呂博文，馬永貴，2，3，李國剛，2，3，郝玉馨，趙建芝，馬玉梅，賀玉姣，2，3

（1.青海師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，西寧，810008；2.青海省青藏高原藥用動植物資源重點實驗室，西寧，810008；3.高原科學(xué)與可持續(xù)發(fā)展研究院，西寧，810008）

青藏高原素有“地球第三極”之稱，因低溫、低氧和強紫外線輻射等獨特的環(huán)境，而具有豐富且珍貴的生物資源。白腰雪雀（Onychostruthus taczanowskii）屬雀形目（Passeriformes）雀科（Passeridae），是我國青藏高原特有鳥類［1］，通常棲息在海拔3 000～4 500 m的高山、草甸及荒漠地帶［2］，作為世代生活于高原的留鳥，白腰雪雀經(jīng)過漫長的進(jìn)化，已經(jīng)能夠很好地適應(yīng)高原極端環(huán)境，并形成了獨特的高原適應(yīng)生理機制［3］。

線粒體是細(xì)胞內(nèi)具有兩層膜結(jié)構(gòu)的半自主細(xì)胞器，其內(nèi)膜上的呼吸鏈復(fù)合體通過與氧化磷酸化偶聯(lián)，消耗了細(xì)胞內(nèi)約90%的O2，產(chǎn)生三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP），在維持生物機體體溫恒定的同時，為生物體的各項生命活動提供動力［4］。胸肌在鳥類機體中是占比最大的肌肉群［5］，不僅為鳥類飛行與覓食提供動力，也在體溫調(diào)節(jié)方面扮演著重要角色［6-10］，鳥類胸肌在機體產(chǎn)熱能力方面起著顯著作用，胸肌線粒體的結(jié)構(gòu)和大小對鳥類產(chǎn)熱能力有明顯影響［11-12］。另有研究表明［13-14］，生活在高原的動物由于長期對高海拔環(huán)境的適應(yīng)，心臟在結(jié)構(gòu)上發(fā)生了一定改變。心臟是全身組織氧供應(yīng)的動力中心，與胸肌工作模式不同，能量代謝以有氧代謝為主，心臟功能的強弱及心肌細(xì)胞獲氧效率的高低，與心肌線粒體關(guān)系密切［15］。心肌細(xì)胞中線粒體的數(shù)量、功能和結(jié)構(gòu)決定了心臟的能量供應(yīng)，心肌線粒體對于機體低氧適應(yīng)有不可替代的作用［16-17］。

既有的關(guān)于鳥類高原適應(yīng)性研究主要集中于鳥類體內(nèi)運氧機制的探討，而在亞細(xì)胞水平上關(guān)于鳥類對高原環(huán)境的適應(yīng)機制和對氧氣利用的研究較少。本研究利用顯微體視學(xué)技術(shù)和分光光度法，通過比較不同高海拔地區(qū)白腰雪雀與低海拔地區(qū)麻雀（Passer montanus）胸肌與心肌組織線粒體的形態(tài)特征和線粒體呼吸鏈上4 個復(fù)合體酶的活性，研究白腰雪雀在高原環(huán)境中胸肌和心肌組織在結(jié)構(gòu)與功能上的適應(yīng)性變化，以期為解析鳥類高海拔適應(yīng)機制，理解脊椎動物高原適應(yīng)性演化和預(yù)防人類高原疾病提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 動物

白腰雪雀分別于青海省果洛藏族自治州（下稱“果洛地區(qū)”）和青海省海北藏族自治州（下稱“海北地區(qū)”）捕獲，麻雀于陜西省榆林市（下稱“榆林地區(qū)”）捕獲，后處以安樂死并解剖，解剖后獲得組織，相關(guān)信息詳見表1。本研究已取得相關(guān)管理部門許可，符合動物倫理要求，取樣時間為2021年7月。

表1 樣本采樣信息Tab.1 Information on sampling sites

1.2 方法

1.2.1 胸肌線粒體形態(tài)學(xué)參數(shù)測定

按照采樣地區(qū)將樣品分為3組，每組動物取4只制作組織切片后進(jìn)行電鏡檢測，具體方法：于動物前胸和心臟處取1 mm×1 mm×1 mm 的肌肉組織，取材時避開血管、脂肪組織。將取好的肌肉組織立即置入2.5%戊二醛電鏡固定液，4 ℃固定24 h，而后使用1%鋨酸二次固定，經(jīng)丙酮脫水處理后包埋。從每組包埋塊中選取2個，用超薄切片機（LKB-2188，瑞典）行70 nm 超薄切片后，使用醋酸鈾和枸櫞酸鉛對切片雙重染色。使用透射電鏡（JEM-2000EX，日本）觀察染色后的切片。每個肌肉包埋塊隨機拍攝10 個視野（7 500×），避開血管等組織。

參照鄭富盛［18］的方法，使用方格測量系統(tǒng)對細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行定量描述，以點分析法測量線粒體面數(shù)密度（numerical density on area，NA）、體密度（volume density，VV）、面密度（surface density，SV）、平均截面面積（mean section area，MS）和比表面（specific surface，δ），相關(guān)數(shù)據(jù)用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)測量。胸肌和心肌組織線粒體數(shù)目測量時，對于邊緣不完整的線粒體，以計左不計右、計上不計下的原則計數(shù)。

1.2.2 線粒體呼吸鏈復(fù)合體酶活性測定

線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ活性的檢測按照CheKine?線粒體呼吸鏈復(fù)合體活性檢測試劑盒（Cat#：KTB1850、KTB1860、KTB1870、KTB1880）說明書進(jìn)行。復(fù)合體Ⅰ活性以每毫克組織蛋白每分鐘消耗煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的量（μmol）表示；復(fù)合體Ⅱ活性以每毫克組織蛋白每分鐘消耗2，6-二氯吲哚酚的量（μmol）表示；復(fù)合體Ⅲ活性以每毫克組織蛋白每分鐘消耗還原型泛醌的量（μmol）表示；復(fù)合體Ⅳ活性以每毫克組織蛋白每分鐘消耗還原型細(xì)胞色素C的量（μmol）表示［19］。計算公式如下：

式中：W為樣本鮮質(zhì)量（g）；ΔA1為提取胞漿上清液反應(yīng)前后吸光值差值；ΔA2為提取線粒體反應(yīng)前后吸光值差值。

1.2.3 統(tǒng)計分析

使用IBM SPSS Statistics 26 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用Shapiro-Wilk 檢驗所用數(shù)據(jù)的正態(tài)性，用oneway ANOVA 進(jìn)行方差分析，采用Duncan’s test 進(jìn)行多重比較，使用GraphPad Prism 9.4制圖。

2 結(jié)果

2.1 胸肌與心肌組織線粒體超微結(jié)構(gòu)

透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，果洛地區(qū)和海北地區(qū)白腰雪雀胸肌與心肌組織線粒體多呈顆粒狀，線粒體嵴密集，分布均勻，線粒體膜完整（圖1A、B、D、E）。榆林地區(qū)麻雀胸肌與心肌組織線粒體多呈圓狀，截面積大，線粒體膜完整（圖1C、F）。

圖1 白腰雪雀、麻雀胸肌組織和心肌組織線粒體透射電鏡結(jié)果Fig.1 Transmission electron microscopy of the mitochondria in Onychostruthus taczanowskii（Guoluo）， O.taczanowskii （Haibei）and Passer montanus （Yulin）

2.2 胸肌組織線粒體形態(tài)參數(shù)

白腰雪雀和麻雀的胸肌組織線粒體形態(tài)參數(shù)測定結(jié)果如圖2 所示。較高海拔的果洛地區(qū)白腰雪雀胸肌組織線粒體的NA、VV、SV、Ms 和δ均大于較低海拔的海北地區(qū)，其中NA（p＜0.01）、VV（p＜0.001）、SV（p＜0.01）和δ（p＜0.05）具有顯著差異，而MS無顯著差異。白腰雪雀胸肌組織線粒體的NA、SV和δ均大于麻雀，其中白腰雪雀的δ（p＜0.000 1）、NA（果洛地區(qū)p＜0.001）和SV（果洛地區(qū)p＜0.01）具有顯著差異；白腰雪雀的Ms 極顯著低于麻雀（p＜0.000 1）；麻雀的VV顯著高于海北地區(qū)的白腰雪雀（p＜0.001），與果洛地區(qū)白腰雪雀數(shù)值相近。

圖2 果洛地區(qū)、海北地區(qū)白腰雪雀及榆林地區(qū)麻雀胸肌組織線粒體形態(tài)參數(shù)Fig.2 The comparison of parameters about pectoral mitochondria in Onychostruthus taczanowskii（Guoluo）， O.taczanowskii （Haibei）and Passer montanus （Yulin）

白腰雪雀和麻雀的心肌組織線粒體形態(tài)參數(shù)測定結(jié)果如圖3 所示。果洛地區(qū)白腰雪雀心肌組織線粒體的NA、VV、SV、MS和δ均大于海北地區(qū)，其中VV（p＜0.01）、SV（p＜0.05）和δ（p＜0.05）具有顯著差異，而NA和MS無顯著差異。白腰雪雀心肌組織線粒體的NA（果洛地區(qū)p＜0.01、海北地區(qū)p＜0.05）和δ（p＜0.000 1）均顯著大于麻雀；白腰雪雀的MS（p＜0.000 1）和VV（果洛地區(qū)p＜0.05、海北地區(qū)p＜0.000 1）顯著低于麻雀；麻雀的SV高于海北地區(qū)的白腰雪雀，與果洛地區(qū)的數(shù)值相近，均無顯著性差異。

圖3 果洛地區(qū)、海北地區(qū)白腰雪雀及榆林地區(qū)麻雀心肌組織線粒體形態(tài)參數(shù)Fig.3 The comparison of parameters about myocardial mitochondria in Onychostruthus taczanowskii（Guoluo）， O.taczanowskii （Haibei）and Passer montanus （Yulin）

2.3 線粒體呼吸鏈復(fù)合體酶活性

白腰雪雀和麻雀的胸肌組織線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ～Ⅳ酶活性結(jié)果如圖4 所示。果洛地區(qū)白腰雪雀胸肌線粒體的4 個復(fù)合體酶活性均大于海北地區(qū)，其中復(fù)合體Ⅰ（p＜0.01）和復(fù)合體Ⅱ（p＜0.000 1）具有顯著差異，而復(fù)合體Ⅲ和復(fù)合體Ⅳ無顯著性差異。與麻雀相比，白腰雪雀胸肌線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ（果洛地區(qū)p＜0.01）、復(fù)合體Ⅱ（果洛地區(qū)p＜0.000 1，海北地區(qū)p＜0.01）、復(fù)合體Ⅲ（p＜0.001）和復(fù)合體Ⅳ（p＜0.000 1）的酶活性均顯著升高。

圖4 果洛地區(qū)、海北地區(qū)白腰雪雀及榆林地區(qū)麻雀胸肌組織線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ活性Fig.4 The comparison of activities about pectoral mitochondrial respiratory chain complex Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ and Ⅳ in Onychostruthus taczanowskii（Guoluo），O.taczanowskii （Haibei）and Passer montanus （Yulin）

白腰雪雀和麻雀的心肌組織線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ～Ⅳ酶活性結(jié)果如圖5 所示。果洛地區(qū)白腰雪雀心肌線粒體的4 個復(fù)合體活性均大于海北地區(qū)，復(fù)合體Ⅰ（p＜0.000 1）、復(fù)合體Ⅱ（p＜0.01）、復(fù)合體Ⅲ（p＜0.001）和復(fù)合體Ⅳ（p＜0.000 1）均具有顯著差異。與麻雀相比，白腰雪雀心肌線粒體復(fù)合體Ⅰ（果洛地區(qū)p＜0.000 1）、復(fù)合體Ⅱ（果洛地區(qū)p＜0.000 1，海北地區(qū)p＜0.01）、復(fù)合體Ⅲ（果洛地區(qū)p＜0.000 1，海北地區(qū)p＜0.001）和復(fù)合體Ⅳ（果洛地區(qū)p＜0.000 1，海北地區(qū)p＜0.01）的酶活性均顯著升高。

圖5 果洛地區(qū)、海北地區(qū)白腰雪雀及榆林地區(qū)麻雀心肌組織線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ活性Fig.5 The comparison of activities about myocardial mitochondrial respiratory chain complex Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ and Ⅳ in Onychostruthus taczanowskii（Guoluo），O.taczanowskii （Haibei）and Passer montanus （Yulin）

3 討論

線粒體是細(xì)胞內(nèi)的氧濃度感受器，是氧氣在體內(nèi)的最終受體，它利用氧氣為細(xì)胞的各項生命活動提供能量并維持機體的體溫恒定。本研究通過電鏡觀察后發(fā)現(xiàn)，與低海拔麻雀相比，白腰雪雀胸肌和心肌組織線粒體的MS顯著減小，與陳付菊等［19］研究的短時低氧脅迫導(dǎo)致青海湖裸鯉（Gymnocypris przewalskii）肌肉線粒體增大的結(jié)果不一致，而張勤文等［20］在對牦牛（Bos grunniens）低氧適應(yīng)性研究中發(fā)現(xiàn)，牦牛骨骼肌線粒體的MS顯著小于平原黃牛（B.taurus），與本研究結(jié)論一致。推測結(jié)論差異的原因是線粒體對于短時低氧的應(yīng)激反應(yīng)和已經(jīng)產(chǎn)生遺傳效應(yīng)的世代低氧適應(yīng)機制不同。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，海北地區(qū)白腰雪雀胸肌和心肌組織線粒體的NA顯著大于麻雀，而VV則顯著小于麻雀，推測白腰雪雀可能通過增加細(xì)胞內(nèi)線粒體的數(shù)量、減小單位線粒體的體積，從而增加了線粒體與胞內(nèi)氧氣接觸的機會，使線粒體更充分地利用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的O2，產(chǎn)生更多數(shù)量的ATP，這一推測在張勤文等［20-21］的研究中得到支持。由于白腰雪雀是短距離垂直飛行和降落的留鳥，沒有長距離的遷徙活動，對飛行能量需求相對較少，而胸肌中線粒體數(shù)量及比表面的增加，可能是為了產(chǎn)生足夠的熱量，應(yīng)對高原環(huán)境帶來的低溫挑戰(zhàn)。

不同海拔白腰雪雀的胸肌和心肌組織線粒體形態(tài)研究表明，生活于4 200 m 的白腰雪雀，VV、SV和δ均顯著大于3 102 m 的白腰雪雀，NA也有以上關(guān)系，但只在胸肌組織的線粒體中具有顯著差異，這與Widmer 等［22］和Costa 等［23］的研究結(jié)果一致。這種形態(tài)變化可能一方面使生活在更高海拔的白腰雪雀組織線粒體的膜具有更大的向外擴張程度，與外界接觸面積更大，另一方面縮短了體內(nèi)組織中氧的彌散距離，進(jìn)而提高線粒體對氧的攝取和利用效率［18，24］。

線粒體內(nèi)膜上附著大量參與能量代謝的酶。高原動物可以通過優(yōu)化呼吸鏈上的反應(yīng)體系，提高呼吸鏈作用效率的方式來應(yīng)對高原惡劣環(huán)境的脅迫［25］。本研究分析2 個地區(qū)的白腰雪雀胸肌和心肌組織線粒體相關(guān)酶活性參數(shù)發(fā)現(xiàn)，生活在4 200 m 的白腰雪雀線粒體呼吸鏈上4 個復(fù)合體的酶活性較生活在3 102 m 的白腰雪雀均有不同程度的升高，這與陳付菊等［19，26］的結(jié)論一致。同時，本研究亦對比了白腰雪雀與麻雀的相關(guān)差異，發(fā)現(xiàn)白腰雪雀胸肌和心肌組織線粒體上4 個復(fù)合體的酶活性均大于麻雀對應(yīng)的復(fù)合體，且除胸肌復(fù)合體Ⅰ外，其余均達(dá)顯著水平，這與尹松月［27］發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生低氧適應(yīng)的果蠅（Drosophila）胸肌線粒體呼吸鏈復(fù)合體的酶活性高于正常果蠅的結(jié)論一致。通過比對已公布的白腰雪雀與低海拔麻雀的線粒體基因組（NC_025914.1，NC_024821.1），發(fā)現(xiàn)二者與線粒體呼吸鏈復(fù)合體相關(guān)基因存在較多非同義突變，這可能是促使白腰雪雀線粒體4個復(fù)合體活性升高的原因之一。

4 結(jié)論

在高原低溫、低氧環(huán)境下，白腰雪雀可通過減小胸肌和心肌組織線粒體體積，增加線粒體的數(shù)量和膜利用率，同時提高線粒體呼吸鏈上4 個復(fù)合體酶活性的方式，使白腰雪雀在高原惡劣環(huán)境中能產(chǎn)生足夠能量，保障機體的各項生理活動，維持體溫恒定，從而在青藏高原得以持續(xù)地生存和繁衍。