徐宏山，黃艷秋，劉欣玉，賈麗麗，李玉華

中國食品藥品檢定研究院，北京 102629

自1937 年至今，黃熱減毒活疫苗生產廠家一直采用雞胚卵黃囊接種制備黃熱減毒活疫苗［1］。原代雞胚細胞已用于制備腮腺炎、麻疹、麻疹風疹聯(lián)合減毒活疫苗（measles and rubella combined vaccine，MR）、麻腮風聯(lián)合減毒活疫苗（measles，mumps and rubella combined vaccine，MMR）等多種減毒活疫苗，但至今尚無黃熱疫苗產品上市使用。用雞胚細胞較雞胚卵黃囊制備疫苗在質量控制上具有明顯優(yōu)勢。

本研究采用原代雞胚細胞成功篩選黃熱減毒活疫苗YF17D-204 原代雞胚細胞適應株，并建立了三級毒種庫。采用新一代高通量RNA 測序技術對三級毒種庫進行全基因組測序，應用生物學軟件進行基因組系統(tǒng)化分析。

1 材料與方法

1.1 病毒及雞胚 黃熱減毒活疫苗YF17D-204 毒株由北京天壇生物制品股份有限公司提供；9 ～10日齡SPF 雞胚購自北京勃林格殷格翰維通生物技術有限公司。

1.2 主要試劑及儀器 DMEM 培養(yǎng)基、PBS 緩沖液購自美國Gibco 公司；病毒基因組DNA/RNA 提取試劑盒購自中國TIANGEN 公司；穩(wěn)定劑（終濃度為20%人血白蛋白）購自成都蓉生藥業(yè)有限責任公司；超微量分光光度計（IMPLEN Nano Photometer?N60）購自北京德全興業(yè)商貿有限公司。

1.3 YF17D-204（雞胚細胞）三級毒種庫制備 用（1.0 ～1.5）×106個/mL濃度的雞胚細胞接種細胞培養(yǎng)瓶，37 ℃培養(yǎng)24 h；按照0.000 48 MOI 接種YF17D-204，37 ℃培養(yǎng)2 d；洗滌去除胎牛血清，更換無血清DMEM維持液，3 d后收獲病毒液，加入穩(wěn)定劑后分裝，-70 ℃以下凍存。按照上述過程依次制備YF17D-204（雞胚細胞）（簡稱YFV17D-CEC）原代種子批、主代種子批、工作種子批三級毒種庫。采用噬斑形成法對三級毒種庫進行病毒滴度測定［2］。

1.4 YFV17D-CEC 病毒基因組RNA 提取及濃度檢測 按照病毒基因組DNA/RNA 提取試劑盒說明書，提取各種子批RNA，采用超微量分光光度計（IMPLEN Nano Photometer?N60）進行濃度檢測。

1.5 高通量RNA測序

由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。具體操作如下：將總RNA 中的DNA 消化后分離并純化RNA，在一定條件下將RNA 打斷，反轉錄合成cDNA后進行末端修復，在修復產物的3'端加上A 堿基后再與接頭進行連接，對連接產物進行膠回收純化，經質量和產量檢測合格后于Illumina/Solexa測序平臺進行測序。測序數據分析步驟及方法如下。

1.5.1 數據評估及質控 對測序的原始數據通過FastQC 進行質量評估；通過Trimmomatic 對Illumina測序數據進行質量剪切，得到相對準確的有效數據。

1.5.2 基因組拼接 用SPAdes拼接二代測序數據，采用GapFiller對拼接得到的contig補GAP；采用PrInSeSG進行序列矯正，修正拼接過程中的剪輯錯誤及小片段的插入缺失。

1.5.3 基因組分分析 采用Prokka 預測基因元件（基因、tRNA、RNA 等）；采用RepeatMasker 鑒定基因組上的重復序列；采用CRT進行CRISPR預測分析。

1.5.4 基因注釋 采用NCBI Blast+將基因蛋白序列與CDD、KOG、COG、NR、NT、PFAM、Swissprot、TrEMBL等多個數據庫進行比對，得到其功能注釋信息；根據基因與Swissprot、TrEMBL 的注釋結果得到GO 功能注釋信息；采用KAAS 得到基因KEGG 注釋信息；采用NCBI Blast+將基因蛋白序列與VFDB、CARD、PHIbase等多個數據庫進行比對，得到其功能注釋信息。

1.5.5 基因組高級注釋 采用NCBI Blast+將基因蛋白序列與VFDB、CARD、PHI-base等多個數據庫進行比對，得到其功能注釋信息；采用HMMER3 將基因蛋白序列與CAZy數據庫進行比對，得到其功能注釋信息；采用TMHMM 進行跨膜蛋白預測分析，SignalP進行信號肽預測分析，LipoP 進行脂蛋白預測分析。利用ProtCamp進行蛋白亞細胞定位分析。

1.5.6 序列比對分析 采用NCBI Blast+和MegAlign軟件，對YFV17D-CEC 三級毒種全基因組序列進行比對分析。

1.5.7 單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorp

hysism，SNP）分析 采用Illumina 公司的BeadXpress系統(tǒng)進行批量SNP 位點檢測，預測YF17D-204 SNP位點。

2 結果

2.1 YFV17D-CEC 三級毒種庫鑒定 YFV17D-CEC原代種子批、主代種子批、工作種子批病毒滴度分別為6.09、6.27、6.18 lgPFU/mL。

2.2 YFV17D-CEC病毒基因組RNA濃度 YFV17DCEC原代種子批、主代種子批、工作種子批提取的RNA濃度分別為234.2、265.3、258.9 ng/μL，RNA 濃度均能夠達到高通量RNA序列測定的要求。

2.3 高通量RNA測序結果

2.3.1 基因組拼接 獲得YFV17D-CEC 全基因組序列，基因組大小為10 862 bp，GC含量為49.71%。

2.3.2 基因元件預測 YFV17D-CEC基因組從119 ～10 354 位（10 236 bp）為1 個開放閱讀框，編碼3 411個氨基酸。黃熱病毒基因組為具有tRNA、rRNA 多重功能的單股正鏈RNA。全基因組編碼率為94.24%。該基因組無重復序列。與GenBank 中登錄的黃熱疫苗生產毒株YFV17D-204（KF769015.1）和YF/Vaccine/USA/Sanofi-Pasteur-17D-204/UF795AA/YFVax（JX503529.1）一致。見圖1和表1。

表1 基因元件預測統(tǒng)計Tab.1 Predictive statistics of gene elements

圖1 YFV17D-CEC基因元件長度分布圖Fig.1 Length distribution of YFV17D-CEC gene elements

2.3.3 基因功能注釋分類 根據測得的黃熱病毒基因序列與Swissprot、TrEMBL2 的注釋結果得到GO 功能注釋信息，見圖2和表2。

表2 YFV17D-CEC基因組GO分類注釋信息Tab.2 GO classification annotation information of YFV17D-CEC genome

圖2 基因功能分類GO注釋分布圖Fig.2 GO annotation distribution map of gene function classification

2.3.4 YFV17D-CEC 三級毒種庫序列比對分析 與YFV17D RI（JN628279.1）、YFV17D-204（KF769015.1）、YF/Vaccine/USA/Sanofi-Pasteur-17D-204/UF7-95-AA/YFVax（JX503529.1）同源性均為100%，三級毒種庫之間未發(fā)生突變。

2.3.5 SNP 分析 對YFV17D-CEC 三級毒種庫進行批量SNP位點檢測，匯總YFV17D-CEC序列并與Yellow fever virus17D/Tiantan 序列（FJ654700.1）比較，結果顯示，黃熱病毒基因編碼區(qū)共16 個多態(tài)性位點，囊膜蛋白（E 蛋白）基因的SNP 位點較多，共5個，其中有2 個異義突變，3 個同義突變。NS1 蛋白基因有1個異義突變。E 蛋白介導病毒侵入宿主細胞，是主要的保護性抗原和中和抗體靶點；非結構蛋白NS1 是病毒重要的糖蛋白，在病毒感染、復制、病理及免疫逃逸過程中起重要作用。這些位點的堿基替換可能導致抗原表位特異性改變，可能是黃熱病毒毒力和免疫原性相關的關鍵位點。見表3。

表3 YFV17D-CEC基因組SNP分析Tab.3 SNP analysis of YFV17D-CEC genome

3 討論

本研究用黃熱減毒活疫苗YF17D-204 毒株在原代雞胚細胞上進行適應性培養(yǎng)，篩選獲得了黃熱減毒活疫苗雞胚細胞適應株YFV17D-CEC，并建立了三級毒種庫，采用高通量RNA 測序技術，對其進行了病毒全基因組序列測定，并采用相關生物信息學分析軟件對測序獲得的序列進行了深入分析。高通量RNA測序技術較傳統(tǒng)的一代測序技術在很多方面具有更大優(yōu)勢，其所用試劑成本低，測得序列長，分析技術成熟，從而獲得廣泛應用，成為越來越普遍的研究工具。本研究結果準確可靠，能反映病毒RNA的全部信息，不僅可用于定性，而且對探討病毒演變流行毒株的地理來源、遺傳變異和抗原漂移等也具有重大幫助［3-4］。

本研究對YFV17D-CEC 三級毒種庫進行的高通量RNA測序結果顯示，測得基因組全長10 862 bp，與李靜等［5］研究的全基因組序列大小一致。119 ～10 354 位（10 236 bp）為1 個開放閱讀框，編碼3 412個氨基酸。黃熱病毒基因組為具有tRNA、rRNA 多重功能的單股正鏈RNA，全基因組編碼率為94.24%，基因組無重復序列。

通過GO 分析比以往能更深入地了解黃熱病毒基因組編碼的蛋白在細胞成分、分子功能、生化過程3 大方面的基因本體功能。這些蛋白在病毒基因組復制、ATP結合轉錄調控、依賴于DNA衣殼病毒通過網格蛋白介導的內吞作用進入宿主細胞、RNA 介導的RNA 聚合酶活性、雙鏈RNA 結合、RNA（鳥嘌呤-N7）-甲基化、ATP 依賴性解旋酶活性、mRNA（核苷-2'-O-）-甲基轉移酶活性、病毒誘導宿主自噬、mRNA（鳥嘌呤-N7-）-甲基轉移酶活性、絲氨酸型外肽酶活性、膜的組成部分、病毒與宿主細胞的黏附、絲氨酸型內肽酶活性、依賴于DNA 的RNA 解旋酶活性轉錄、金屬離子結合、蛋白質水解、病毒抑制宿主I型干擾素介導的信號通路、病毒膜病毒包膜結構分子活性、宿主細胞內質網等方面發(fā)揮了多重作用。

YFV17D-CEC 三級毒種庫序列序列比對分析結果顯示，與YF/Vaccine/USA/Sanofi-Pasteur-17D-204/UF795AA/YFVax（JX503529.1）、YFV17D204（KF76-9015.1）、YFV17D RKI（JN628279.1）同源性均為100%，三級毒種庫間未發(fā)生突變。表明YFV17D-CEC 在原代雞胚細胞上傳代具有較好的遺傳穩(wěn)定性。與麻疹病毒疫苗株、非復制型痘苗重組病毒等在原代雞胚細胞上傳代具有良好的穩(wěn)定性一致［6-9］。

在RNA 病毒疫苗的研發(fā)和生產中，毒株遺傳穩(wěn)定性檢測十分重要。黃熱疫苗存在疫苗相關的嗜內臟性和神經毒力等不良反應［10-12］。最近有研究表明，黃熱減毒活疫苗的嗜內臟性和神經毒力與疫苗中病毒的群體多樣性有關，疫苗YF17D 的多樣性顯著低于親本毒株Asabi 株。YF17D 低群體多樣性更有利于疫苗的安全性［13-15］。SNP 具有位點豐富、分布廣泛、遺傳穩(wěn)定性高、易于快速高通量進行基因分型等特點。通過SNP 分析，可用于鑒別疫苗株和野毒株以及分析病毒傳播力和致病性等研究［16-20］。本研究分析了YFV17D-CEC 全基因組基因的多態(tài)性位點，這些位點的堿基替換可能導致毒力和抗原表位特異性改變，如E基因區(qū)位點是黃熱病毒毒力和免疫原性相關的關鍵位點，NS3基因與絲氨酸蛋白酶、解旋酶和NTP三磷酸酶活性相關。BECK等［15］研究顯示，黃熱疫苗在使用時的基因組穩(wěn)定性由種子批次系統(tǒng)穩(wěn)定性維持。對減毒病毒的分析提高了對疫苗減毒分子基礎的理解，并提供了有關活疫苗安全性、穩(wěn)定性、免疫原性和毒力回復突變風險的關鍵信息。因此，應對YFV17D-CEC 毒種在基因組層面進行質量控制并深入研究，建立相應的質量控制標準。多態(tài)性位點分析為疫苗毒種庫質量控制和不良反應的深入研究提供了實驗數據。

綜上所述，本研究成功建立了原代雞胚細胞上遺傳穩(wěn)定性良好的黃熱減毒活疫苗（雞胚細胞株）三級毒種庫，并利用高通量RNA 測序技術快速檢測毒種庫全基因組信息，可對黃熱減毒活疫苗毒種庫進行基因水平的質量控制。