漏斗中并用正己烷重復萃取多次后進行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)。加入25 mL正己烷,用紫外分光光度計(UV-2800)測定其中的剩余石油濃度,計算石油降解率[11]。

1.3 石油降解菌的鑒定

對獲得的石油降解菌株進行16S rRNA序列鑒定。引物為27F(5’-AGAGTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-TACGGTTACCTTTTACGACTT-3’)。脫氧核糖核酸(DNA)經(jīng)純化后利用pClone007試劑盒進行克隆。測序工作由某生物技術有限公司完成,序列已提交至國家生物技術信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫并獲得登錄序列號。在Lifemap上查詢并下載相近的模式菌株16S rRNA序列,利用MEGA 7.0構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 石油降解條件優(yōu)化

參照1.2節(jié)制備菌株接種液,培養(yǎng)基組分初始條件設置與表2中BSM培養(yǎng)基條件一致,其他組分優(yōu)化條件如表3所示。在180 r/min、30 ℃條件下培養(yǎng)5 d,以接等體積的無菌生理鹽水為對照。利用紫外分光光度計測定OD600并繪制生長曲線。采用單因素實驗,即僅改變需要優(yōu)化的條件,其他條件保持不變。

表3 因素及水平Table 3 Factors and levels

1.5 高效石油降解菌的降解機理

1.5.1 菌株產(chǎn)生物表面活性劑的鑒定

采用驅(qū)油實驗對菌株進行產(chǎn)生物表面活性劑功能鑒定[12],具體如下:將待測菌株接種液按2%(體積分數(shù))接種量接入LB培養(yǎng)基中,30 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)3 d后收集上清液備用。取一個潔凈的培養(yǎng)皿,先加入20 mL蒸餾水,再加入100 μL石油,使其形成均勻油膜,加入40 μL無細胞上清液。以等體積的蒸餾水作為陰性對照,聚乙二醇辛基苯基醚(Triton-X-100)作為陽性對照。

利用6 mol/L 鹽酸將上述混合液pH調(diào)至2,置于4 ℃冷藏過夜。取出后,于10 000 r/min離心20 min,加入氯仿和甲醇混合液(體積比為1∶1)萃取。靜置15 min后取下層液體進行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā),減壓蒸餾后即得到粗的生物表面活性劑。將上述提取的生物表面活性劑用少量氯仿溶解,并按照文獻[4]的方法進行薄層分析鑒定生物表面活性劑的種類。

1.5.2 石油降解功能基因的擴增

石油降解菌功能基因引物信息見表4。

表4 本研究涉及的石油降解功能蛋白及相應基因的擴增引物Table 4 The petroleum degradation function protein and amplified primers of related gene involved in this study

2 結果與分析

2.1 石油降解菌的篩選與鑒定

本研究獲得3株石油降解率大于30%的菌株Y183、Y187和N47,石油降解率分別為35%、30%和49%。它們的16S rRNA序列與不動桿菌(Acinetobactersp.) mkj-33、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa) strain B19和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis) strain BS1的相似性大于97%(見表5)。構建系統(tǒng)發(fā)育樹(見圖1)并進行分析,將菌株Y183、Y187和N47分別命名為Acinetobactersp. Y183、假單胞菌(Pseudomonassp.) Y187和芽孢桿菌(Bacillussp.) N47。它們的16S rRNA序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中的序列號分別為Acinetobactersp. Y183(OM838406)、Pseudomonassp. Y187(OM838407)、Bacillussp. N47(OM838405)。

注:括號內(nèi)編碼為菌株的NCBI登錄序列號。圖1 系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree

表5 3株菌的石油降解率及其16S rRNA鑒定結果Table 5 Petroleum degradation rate and 16S rRNA identification results of three strains

2.2 石油降解菌的最適環(huán)境條件

利用含3 g/L石油的BSM培養(yǎng)基進行3株菌的生長曲線測定。如圖2(a)所示,菌株Y183在0～1 d處于遲緩期,1～5 d處于對數(shù)生長期,之后進入平穩(wěn)期;菌株Y187在0～7 d處于遲緩期,7～9 d處于對數(shù)生長期,之后進入平穩(wěn)期;菌株N47在0～2 d處于對數(shù)生長期,之后進入平穩(wěn)期。

圖2 3株菌生長的基本特性Fig.2 The basic physicochemical properties of three strains

對其他培養(yǎng)條件進行優(yōu)化時,采用單因素實驗。優(yōu)化溫度時其他條件如下:pH為7.2,NaCl為0.5 g/L,石油為3 g/L,氮源為3.0 g/L硝酸銨。如圖2(b)所示,菌株Y183、N47和Y187最適生長溫度均為30 ℃,與文獻[11]、[17]、[18]的研究結果一致。在低溫下,菌株Y183表現(xiàn)出良好的適應能力;溫度高于45 ℃時,3株菌均不能生長。優(yōu)化pH時其他條件如下:溫度為30 ℃,NaCl為0.5 g/L,石油為3 g/L,氮源為3.0 g/L硝酸銨。如圖2(c)所示,菌株Y183、N47和Y187生長pH范圍分別為6.0～10.0、5.0～10.0、6.0～9.0,且均在pH為8.0時生長狀況最好。優(yōu)化NaCl濃度時其他條件如下:溫度為30 ℃,pH為8.0,石油為3 g/L,氮源為3.0 g/L硝酸銨。如圖2(d)所示,菌株Y183和Y187在NaCl為0～40.0 g/L時均能生長,最佳生長NaCl為0 g/L。菌株N47在NaCl為0～100.0 g/L時均能生長,最佳生長NaCl為20.0 g/L。菌株N47較其他兩株有較好的耐鹽性,可能是由于芽孢桿菌為避免在高鹽下失水死亡,其細胞可以吸收外界氯離子和鉀離子維持細胞內(nèi)外滲透壓或者調(diào)整自身蛋白結構,形成功能蛋白,以保證酶的活性,或者通過微生物體內(nèi)自身合成有機物來調(diào)節(jié)細胞滲透壓[19-20]。

優(yōu)化石油濃度時其他條件如下:溫度為30 ℃,pH為8.0,NaCl為0 g/L(菌株Y183和Y187)或20.0 g/L(菌株N47),氮源為3.0 g/L硝酸銨。由圖3可知在1～80 g/L石油質(zhì)量濃度范圍內(nèi),3株菌均能生長。菌株Y183生長的最適石油質(zhì)量濃度為10 g/L,相應的石油降解量與微生物生長的變化趨勢一致,5 d石油最大降解量為3.231 g。菌株N47的生長隨石油濃度增長而加快。當石油質(zhì)量濃度≥30 g/L后生長進入平臺期,同時5 d石油降解量達到最大為2.149 g。菌株Y187在石油質(zhì)量濃度<10g/L時,生長較為緩慢。當石油質(zhì)量濃度增加至50 g/L時,其生長達到峰值,同時5 d石油降解量達到最大為8.987 g。表明菌株N47和Y187對高濃度石油環(huán)境具有較強的適應能力,且在高濃度石油環(huán)境中對石油具有較強的降解能力。而在低濃度石油環(huán)境中,菌株Y187生長情況欠佳。菌株N47、Y183和Y187分別在石油質(zhì)量濃度為30、10、50 g/L時生長狀況最佳,菌株Y187對于高濃度石油表現(xiàn)出較高的需求,因此在3株菌中表現(xiàn)出最大的石油降解量。而李彥辰[21]和姜義等[22]分離的芽孢桿菌、不動桿菌和假單胞菌最適生長石油質(zhì)量濃度分別為5、1.5、3.5 g/L,遠遠低于本研究結果。由此證實本研究所獲菌株在石油降解能力方面具有明顯的優(yōu)越性。

注:基于前期預試驗,根據(jù)OD600,僅對3個石油濃度下的石油降解量進行了測定;不同小寫字母表示石油降解量之間具有顯著差異(p<0.05)。圖3 石油質(zhì)量濃度對微生物生長和5 d石油降解量的影響Fig.3 Effect of petroleum mass concentration on microbial growth and petroleum degradation (5 d)

優(yōu)化氮源類型和濃度時其他條件如下:溫度為30 ℃,pH為8.0,NaCl為0 g/L(菌株Y183和Y187)或20.0 g/L(菌株N47),石油為30 g/L(菌株N47)、10 g/L(菌株Y183)或50 g/L(菌株Y187)。如圖4(a)所示,菌株Y183和Y187在5種氮源條件下,均能較好地生長。氮源對菌株Y183的適宜性表現(xiàn)為氯化銨>硝酸銨、硫酸銨、尿素>硝酸鉀。通過設置不同濃度的氯化銨,研究菌株Y183的最適生長氮源濃度,如圖4(b)所示,當氯化銨為1.0、2.0 g/L時,生長狀況最好。氮源對菌株Y187的適宜性表現(xiàn)為硫酸銨、硝酸銨>硝酸鉀>尿素>氯化銨。選擇硝酸銨作為氮源,研究菌株Y187的最適生長氮源濃度,發(fā)現(xiàn)它在低氮質(zhì)量濃度(0.5 g/L)下生長最好,隨著濃度的增大,生長出現(xiàn)下降趨勢。在5種供試氮源中,菌株N47僅對3種氮源(氯化銨、硝酸銨和硫酸銨)有較好地利用。以硝酸銨為氮源,研究菌株N47的最適生長氮源濃度,發(fā)現(xiàn)在0.5～4.0 g/L范圍內(nèi),菌株N47的生長無顯著差異。8.0 g/L時,生長受到顯著影響。文獻[11]、[17]、[23]、[24]分離出的芽孢桿菌、不動桿菌、假單胞菌其最佳生長氮源類型分別為硫酸銨、硝酸鉀或硝酸鈉。這表明多數(shù)菌株的最適生長氮源類型可能為硝酸鹽型,其原因可能是在含有石油的培養(yǎng)基中,培養(yǎng)基表面的油膜會隔絕氧氣,造成缺氧環(huán)境,而硝酸鹽在缺氧環(huán)境中有較高的還原電位,導致其容易被利用。文獻[18]也證實了富集培養(yǎng)分離出的大多數(shù)菌株對硝酸鹽的利用優(yōu)于硫酸鹽。

注:不同小寫字母表示同一菌株在不同條件培養(yǎng)下,其生長狀況具有顯著差異(p<0.05)。圖4 氮源類型及其質(zhì)量濃度對微生物生長的影響Fig.4 Effect of nitrogen source type and mass concentration on microbial growth

2.3 高效石油降解菌的表征

通過與陰性和陽性對照比較,菌株Y187所產(chǎn)生的驅(qū)油圈較大,其可能產(chǎn)生生物表面活性劑。提取生物表面活性劑后,利用薄層分析進行初步鑒定,顯色結果為紅色,表明該生物表面活性劑為脂肽類。菌株Y183和N47所產(chǎn)生的驅(qū)油圈較小,表明在該培養(yǎng)條件下其菌株不產(chǎn)生物表面活性劑或者產(chǎn)生的生物表面活性劑活性較低。

經(jīng)鑒定,菌株Y187含有苯甲酸1,2-雙加氧酶基因(benA)和環(huán)羥基化雙加氧酶基因(rhdα);菌株N47含有烷烴羥化酶(alkMb)和烷烴單加氧酶(alkB)基因;菌株Y183沒有擴增出相關的石油降解基因。通過構建氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育樹(見圖5),發(fā)現(xiàn)烷烴羥化酶和烷烴單加氧酶聚為一組,且與鈣酸不動桿菌烷烴單加氧酶(Acinetobactercalcoaceticusalkane monooxygenase)同源性均為99%;苯甲酸1,2-雙加氧酶基因與銅綠假單胞菌苯1,2-雙加氧酶基因(Pseudomonasaeruginosabenzene 1,2-dioxygenase gene)聚為一組,且同源性為100%;環(huán)羥基化雙加氧酶與銅綠假單胞菌芳香環(huán)羥基化雙加氧酶(Pseudomonasaeruginosaaromatic ring-hydroxylating dioxygenase)聚為一組,且同源性為82%。

圖5 氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree of amino acid sequences

本研究發(fā)現(xiàn)菌株Y187具有較強的石油降解能力,一方面由于它可以產(chǎn)生脂肽類生物表面活性劑,能誘導微生物的外膜變化,促進細胞與石油接觸[25];另一方面由于它含有環(huán)羥基化雙加氧酶和苯甲酸1,2-雙加氧酶基因。研究表明好氧菌對芳香族化合物的生物降解主要由環(huán)羥基化雙加氧酶催化芳香環(huán)的二羥基化引發(fā),雙加氧酶可以從還原型輔酶Ⅰ(NADH)轉(zhuǎn)移兩個電子以激活活性位點中的氧原子并生成二羥基產(chǎn)物[26]。苯甲酸1,2-雙加氧酶是大多數(shù)芳烴化合物微生物降解的中間產(chǎn)物苯甲酸代謝過程中較為常見的酶,它能將苯甲酸降解為中間產(chǎn)物兒萘酚,最終降解為水和二氧化碳。菌株N47的石油降解能力較菌株Y187弱,主要由于菌株N47沒有顯著的產(chǎn)生物表面活性劑能力。菌株Y183在本實驗條件下既沒有檢測到產(chǎn)生物表面活性劑的能力也沒有擴增出相關石油降解基因,可能是因為該菌株具有其他的石油降解途徑。

3 結 論

本研究獲得3株石油降解率大于30%的菌株Y183、Y187和N47,其最適生長溫度均為30 ℃,最適pH均為8.0,最適NaCl分別為0、0、20.0 g/L,最適生長石油質(zhì)量濃度分別為10、50、30 g/L,最適生長氮源類型及質(zhì)量濃度分別為1.0～2.0 g/L氯化銨、0.5 g/L硝酸銨和0.5～4.0 g/L硝酸銨。菌株Y187能通過產(chǎn)生脂肽類生物表面活性劑提高對石油的攝取,并在細胞內(nèi)通過環(huán)羥基化雙加氧酶基因和苯甲酸1,2-雙加氧酶基因調(diào)控相關石油降解酶的合成來降解石油。菌株N47主要通過烷烴單加氧酶基因和烷烴羥化酶基因來調(diào)控石油中烷烴的降解。菌株Y183可能存在其他石油降解機制。本研究加強了對高效石油降解菌的認知,可為石油污染土壤的修復提供重要的菌株資源。